劉昌霖 周國英 肖 柏 劉君昂

(南方人工林病蟲害防治國家林業(yè)和草原局重點實驗室 森林有害生物防控湖南省重點實驗室經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點實驗室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長沙 410004)

降香黃檀(Dalbergiaodorifera)俗稱香紅木、黃花梨，屬豆科(Leguminosae)蝶形花亞科(Papilionoideae)黃檀屬(Dalbergia)半落葉喬木，是國家二級保護(hù)植物(吳國欣，2009)、海南省特有珍貴紅木樹種。降香黃檀木材質(zhì)地堅硬沉重，紋理細(xì)密，花紋美觀，永不開裂、變形，堅固耐腐，是高檔家具上等用材；木材還含有芳香油，含芳香物高的心材可入藥代替降香，以心材蒸餾得到的降香油，氣味清香，久不揮發(fā)，是香料的定香劑，也是高級鎮(zhèn)痛藥材，具有抗血凝、氧化、擴(kuò)冠脈等作用。降香黃檀這些重要的經(jīng)濟(jì)價值和藥用價值，導(dǎo)致其長期遭受盜伐和過度砍伐，天然林資源現(xiàn)已殘存不多，生產(chǎn)力嚴(yán)重下降(Taoetal.，2010)。近年來，在我國南方一些氣候適宜的地區(qū)如廣東、廣西、云南、福建等，正在不斷嘗試營造降香黃檀人工林，對其苗木栽培技術(shù)進(jìn)行了大量研究(邱治軍等，2004；何明軍等，2008；李太釗，2017；高媛，2017)。降香黃檀純林抗病蟲害、寒害、風(fēng)害等自然災(zāi)害的能力極弱(李鐵牛等，2001)，人工栽培過程中在樹種搭配、良種選育和人工促進(jìn)心材形成等方面存在一些亟待解決的科學(xué)問題(Yuetal.,2007；伍慶均，2014；黃星，2012)。

心材是由邊材通過一系列復(fù)雜的生理生化過程轉(zhuǎn)化而來的(Chaffey, 2002),除了受本身遺傳信息調(diào)控外，還受外界環(huán)境的影響，特別是微生物的干擾(崔之益等，2016)。有些植物心材是由單一類型的微生物入侵而產(chǎn)生的，而有些植物心材則是幾種微生物共同入侵作用的結(jié)果(Sorzetal.，2008)。植物內(nèi)生菌是指在某一階段或整個生命周期生活在健康生長的植物組織或細(xì)胞內(nèi)，并對寄主植物不會引起明顯病害癥狀的一類微生物群(Saikkonenetal., 2004)。外界微生物的入侵也能成為降香黃檀的內(nèi)生真菌，降香黃檀具有豐富的內(nèi)生真菌。同時，外源性真菌能夠有效促進(jìn)降香黃檀木材心材的形成，而降香黃檀內(nèi)生菌對心材形成的影響卻少有報道。如Sun等(2015)從降香黃檀受傷和健康的莖中分離出多種內(nèi)生真菌，在木材導(dǎo)管內(nèi)觀察到了菌絲定殖；周雙清等(2014)利用從已結(jié)心材的降香黃檀上鉆取的心材粉末內(nèi)生菌系培養(yǎng)液，且促進(jìn)降香黃檀心材的形成。

鑒于此，本研究根據(jù)試驗樣地實際情況，選擇樹齡相同、立地條件基本一致的降香黃檀，采用HiSeq高通量測序技術(shù)，結(jié)合木材理化性質(zhì)，對其心材和邊材內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究，并分析其與降香黃檀內(nèi)環(huán)境因子的關(guān)系，以期為降香黃檀內(nèi)生真菌評價和資源利用提供依據(jù)，為指導(dǎo)降香黃檀人工促進(jìn)心材形成提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樣品采樣地位于海南省瓊海市市郊。因樣品特殊性和國家法律法規(guī)等原因，選擇立地條件基本一致[土壤類型為砂紅壤，主要混交樹種有小葉欖仁(Terminalianeotaliala)、母生(Homaliumhainanense)、沉香(Aquilariasinensis)等]、樹齡相同(均為15年)、胸徑相近、自然形成心材的降香黃檀(樹干25 cm以上部分被砍伐5天左右，留下部位長有嫩葉的枝條)。去除頂部5 cm木材組織，在每株降香黃檀地上15 cm處取樹干(降香黃檀心材和邊材以下分別簡寫為JXHW和JXSW)。

在無菌條件下，將木材切成約1 cm×0.5 cm×0.5 cm大小。取5 g木片在0.9%NaCl中搖瓶培養(yǎng)2 h(25 ℃)，釋放內(nèi)生菌。用0.22 μm濾膜真空抽濾，所得濾膜-20 ℃儲存?zhèn)溆?其余樣品儲存在-80 ℃低溫冰箱中(林文雄等，2009)。

1.2 試驗方法

1.2.1 木材含水率測定 參考GB/T1931—2009，將試樣置于(103±2)℃烘箱中干燥，根據(jù)下式計算木材含水率：木材含水率(%)=(W0-W1)/W1×100,式中W0和W1分別為干燥前、后試樣質(zhì)量。

1.2.2 pH測定 將試樣破碎后置于通風(fēng)良好、無酸堿氣體的室內(nèi)氣干，均勻混合后取約200 g，用植物原料粉碎機(jī)全部制成通過40目篩的木粉，置于廣口瓶中備用。稱取木粉3 g(精確至0.01 g)，置于50 mL燒杯內(nèi)，加入新煮沸并冷卻至室溫的蒸餾水30 mL，攪拌5 min，放置15 min后再攪拌5 min，靜置5 min測定pH，精確至0.02。

1.2.3 灰分含量測定 精確稱取3 g木粉，置于預(yù)先灼燒的坩堝中，先將坩堝放在電爐上燒灼使木粉炭化：然后將坩堝置于高溫爐中，在(575±25)℃下灼燒至恒質(zhì)量為止(無黑色炭素)?；曳趾坑嬎愎饺缦拢?/p>

(1)

式中：G0為灰渣質(zhì)量(g)；G1為干試樣質(zhì)量(g)；W為試樣含水率(%)。

1.2.4 熱水抽提物含量測定 精確稱取2 g樣品，另外稱取1份測定試樣含水率；將試樣小心移入250 mL錐形瓶中，加入200 mL 95～100 ℃的蒸餾水進(jìn)行熱水提取，將裝有物料的濾器放入烘箱中，在(105±3)℃下干燥至恒質(zhì)量。熱水抽提物含量計算公式如下：

(2)

式中：G0為試樣抽提前絕干質(zhì)量(g)；M1為試樣抽提后絕干質(zhì)量(g)。

1.2.5 礦質(zhì)元素含量測定 采用硝酸-雙氧水消解，ICP-aes 測定鉀、鈣、鎂含量(倪張林等，2013)。稱取樣品0.2 g(精確至0.000 1 g)，置于聚四氟乙烯消解罐中，加入5 mL濃硝酸，2 mL 30%過氧化氫，微波消解 20 min，待溶液澄清后，定容至50 mL，過濾，上機(jī)測定各元素含量。

1.2.6 DNA的提取 使用總DNA 提取試劑盒[FastDNA SPIN kit for Soil(Mpbio, USA)],具體方法參照說明書。

1.2.7 DNA的檢測 采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和 Nanodrop2000 分光光度計檢測 DNA 的純度和濃度。

1.2.8 真菌的特異性擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系(25 μL)：DNA模板1 μL，引物ITS2F(5′-GCATCG ATGAACGCAGC-3′)、ITS2R(5′-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3′)各1 μL，5X TransStart Fastpfu Buffer 5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，F(xiàn)astPfu DNA Polymerase 0.5 μL，dd H2O 14.5 μL。PCR反應(yīng)條件：1×(95℃，2 min)；30×(95 ℃，20 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；72 ℃，5 min)；4 ℃ 保存。每種樣品取3 μL進(jìn)行檢測(1.5%瓊脂條凝膠電泳)，3次重復(fù)。將同一樣品的 PCR 產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用 AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN 公司)切膠，回收 PCR 產(chǎn)物，Tris-HCl 洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。

1.2.9 HiSeq文庫構(gòu)建及測序 使用BIOO SCIENTIFIC公司的NEXTflexTMRapid DNA-Seq Kit for Illumina 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit3.0和QPCR定量和文庫檢測。高通量測序試驗由美因健康科技(北京)有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

1.3.1 數(shù)據(jù)的過濾、拼接和質(zhì)控 使用FLASH軟件將Read1和Read2的overlap進(jìn)行拼接, 拼接后的序列為Raw Tags。拼接過程要求重疊區(qū)的最小長度為10 bp, 最大錯配率為10%。使用Qiime(Caporasoetal.，2010)對Raw Tags進(jìn)行質(zhì)控, 截斷含5個以上連續(xù)N或低質(zhì)量堿基的Tags, 進(jìn)一步過濾掉連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags, 從而獲得Clean Tags。嵌合體的檢定采用UCHIME算法(Edgaretal.，2011)，與Unite數(shù)據(jù)庫比對,嵌合體序列去除后即獲得作為后續(xù)數(shù)據(jù)分析的Effective Tags。

采用R軟件對初始結(jié)果進(jìn)行相對豐度制圖，利用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析(Duncan)及相關(guān)性分析(Pearson)，利用Canoco for Windows 4.5進(jìn)行冗余分析。

1.3.2 OTU聚類分析 通過歸類操作，根據(jù)各個序列間的相似度分組，將1個小組認(rèn)定為1個OTU(operational taxonomic units)。本試驗在97%相似水平下對OTU進(jìn)行歸類和生物信息統(tǒng)計分析。

采用 RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，選用的比對數(shù)據(jù)庫為Unite數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 降香黃檀心材和邊材內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性

2.1.1 降香黃檀心材和邊材內(nèi)生真菌數(shù)據(jù)篩選 6個樣本分別測定，總獲得2 193 336條序列。經(jīng)過過濾嵌合體后, 用于后續(xù)分析的序列共1 970 694條，堿基總數(shù)為761 438 850 bp，有效序列平均長度為385 bp。堿基質(zhì)量值Q30[Effective Tags中堿基質(zhì)量值大于30(測序錯誤率小于0.1%)的堿基所占百分比]比例大于93.84%,表明樣本數(shù)據(jù)可靠。測序數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果統(tǒng)計如表1所示。

表1 測序質(zhì)量信息匯總①

①Clean Tags：Tags過濾低質(zhì)量和短長度Tags后的序列Tags filter the sequence after low quality and short length Tags;Q20content(%)：測序錯誤率低于1%的堿基序列所占百分比 Percentage of base sequence with sequencing error rate less than 1%;Q30content(%)：測序錯誤率低于0.1%的堿基序列所占百分比 Sequencing error rate less than 0.1% of base sequence.

采用隨機(jī)抽樣方法對測序獲得的序列進(jìn)行分析，以抽取到的序列數(shù)為橫坐標(biāo)、序列數(shù)所代表的OTU數(shù)目為縱坐標(biāo)構(gòu)建稀釋曲線。由圖1可知，心材和邊材曲線均趨于平坦，說明測序數(shù)據(jù)合理，更多的序列對發(fā)現(xiàn)新的OTU貢獻(xiàn)率較小。

圖1 心材和邊材內(nèi)生真菌OTU稀釋曲線

2.1.2 內(nèi)生真菌物種豐富度OTU聚類分析 對6個樣品的OTU進(jìn)行相似性聚類分析見圖2。聚類結(jié)果Heatmap圖展示不同樣品中各真菌OTU序列數(shù)量的多寡，同時也可以看出不同真菌OTU在6個樣品間的分布情況。橫向比較可知，6個樣品之間的內(nèi)生真菌相對豐度存在差異，表明即使是同一真菌，不同樣品的相對豐度也存在差異，如青霉屬(Penicillium)豐度在樣品JXSW2和JXHW1相似，在JXHW1和JXW3相似，而在其他2個樣本不同；當(dāng)然在同一個樣品，又有內(nèi)生真菌相對豐度相似，如在樣品JXSW3中黑孢屬(Nigrospora)、念珠菌屬(Candida)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)聚為一支?？v向相比之下，來源于同一株降香黃檀的樣本OTU在豐度上聚為一支，如樣本JXSW2和JXHW2相似；來源同一部位樣品聚為一支，如樣本JXHW2和JXHW3相似。

圖2 不同樣品Heatmap

2.1.3 物種注釋及分類學(xué)分析 以O(shè)TU中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列為該OTU代表序列，利用OTU代表序列進(jìn)行分類注釋, 采用為UCLUST算法(Edgaretal., 2010)，參考序列Unite數(shù)據(jù)庫(Quastetal., 2012)。各樣品在各分類水平上的OTU數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果如圖3所示。門、科、種分類水平上，各個樣本的OTU差別不大；綱和屬分類水平上，各個樣本的OTU上有一定差距，且心材和邊材之間的差別較大，其中降香黃檀心材內(nèi)生真菌在屬級分類水平注釋比例相對較高，表明其OUT注釋效果較好。

圖3 各樣品在各分類水平上的序列數(shù)目

2.1.4 降香黃檀心材和邊材內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu) 1)綱水平上的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu) 通過Unite數(shù)據(jù)庫進(jìn)行歸類分析(相似水平為97%)。在綱水平上(圖4)，降香黃檀木材內(nèi)生真菌主要菌群依次為傘菌綱(Agaricomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、毛霉亞門(Mucoromycotina)、座囊菌綱(Dothideomycetes)、盤菌亞門(Pezizomycotina)、酵母菌綱(Saccharomycetes)、小紡錘菌綱(Atractiellomycetes)、地舌菌綱(Geoglossomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)，其中心材內(nèi)生真菌優(yōu)勢綱為傘菌綱、糞殼菌綱和散囊菌綱，占總數(shù)的90%；邊材內(nèi)生真菌優(yōu)勢綱依次為：糞殼菌綱、座囊菌綱、傘菌綱、地舌菌綱和銀耳綱，共占95%。

2)屬水平上的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu) 通過Unite數(shù)據(jù)庫進(jìn)行歸類分析(相似水平為97%)，共獲得331個屬。分析相對豐度排名前20的屬(圖5)，可以看出降香黃檀心材內(nèi)生真菌優(yōu)勢菌群依次為暗枝頂孢殼屬(Phaeoacremonium)、鐮刀菌屬(Fusarium)、孢子絲菌屬(Sporothrix)、黑酵母樣真菌Cladophialophora屬和球托霉屬(Gongronella)，5個優(yōu)勢屬共占心材內(nèi)生真菌的90%。邊材內(nèi)生真菌優(yōu)勢菌群依次為鐮刀菌屬、毛色二孢屬(Lasiodiplodia)、枝孢屬(Cladosporium)、念珠菌屬(Candida)、德巴利酵母屬(Debaryomyces)和木霉屬(Trichoderma)，共占邊材內(nèi)生真菌的65%。

3)種水平上的內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu) 通過Unite數(shù)據(jù)庫進(jìn)行歸類分析(相似水平為97%)，降香黃檀心材和邊材中內(nèi)生真菌分屬于6門26綱67目116科167屬186種。在種水平上，心材優(yōu)勢菌為：孢子絲菌環(huán)境種Sporothrixlignivora(7.13%)、卵形孢球托霉菌(Gongronellabutleri)(4.14%)和尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)(1.95%)，其余群落豐度均低于1%。邊材優(yōu)勢菌為：可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobromae)(0.147%)、酵母菌(Debaryomycesudenii)(0.054%)和鐮刀菌(Fusariumpseudensiforme)(0.052%)，其余群落豐度低于0.05%。

圖4 心材和邊材綱水平上內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)

4)心材和邊材內(nèi)生真菌物種差異顯著性分析(LEfSe分析) 為進(jìn)一步探究心材和邊材內(nèi)生真菌種對其劃分產(chǎn)生顯著差異影響的物種，本研究進(jìn)行了LEfSe(LDA effect size)分析。心材和邊材內(nèi)生真菌的LEfSe分析結(jié)果如圖6所示，LDA得分圖顯示了LDA Score大于4的物種, 可作為代表各組的Biomarker。

降香黃檀心材內(nèi)生真菌物種豐度大于邊材。結(jié)合圖6 LDA得分圖發(fā)現(xiàn)，降香黃檀邊材中內(nèi)生真菌種類較少、豐度也較低，且在測序過程中受到植物基因的干擾嚴(yán)重。比對Unite數(shù)據(jù)庫，由物種分支進(jìn)化圖可知，心材和邊材內(nèi)生真菌中有顯著差異影響的Biomarker物種有1門2綱5目5科5屬2種。其中門水平上具有顯著差異影響的菌為接合菌門，綱水平有糞殼菌綱和毛霉亞門，屬水平的菌是暗枝頂孢殼屬、孢子絲菌屬、鐮刀菌屬、黑酵母樣真菌(Cladophialophora)屬和球托霉屬，種水平的菌為孢子絲菌環(huán)境種Sporothrixlignivora和卵形孢球托霉菌(Gongronellabutleri)。

5)內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性分析 在相似性水平97%的條件下，對心材和邊材內(nèi)生真菌多樣性系數(shù)進(jìn)行計算(表2)。降香黃檀心材內(nèi)生真菌的Chao1指數(shù)和Observed OTUs指數(shù)高于邊材，說明降香黃檀心材中內(nèi)生真菌的物種數(shù)量和OTU多于邊材。Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)，表明心材中內(nèi)生真菌多樣性要遠(yuǎn)多于邊材內(nèi)生真菌多樣性。

2.2 降香黃檀心材和邊材內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性與木材理化性質(zhì)關(guān)系

2.2.1 內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)與木材理化性質(zhì)的關(guān)系 降香黃檀心材和邊材內(nèi)生真菌屬水平群落結(jié)構(gòu)(豐富度排名前20)與木材理化性質(zhì)的RDA分析見圖7，Axis 1解釋51.7%的信息，Axis 2解釋44.1%的信息。心材優(yōu)勢菌群相對集中，而邊材優(yōu)勢菌則相對分散。pH和鉀元素剛好處在含水率、熱水抽提物、鈣鎂元素的反向延長線上，呈極顯著負(fù)相關(guān)。pH、鉀元素和灰分與心材優(yōu)勢菌負(fù)相關(guān)，與邊材呈正相關(guān)。熱水抽提物、含水率和鈣鎂元素之正好相反。幾種木材因子相比之下，暗枝頂孢殼屬受到灰分、鉀鎂元素和pH的影響較大，受含水率、熱水抽提物和鈣元素影響較小。對于邊材優(yōu)勢菌群毛色二孢屬和木霉屬，木材因子對其影響極小。對于孢子絲菌屬，木材因子的影響大小為熱水抽提物>含水率>鈣>pH>鎂>鉀>灰分。經(jīng)過Forword分析表明，pH、灰分、鉀元素與降香黃檀內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)有顯著相關(guān)性。在pH一定的情況下，含水率越高，心材優(yōu)勢菌暗枝頂孢殼屬、鐮刀菌屬、黑酵母樣真菌屬和球托霉屬豐度越高。作為木材內(nèi)少有的病原拮抗菌木霉屬菌，受木材內(nèi)環(huán)境因子的影響最小，且與大部分優(yōu)勢菌負(fù)相關(guān)。

（4）符合條件的投資人進(jìn)行認(rèn)購，該環(huán)節(jié)完成后，全部資金將轉(zhuǎn)移至信托賬戶，從而使資金完成從分散到歸集再到成為支付承銷對價的過程，并最終流向融資人（即發(fā)起人）[3]。完成上述步驟后，基礎(chǔ)資產(chǎn)所有權(quán)歸集至信托公司名下。

圖5 心材和邊材屬水平上內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)

圖6 LDA得分與物種分支進(jìn)化

2.2.2 內(nèi)生真菌群落多樣性指數(shù)與木材理化性質(zhì)的關(guān)系 通過對心材和邊材樣品內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)和木材理化性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析(表3)，結(jié)果表明，豐度指數(shù)Chao1、多樣性指數(shù)Simpson、Shannon之間呈正相關(guān)，且Simpson、Shannon指數(shù)之間呈顯著正相關(guān)；指數(shù)與含水率、熱水抽提物、礦質(zhì)元素鈣和鎂呈正相關(guān)，且與含水率呈顯著正相關(guān)，表明內(nèi)生真菌受到含水率的影響較大，與pH、灰分和礦質(zhì)元素鉀呈負(fù)相關(guān)。

表2 不同樣品內(nèi)生真菌群落的多樣性分析(相似度為97%)

圖7 內(nèi)生真菌菌群與木材性質(zhì)的RDA分析

表3 木材理化與內(nèi)生真菌多樣性的相關(guān)性分析①

①**:在0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)，*:在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。**:Significantly correlated at the 0.01 level(both sides), *:Significantly correlated at the 0.05 level(both sides).

3 討論

3.1 降香黃檀心材和邊材的內(nèi)生真菌多樣性與差異性

目前，有關(guān)降香黃檀內(nèi)生真菌群落多樣性對心材的影響尚未報道。本研究通過高通量測序，從基因組水平上解析其心材和邊材內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)。多樣性分析Observed OTUs 指數(shù)和Chao1指數(shù)表明，真菌群落OTU數(shù)目的種類和各樣地真菌的物種總數(shù)為心材多于邊材。根據(jù)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分析結(jié)果可知，心材內(nèi)生真菌群落多樣性大于邊材，說明降香黃檀心材內(nèi)生真菌物種豐度和多樣性均高多于邊材。這表明降香黃檀內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)分布受到本身木材結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，同一樹種的不同植株內(nèi)生真菌也會有所不同,可能是因為心材和邊材的組織內(nèi)生理條件和結(jié)構(gòu)性質(zhì)特征等因素不同，從而影響到內(nèi)生真菌的侵染和定殖過程，使內(nèi)生真菌的分布表現(xiàn)出組織差異性(Alyetal.,2011)，如Gond(2007)對木橘(Aeglemarmelos)、Gazis(2010)對橡膠樹(Heveabrasiliensis)、Kharwar(2010)對藥用樟樹(Cinnamomumbodinieri)和宋海燕等(2019)對棉花(Gossypium)不同部位的研究。

分析降香黃檀內(nèi)生真菌群體組成，許多種類分布廣泛，在綱水平上，傘菌綱在降香黃檀心材中占比比邊材中更大，表明其更加適應(yīng)心材環(huán)境，對心材表現(xiàn)出組織偏好性，該菌綱在不同植物內(nèi)生真菌都有發(fā)現(xiàn)，如蛇足石杉(Huperziaserrata)的莖、葉和根的內(nèi)生真菌(Chenetal.,2011)、白芨(Bletillastriata)的根和葉的內(nèi)生真菌(韋艷梅等，2016；席剛俊等，2017)。座囊菌綱和酵母菌綱在邊材中的占比比心材要高，在邊材中更具有競爭能力，這2個菌綱對心材表現(xiàn)出組織偏好性，座囊菌綱如在巴西仙人掌(Opuntiastricta)的內(nèi)生真菌(Bezerraetal.，2016)、山蒼子(Litseacubeba)的內(nèi)生菌(楊鼎超，2018)，酵母菌綱如在山藥(Dioscoreaoppositifolia)地下莖、莖、葉的內(nèi)生真菌(詹壽發(fā)等，2012)。糞殼菌綱和散囊菌綱在心材和邊材是優(yōu)勢綱，能適應(yīng)心材和邊材2種不同的環(huán)境，在植物內(nèi)環(huán)境環(huán)境變換中更穩(wěn)定，這2個菌綱不表現(xiàn)出組織偏好性，糞殼菌綱如在石斛(Dendrobiumnobile)的內(nèi)生菌(Chenetal., 2011)、小麥(Triticumaestivum)內(nèi)生真菌(趙芹等，2017)，散囊菌綱如在針葉樹(Pinales)的針葉的內(nèi)生真菌(Yooetal., 2012)、美味石耳(Umbilicariaesculenta)內(nèi)生真菌(張惠，2014)。同時李永等(2013)報道2個歐美楊(Populus×euramericana)品種的內(nèi)生真菌優(yōu)勢菌綱，包括在囊菌綱2個分支、散囊菌綱、類殼菌綱等，席剛俊等(2017)報道白芨根的內(nèi)生真菌優(yōu)勢菌綱為傘菌綱等，說明降香黃檀內(nèi)生真菌在綱級水平種群組成與其他植物差異不大。在屬水平上，鐮刀菌屬是心材和邊材共有的優(yōu)勢屬，在心材和邊材環(huán)境中都具備一定的適應(yīng)性和穩(wěn)定性，這個菌屬不表現(xiàn)出組織偏好性，是常見的菌屬，可侵染和定殖到多種植物，如在豇豆(Vignaunguiculata)種子的內(nèi)生真菌(Rodriguesetal.,2005)、帝楓皮(Illiciumdifengpi)根的內(nèi)生真菌(孫文斌等，2018)。同時鄭建華等(2013)報道銀杏(Ginkgobiloba)優(yōu)勢內(nèi)生真菌為刺盤孢屬(Colletotrichum)、鏈格孢屬(Alternaria)、鐮孢菌屬(Fusarium)和擬莖點霉屬(Phomopsis)為優(yōu)勢菌群，孫思勝(2015)報道在檀香(Santalumalbum)結(jié)香部位優(yōu)勢真菌屬是鐮孢屬和擬莖點霉屬、檀香健康木材優(yōu)勢真菌屬是擬莖點霉屬，張苗苗(2017)報道白木香中內(nèi)生真菌菌種，其中青霉菌屬(Penicillium)、可可毛色二孢屬、木霉菌屬、曲霉菌屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬是優(yōu)勢真菌，可見降香黃檀內(nèi)生真菌在屬級水平種群組成與其他植物差異甚大。其原因可能是降香黃檀分布區(qū)常年氣溫較高，內(nèi)生微生物需耐受高溫度；其木材優(yōu)質(zhì)、紋理致密、降香油含量高，對內(nèi)生微生物的侵入定殖和生長要求高。

3.2 降香黃檀內(nèi)生菌真菌對降香黃檀生長的影響

內(nèi)生菌在植物體內(nèi)利用植物產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)，同時產(chǎn)生代謝產(chǎn)物(Liheng，2012；Wangetal., 2011)。某些內(nèi)生真菌對植物也有毒害作用。降香黃檀樹干中內(nèi)生真菌中有些真菌類群雖然在很多文獻(xiàn)中報道與植物病害相關(guān)，如暗枝頂孢殼屬的真菌一些為植物的致病菌(張秋娥，2012)，能通過樹干傷口侵入木質(zhì)部，并在心材和邊材中定殖。如褐枝頂孢霉(Phaeoacremoniumaleophilum)、寄生褐枝頂孢霉(Phaeoacremoniumparasiticum)能夠引起葡萄(Vitisvinifera)退化，毛色二孢屬的一些菌能夠在植物上致病(謝紅輝，2016)，同時一些能夠促進(jìn)沉香結(jié)香(陳旭玉等，2017)；但是內(nèi)生于植物可能只具有較弱的致病性或者已經(jīng)喪失了致病能力(Schulzetal.，2005; De Brumetal.，2012)，甚至轉(zhuǎn)為對植物的有益菌，當(dāng)然在植物衰退的過程中又可能轉(zhuǎn)化為植物的病源菌(Alyetal.，2011)。如鐮刀菌屬通常被報道為病原菌，但內(nèi)生菌鐮刀菌屬卻能降低玉米黑斑病對玉米(Zeamays)的病害嚴(yán)重程度(Leeetal., 2010)。

植物內(nèi)生真菌對植物的生長具有重大影響，一些木本植物的某些內(nèi)生真菌能促進(jìn)植物心材的形成。Cui等(2013)報道木霉屬菌和可可毛色二孢屬菌能促進(jìn)白木香心材的形成(Cuietal.，2013)。檀香健康的莖干部位的內(nèi)生真菌與環(huán)境中真菌通過傷口侵染莖干木材，然后形成特殊的真菌群落，進(jìn)而誘導(dǎo)檀香局部心材的形成(結(jié)香)(孫思勝等，2015)。人工接種鐮孢菌屬系可以誘導(dǎo)沉香結(jié)香(鄭科等，2016)。多種內(nèi)生真菌能誘導(dǎo)土沉香結(jié)香(譚小明等，2018)。可可毛色二孢菌與腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)侵染白木香樹體后，會促使樹體產(chǎn)生樹脂以及胼胝質(zhì)以抵御真菌的侵染，相應(yīng)產(chǎn)生一些沉香類物質(zhì)(谷麗萍等，2018；鄭科等，2019)。報道柑橘葡萄座腔菌(Ascomycetes)、鐮孢菌屬、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、Khuskia屬能促進(jìn)檀香心材的形成(劉小金，2012)。降香黃檀的某些內(nèi)生真菌對其心材的形成也存在促進(jìn)作用，如茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)、層生鐮刀菌(Fusariumproliferatum)、多毛孢(Pestalotiopsispalmarum)和紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)均能促進(jìn)降香黃檀產(chǎn)生心材，其中以多毛孢效果最佳(如賈瑞豐，2014)。降香黃檀內(nèi)生真菌資源的利用還需進(jìn)一步深入的研究。

3.3 降香黃檀內(nèi)生真菌群落的影響因素

植物內(nèi)生真菌的來源主要是根際土壤微生物和空氣中的微生物(Compantetal.，2011)，很多因素都會影響植物內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)(Hoffmanetal.，2008)，如根際土壤的質(zhì)地、植物生長環(huán)境、植物本身內(nèi)部微環(huán)境性質(zhì)、基因水平以及人類生產(chǎn)活動等都會影響到植物內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)。本研究主要是對引起降香黃檀內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要木材內(nèi)環(huán)境因子進(jìn)行研究，造成降香黃檀心材和邊材內(nèi)生真菌群落數(shù)量和結(jié)果差異其機(jī)制是多方面而又較為復(fù)雜的，需要深入研究。

本研究結(jié)果初步顯示，降香黃檀心材和邊材內(nèi)生真菌群體在群落結(jié)構(gòu)的組成和潛在功能上具有一些獨特特征。降香黃檀因其樣本珍貴以及國家政策等原因，考慮到群落結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)結(jié)果與實際情況的差距，未來的研究工作還可以選擇對正常生長的降香黃檀直接取樣進(jìn)行研究。研究不同地區(qū)降香黃檀內(nèi)生菌是否存在種屬專一性和環(huán)境差異性，以及內(nèi)生菌的功能多樣性等方面進(jìn)行研究，以揭示降香黃檀內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)多樣性特征和其生態(tài)分布規(guī)律；研究降香黃檀內(nèi)生菌與心材互作的分子機(jī)制等，為利用內(nèi)生微生物促進(jìn)降香黃檀心材形成提供理論基礎(chǔ)等研究。

4 結(jié)論

對降香黃檀心材和邊材的內(nèi)生真菌HiSeq高通量測序并優(yōu)化后，結(jié)果表明，降香黃檀心材和邊材內(nèi)生真菌種群資源豐富多樣，其中在內(nèi)生真菌的不同分類水平上心材和邊材內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異影響的內(nèi)生真菌有2綱5屬2種，且心材內(nèi)生真菌群落豐度和多樣性均高于邊材，同時也說明了降香黃檀心材和邊材內(nèi)生真菌的入侵定殖既有相似又有區(qū)別，同時又具有組織偏好性和專一性。

降香黃檀心材和邊材的內(nèi)生真菌與木材理化性質(zhì)的關(guān)系中，引起降香黃檀內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要木材環(huán)境因子有pH、灰分和礦質(zhì)元素鉀。而引起降香黃檀內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性差異的主要木材內(nèi)環(huán)境因子是pH、含水率、礦質(zhì)元素鈣和鉀，且含水率影響最大。