李 丹， 李 孟， 謝芝勛， 羅思思， 謝麗基， 張民秀，黃嬌玲, 范 晴, 王 盛, 謝志勤， 鄧顯文， 曾婷婷， 張艷芳

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣西 南寧 530001)

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是正黏病毒科中A型流感病毒屬成員。根據(jù)其表面抗原血凝素蛋白(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶蛋白(Neuraminidase，NA)的差異可將AIV劃分為16種不同的HA亞型(H1～H16)和9種不同的NA亞型(N1～N9)[1-3]。依據(jù)AIV對(duì)雞致病性的強(qiáng)弱，AIV還可分為高致病性AIV(HPAIV)和低致病性AIV(LPAIV)。H9亞型AIV自1966年在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，目前已經(jīng)給全球養(yǎng)禽業(yè)造成了十分嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。自1998年廣東首次發(fā)現(xiàn)人感染H9N2亞型AIV病例以來(lái)，H9N2亞型AIV感染人事件也在不斷的發(fā)生[5]。H6亞型AIV屬于LPAIV，在中國(guó)、北美和歐洲等地區(qū)已被廣泛發(fā)現(xiàn)[6-7]。研究表明，H6亞型AIV感染范圍廣泛，其天然宿主主要為水禽，其他陸生禽類感染率相對(duì)較少[8]。我國(guó)自2000年以來(lái)已不斷有H6亞型AIV分離的報(bào)道，而且還在人群中檢測(cè)到H6亞型AIV的特異性抗體[9-10]，更為嚴(yán)重的是臺(tái)灣地區(qū)已經(jīng)于2013年6月發(fā)現(xiàn)1例H6N1直接感染人的病例[11]。近年來(lái)的低致病性禽流感的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，H9和H6亞型禽流感病毒混合感染普遍存在，部分H9N2和H6N6亞型AIV可為H5N6和H7N9等亞型高致病性禽流感病毒提供內(nèi)部基因[12-13]。因此，開(kāi)展H9與H6亞型AIV的研究對(duì)家禽養(yǎng)殖及人類健康衛(wèi)生具有重要意義。

由于傳統(tǒng)的禽流感病毒檢測(cè)方法存在病毒分離培養(yǎng)周期長(zhǎng)且需要血清學(xué)方法鑒定，而血清學(xué)方法要用較多標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，但是禽流感病毒不同亞型血清相互間存在不同程度的交叉免疫保護(hù)反應(yīng)，其結(jié)果的準(zhǔn)確性具有局限性，所以目前禽流感病毒較多采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。分子生物學(xué)方法特別是RT-PCR檢測(cè)技術(shù)具有快速、簡(jiǎn)便和準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在禽流感的診斷及大規(guī)模監(jiān)測(cè)過(guò)程中應(yīng)用廣泛[14]。由于AIV感染動(dòng)物后具有相似的臨床癥狀，混合感染的現(xiàn)象也普遍存在，所以在日常診斷中難以及時(shí)、準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行鑒別確診。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多重PCR技術(shù)的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，特別是在禽流感診斷領(lǐng)域中，但關(guān)于三重RT-PCR檢測(cè)區(qū)分H9與H6亞型AIV混合感染的方法鮮見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，依據(jù)Genbank中H9和H6亞型AIV的HA基因及所有亞型AIVM基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，優(yōu)化退火溫度和引物濃度及其配比等條件，建立優(yōu)化可同時(shí)檢測(cè)H9與H6亞型AIV的三重RT-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)所建方法進(jìn)行特異性、敏感性及臨床樣品檢測(cè)的驗(yàn)證，旨在為H9與H6亞型AIV的監(jiān)測(cè)及其防控提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1毒株AIV毒株(H1N2、H3N2、H6N2、H9N2、H9N6、NDV、IBV及ILTV)均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；AIV(H7N2、H14N5、H15N9和H16N3)的cDNA 模板由美國(guó)賓夕法尼亞州立大學(xué)惠贈(zèng)；AIV毒株(H5N1)cDNA 模板由美國(guó)康涅狄格州立大學(xué)惠贈(zèng)；其他AIV毒株(H2N3、H4N5、H8N4、H6N8、H10N3、H11N3、H12N5和H13N5)或cDNA 模板均由香港大學(xué)惠贈(zèng)。

1.1.2試劑SPF雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司，DL 1 000 bp DNA Marker、感受態(tài)細(xì)胞、PCR產(chǎn)物快速連接載體、膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒抽提試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物、10 mmol dNTP、RNA抽提試劑盒、2×PCR Mix及RNA抑制劑均購(gòu)自寶生物(北京)有限公司。其他試劑均購(gòu)自商業(yè)公司。

1.2方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)及合成從GenBank中下載各種不同亞型禽流感病毒的M基因序列、H9和H6亞型AIV的HA基因序列，運(yùn)用DNAStar比對(duì)分析上述序列，找出特異性的保守區(qū)域，然后運(yùn)用Primer Premier 5.0結(jié)合Oligo 7設(shè)計(jì)并通過(guò)驗(yàn)證篩選出3對(duì)針對(duì)M基因、H9和H6亞型AIVHA基因進(jìn)行擴(kuò)增的特異性引物。引物由寶生物(大連)有限公司合成。引物序列及目的片段大小見(jiàn)表1。

表1 禽流感病毒H9和H6亞型HA和M基因引物序列

Table 1 Prime Sequence forHAandMgene in H9 and H6 subtype AIV

引物Primer引物序列(5′→3′)Prime Sequence擴(kuò)增產(chǎn)物/bp Amplification productM-F AAACGCCCTAAATGGGAATGGA 667M-R TCCCTCATAGACTCAGGCATT H6-F GTGCACCATCCTCCTGTCAC 478H6-R TGAAGCCTGCAATAGCTCCAA H9-F ACTCGATGAGCATGATGCAAA 299H9-R AGAAGGCAGCAAACCCCATT

1.2.2病原RNA/DNA的提取與cDNA合成參照核酸抽提試劑盒使用說(shuō)明抽提AIV、IBV、NDV和ARV的RNA及ILTV的DNA，抽提后的核酸模板用33 μL RNA-free水溶解。RNA模板參照寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明合成cDNA，所有核酸模板均于-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3三重RT-PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化運(yùn)用25 μL反應(yīng)體系：2×PCR Mix 12.5 μL，H9與H6亞型AIV cDNA模板各1 μL，引物M-F、M-R、H9-F、H9-R、H6-F和H6-R (20 pmol/μL)分別加入0.1～1.0 μL，共10個(gè)梯度，每個(gè)梯度遞增0.1 μL，優(yōu)化2個(gè)引物組合的濃度，用RNA-free補(bǔ)足至25 μL。同時(shí)根據(jù)濃度試驗(yàn)的效果再對(duì)退火溫度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行組合優(yōu)化，最終確定最佳反應(yīng)體系及條件。

1.2.4特異性試驗(yàn)運(yùn)用上述所建立的三重RT-PCR檢測(cè)方法按照對(duì)H1N2、H2N3、H3N2、H4N5、H5N1、H6N8、H7N2、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H11N3、H12N5、H13N5、H14N5、H15N9、H16N3、NDV、IBV和ILTV的cDNA/DNA進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證所建方法的特異性。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)品的制備分別以H9N2與H6N6毒株cDNA為模板擴(kuò)增M基因和HA基因，得到其全長(zhǎng)目的片段，并將目的片段分別連接到載體上并送測(cè)序。將插入有H9與H6亞型AIV的HA基因和M基因全長(zhǎng)片段并測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為M-T、H9-T和H6-T。用商品化的質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取含有M-T、H9-T和H6-T的質(zhì)粒，并用微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定其濃度，根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算樣品相對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)，同時(shí)將M-T、H9-T與H6-T質(zhì)粒等拷貝數(shù)混合，并按10倍的倍比稀釋混合樣品，以便獲得M-T、H9-T與H6-T質(zhì)粒DNA濃度均為5×102～5×107拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.6敏感性試驗(yàn)運(yùn)用上述優(yōu)化好的三重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)制備好的濃度為5×10～5×109拷貝/μL的M-T、H9-T與H6-T質(zhì)粒樣品進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證該檢測(cè)方法的敏感性。

1.2.7臨床樣品檢測(cè)運(yùn)用所建立的三重PCR檢測(cè)方法對(duì)近期從南寧、柳州和防城港不同活禽市場(chǎng)采集的152份雞和鴨咽喉及泄殖腔棉拭子樣品的部分進(jìn)行PCR檢測(cè)鑒定，同時(shí)將相同編號(hào)剩余樣品經(jīng)過(guò)處理后接種SPF雞胚進(jìn)行流感病毒的分離與血清學(xué)鑒定，將鑒定H9與H6亞型AIV為陽(yáng)性的樣品進(jìn)行HA基因的序列測(cè)定，所有M基因陽(yáng)性樣品也進(jìn)行序列測(cè)定。然后將上述方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)而驗(yàn)證三重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2結(jié)果與分析

2.1H9和H6亞型AIV的三重RT-PCR反應(yīng)條件

對(duì)M基因、H9與H6亞型AIVHA基因3對(duì)特異性引物濃度比例及擴(kuò)增溫度時(shí)間等的優(yōu)化得到三重RT-PCR反應(yīng)的最佳體系：2×PCR Mix 12.5 μL，H9與H6亞型AIV cDNA共2 μL為模板，特異性引物M-F和M-R(20 pmol/μL)加入量為0.6 μL、特異性引物H9-F和H9-R(20 pmol/μL)的加入量為0.7 μL，特異性引物H6-F及H6-R(20 pmol/μL)的加入量為1 μL，用RNA-free水補(bǔ)足至終體積為25 μL。對(duì)退火溫度進(jìn)行梯度優(yōu)化篩選確定該反應(yīng)體系的最佳退火溫度為53℃。

2.2H9和H6亞型AIV的三重RT-PCR反應(yīng)條件的驗(yàn)證情況

2.2.1特異性從圖1看出，用建立的三重RT-PCR法從H9及H6亞型AIV混合樣品分別檢測(cè)出3條特異性條帶，分別為667 bp(通用)、478 bp(H6亞型)及299 bp(H9亞型)；對(duì)H9N2和H9N6亞型AIV PCR檢測(cè)的結(jié)果僅出現(xiàn)2條特異性條帶，片段大小分別為667 bp和299 bp；對(duì)H6N2亞型AIV進(jìn)行擴(kuò)增僅檢測(cè)出2條特異性條帶，片段大小分別為667 bp和478 bp；對(duì)其他亞型AIV僅有1條667 bp的特異性條帶，常見(jiàn)的禽病病原體均未擴(kuò)增出條帶。表明，所建立的三重RT-PCR法具有良好的特異性。

2.2.2敏感性從圖2看出，對(duì)濃度為5×102～5×107拷貝/μL的M基因、H6與H9亞型的AIV均有3條明顯的特異性擴(kuò)增條帶，片段大小分別為667 bp、478 bp和299 bp；對(duì)濃度小于5×103拷貝/μL的M基因、H6與H9亞型AIV均無(wú)擴(kuò)增條帶。由此可見(jiàn)，該法最低能同時(shí)檢測(cè)到質(zhì)粒模板量為5×103拷貝/μL的M基因、H6與H9亞型AIV。

注：M．DL1000 DNA Marker；1.H9N2+H6；2.H9N6+H6；3.H6N6；4.H6N2；5.H6N8；6.H9N2；7.H9N6；8.H1N2；9.H2N2；10.H3N2；11.H5N1；12.H7N2；13.H10N3；14.H11N3；15.H12N5；16.H14N5；17.H15N9；18.H16N3；19.H4N5；20.IBV；21.ILTV；22.NDV；23.陰性對(duì)照。

Note:M．DL1000 DNA Marker；1.H9N2+H6；2.H9N6+H6；3.H6N6；4.H6N2；5.H6N8；6.H9N2；7.H9N6；8.H1N2；9.H2N2；10.H3N2；11.H5N1；12.H7N2；13.H10N3；14.H11N3；15.H12N5；16.H14N5；17.H15N9；18.H16N3；19.H4N5；20.IBV；21.ILTV；22.NDV；23.negative control.

圖1 H9和H6亞型AIV的三重RT-PCR特異性

Fig.1 Specificity of H9 and H6 subtype AIV by triplex RT-PCR

注：M為DNA標(biāo)準(zhǔn)DL1000；1～6分別為濃度1.5×107拷貝/μL、2.5×106拷貝/μL、3.5×105拷貝/μL、4.5×104拷貝/μL、5.5×103拷貝/μL和6.5×102拷貝/μL；7.陰性對(duì)照。

Note: M, DNA Marker DL1000; the concentration from 1 to 6 is 1.5×107copies/μL, 2.5×106copies/μL, 3.5×105copies/μL, 4.5×104copies/μL, 5.5×103copies/μL and 6.5×102copies/μL, respectively; 7. negative control.

圖2 H9和H6亞型AIV的三重RT-PCR敏感性

Fig.2 Sensitivity of H9 and H6 subtype AIV by triplex RT-PCR

2.2.3臨床樣品檢測(cè)樣品PCR檢測(cè)的結(jié)果顯示，有13份樣品為H9與H6亞型AIV混合感染陽(yáng)性，陽(yáng)性率為8.55%；28份樣品能擴(kuò)增出299 bp的目的條帶，為H9Nx AIV，陽(yáng)性率為18.42%；6份樣品能擴(kuò)增出478 bp的目的條帶，為H6Nx AIV，陽(yáng)性率為3.95%；有18份僅有667 bp的目的條帶，是除H6Nx和H9Nx外的其他亞型禽流感病毒。部分活禽市場(chǎng)棉拭子樣品PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。上述樣品檢測(cè)結(jié)果與經(jīng)典的雞胚病毒分離鑒定，及其HA基因和M基因測(cè)序結(jié)果100%相符。

注：M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL1000；5和7為H6亞型AIV陽(yáng)性產(chǎn)物；1、9、12和17為H9亞型AIV陽(yáng)性產(chǎn)物；3和19為H9與H6亞型AIV的陽(yáng)性產(chǎn)物；8、13和15為其他亞型AIV的陽(yáng)性產(chǎn)物；其余為陰性產(chǎn)物。

Note: M, DNA Marker DL1000; 5 and 7, positive products of H6 subtype AIV; 1, 9, 12 and 17, positive products of H9 subtype AIV; 3 and 19, positive products of H6 and H9 subtype AIV; 8 ,13 and 15, positive products of other subtype of AIV; the others are negative products.

圖3 部分活禽棉拭子樣品的RT-PCR檢測(cè)

Fig.3 Detection of cotton swab samples from some live poultry by RT-PCR

3結(jié)論與討論

自20世紀(jì)90年代H9亞型AIV在中國(guó)被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已在全國(guó)各養(yǎng)殖區(qū)流行，該亞型病毒的流行不僅給中國(guó)的家禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，且可直接感染人(H9N2亞型AIV)，給人類帶來(lái)致病風(fēng)險(xiǎn)，直至目前，其直接感染人病例還在不斷出現(xiàn)。H6亞型AIV對(duì)家禽呈現(xiàn)低致病性，但是其可跨越種屬屏障直接感染人，可在健康人群血清中檢測(cè)到H6亞型AIV抗體陽(yáng)性，甚至在2013年6月中國(guó)臺(tái)灣出現(xiàn)首例人感染H6N1亞型AIV的病例[15]。近年的研究表明，H9和H6亞型LPAIV還可為H7N9和H5N6等HPAIV的重組提供內(nèi)部基因[16-17]，這些“新毒株”已對(duì)人類公共衛(wèi)生的安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，已引發(fā)全球科學(xué)家對(duì)H9與H6亞型AIV的密切關(guān)注和深入研究。

近年來(lái)，廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所持續(xù)多年對(duì)廣西地區(qū)家禽中LPAIV流行情況的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，廣西家禽中LPAIV感染比例較高的是H9亞型AIV，H6亞型AIV也經(jīng)常在鴨和鵝中被檢測(cè)到，該結(jié)果與華東地區(qū)等中國(guó)其他地區(qū)LPAIV的監(jiān)測(cè)結(jié)果[18-20]基本一致。由于LPAIV在家禽體內(nèi)多以混合感染形式存在，且多數(shù)病毒對(duì)家禽的致病性不強(qiáng)，臨床癥狀及剖檢病變極其相似，肉眼和常規(guī)方法難以快速準(zhǔn)確地鑒別診斷。目前，對(duì)于H9與H6亞型AIV的混合感染主要采用傳統(tǒng)的病毒分離及血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定，該方法不僅耗時(shí)且準(zhǔn)確性難保證，迫切需要建立一種快速有效地檢測(cè)及鑒別H9與H6亞型AIV的方法，為2種亞型AIV的快速準(zhǔn)確鑒別提供可靠的技術(shù)支撐。

通過(guò)軟件設(shè)計(jì)針對(duì)H9與H6亞型AIVHA基因及M基因的特異性引物，經(jīng)過(guò)對(duì)不同引物組合進(jìn)行試驗(yàn)篩選得到擴(kuò)增效果較好的1個(gè)引物組合，然后對(duì)反應(yīng)體系中引物濃度、引物比例、退火溫度和擴(kuò)增時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，最終建立可同時(shí)檢測(cè)H9與H6亞型AIV的方法。該方法只能特異性擴(kuò)增出H9與H6亞型AIVHA基因及M基因，不能檢測(cè)出其他亞型AIVHA基因及其他常見(jiàn)家禽病原的核酸。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法最低能檢測(cè)到量為5×103拷貝/μL的3種質(zhì)粒的模板。另外，不同地區(qū)采集的152份臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果也表明，其與病毒分離及測(cè)序結(jié)果完全相符。綜上，研究已成功建立了一種能夠同時(shí)檢測(cè)H9與H6亞型AIV三重RT-PCR方法，一次PCR反應(yīng)便可同時(shí)確定樣品中H9與H6亞型AIV的混合感染及單一感染情況，該方法具有特異性強(qiáng)、快速簡(jiǎn)便及易操作等優(yōu)點(diǎn)，十分適于在基層單位應(yīng)用推廣，有利于畜牧業(yè)的健康發(fā)展，可為H9與H6亞型AIV的監(jiān)測(cè)及其防控提供技術(shù)支撐。