辛明 ，孫宇，李昌寶 *，唐雅園，孫健 *，何雪梅

1. 廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院農產品加工研究所（南寧 530007）；2. 廣西果蔬貯藏與加工新技術重點實驗室（南寧 530007）

圣女果（Lycopersicon esculentumMill.）又稱迷你番茄、小番茄等，屬茄科番茄屬植物，主要作為水果食用，被聯合國糧農組織列為優(yōu)先推廣的“四大水果”之一[1-3]。圣女果富含維生素、礦物質、有機酸等營養(yǎng)成分，還含有谷胱甘肽、番茄紅素等抗癌物質[4-5]。圣女果中主要的營養(yǎng)成分就是番茄紅素，而番茄皂苷則是圣女果中除了番茄紅素之外的主要有效成分[6-7]。番茄皂苷具有一般皂苷的性質，如降血脂、降膽固醇、抗動脈硬化、抗氧化、抑制癌細胞增殖等生理活性[8-10]。皂苷類物質是近年來研究的熱點，不少研究者報道了皂苷的提取工藝，如人參[11]、羅漢果[12]、漿果[13]、苦瓜[14]等。令狐晨等[15]總結概括了水提法、超聲提取法、酶提法、微波輔助提取，閃式提取等9種皂苷提取方法。目前國內只有少數番茄皂苷提取方面的報道：劉金磊等[16]運用果膠酶提取番茄總皂苷，并申請了專利；盧鳳來等[17-18]主要研究用D101大孔樹脂分離純化番茄總皂苷并建立了番茄皂苷A的含量測定方法。而超聲波協(xié)同復合酶法提取圣女果皂苷卻鮮見研究報道。

超聲波協(xié)同復合酶法能有效避免常規(guī)水提法的缺陷，超聲波是利用其空化作用、機械效應及機械剪切作用對原料進行破碎，使胞內的有效成分擴散、溶出[19]；酶則具有水解纖維素的作用，促進胞內有效成分的溶出[20]。試驗采用超聲波協(xié)同復合酶法提取圣女果皂苷，開發(fā)完善皂苷提取工藝，以充分發(fā)揮其在保健食品、藥品等方面的可利用性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮圣女果，2018年3月采于廣西百色市田陽縣百育鎮(zhèn)圣女果種植基地，選取無病蟲害、無腐爛損傷的果實；香草醛、硫酸、無水乙醇、甲醇、磷酸二氫鈉、二水合檸檬酸三鈉均為分析純；人參皂苷Rh1標準品（Singma公司）；纖維素酶、果膠酶為食品級。

Genesys 10s UV-Vis紫外可見分光光度計（Thermo Fisher Scientific）；HH-S4數顯恒溫水浴鍋（金壇市萬華實驗儀器廠）；ATX124精密電子天平（SHIMADZU）；PHS-3C pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；JY92-ⅡDN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；3K15高速低溫離心機（SIGMA）；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器（Scientific Industrie）；A3000榨汁機（南京威利郎食品有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同皂苷的提取方法

1.2.1.1 皂苷提取工藝流程

新鮮圣女果→清洗→打碎成漿→不同方法提取→過濾→收集上清液→皂苷含量測定

1.2.1.2 不同方法提取

水提法：稱取100 g圣女果，洗凈后打碎成漿，加入蒸餾水調整料液比至1∶10（g/mL），于80 ℃加熱浸提2 h，用80～100目濾布過濾，所得濾液以4 500 r/min離心10 min，收集上清液，測定皂苷含量。

酶提法[21-22]：稱取100 g圣女果，洗凈后打碎成漿，加入0.05%的酶（果膠酶與纖維素酶質量比1∶2），加入蒸餾水調整料液比至1∶10（g/mL），在50℃下保溫酶解2 h，滅酶10 min。酶解液用80～100目濾布過濾，所得濾液以4 500 r/min離心10 min，收集上清液，測定皂苷含量。

醇提法：稱取100 g圣女果，洗凈后打碎成漿，加入75%的乙醇溶液調整料液比至1∶10（g/mL），于60 ℃水浴鍋中提取2 h。用80～100目濾布過濾，所得濾液以4 500 r/min離心10 min，收集上清液，測定皂苷含量。

超聲波協(xié)同酶法：稱取100 g圣女果，洗凈后打碎成漿，加入0.05%的酶（果膠酶與纖維素酶質量比1∶2），加入蒸餾水調整料液比至1∶10（g/mL），在50℃下保溫酶解2 h，再用功率210 W的超聲波細胞破碎儀處理20 min時間，滅酶10 min。用80～100目濾布過濾，所得濾液以4 500 r/min離心10 min，收集上清液，測定皂苷含量。

1.2.2 皂苷含量測定

參考高凱翔等[23]的方法略修改，采用香草醛-硫酸法測定。取0.5 mL樣品提取液于試管中，加入3.5 mL的香草醛-硫酸溶液，充分搖勻，將試管置于60 ℃水浴加熱15 min，再置于冷水冷卻10 min，以試劑空白為參比，在535 nm處測定其吸光度A，根據人參皂苷標準曲線計算出圣女果總皂苷含量。

標準曲線的繪制：精密稱取人參皂苷標準品，以甲醇定容，配成質量濃度為15 g/mL的標準液。精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0和1.2 mL標準液于試管中，加入3.5 mL的香草醛-硫酸溶液，充分搖勻，將試管置于60 ℃水浴加熱15 min，再置于冷水冷卻10 min，以試劑空白為參比，在535 nm處測定吸光度A，以人參皂苷Rh1的濃度為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制人參皂苷Rh1的標準曲線，得到回歸方程：y=0.052 4x-0.137 3（R2=0.995）。

1.2.3 皂苷提取率的計算

式中：m為圣女果質量，g；c為由標準曲線算得的皂苷質量濃度，μg/mL；N為稀釋倍數；V為提取液總體積，mL。

1.2.4 單因素試驗

以蒸餾水為提取溶劑，酶解溫度50 ℃，超聲功率210 W，依次固定料液比1∶40（g/mL）、酶濃度0.2%、酶解時間2.0 h、超聲時間40 min，分別考察不同料液比（1∶10，1∶20，1∶40，1∶60，1∶80和1∶100 g/mL）、酶濃度（0.01%，0.05%，0.1%，0.2%和0.3%）、酶解時間（0.5，1，1.5，2和3 h）、超聲時間（10，20，30，40，50和60 min）對圣女果皂苷提取率的影響，各試驗重復3次。

1.2.5 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以提取率為指標，按L9(34)正交表做正交試驗，因素水平設計見表1，以確定超聲波協(xié)同復合酶法提取圣女果皂苷的最佳工藝。

表1 正交試驗水平因素表

1.2.6 數據處理

所有數據為3次以上重復試驗的平均值±標準差；使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同提取方法對圣女果皂苷提取率的影響

由圖1可知，不同提取方法得到的圣女果皂苷提取率不同，最高為超聲波協(xié)同酶法，其次為酶提法、水提法、醇提法。醇提法的提取率最低，醇提法所用提取溶劑為乙醇，其他方法均使用蒸餾水作為提取溶劑，表明圣女果中所含主要為水溶性番茄皂苷[7]。以水為溶劑提取圣女果皂苷能有效提高提取率，成本低、安全、環(huán)保，適合工業(yè)化生產。酶提法比水提法高，其原因是酶能加快生物的反應速度，破壞植物的細胞壁，使有效成分溶解出；而在正常情況下，水不易破壞植物的細胞壁，所以水提法較低[24]。超聲波協(xié)同酶法提取率高，其原因是超聲有破壁、振動、攪拌等功能，能提高反應速度，所以提取率增高[25]。而超聲波協(xié)同復合酶法的提取率均高于其他方法，表明超聲波協(xié)同復合酶法是4種方法中的最佳提取方法。所以試驗采用超聲波協(xié)同復合酶法進行進一步工藝優(yōu)化。

圖1 不同提取方法對圣女果皂苷提取率的影響

2.2 料液比對圣女果皂苷提取率的影響

由圖2可知，料液比對圣女果皂苷提取率影響較大。隨著料液比的增加，料液比為1∶40（g/mL）時提取率最高（0.308%），料液比超過1∶40（g/mL）時開始逐漸下降。其原因可能是料液比越小，即水溶劑用量越大，越有利于水溶性番茄皂苷的溶出，導致皂苷提取率增加；但料液比達一定值后，水溶劑用量的增加會造成提取液中復合酶濃度的降低，也會造成單位提取液中番茄皂苷濃度的降低，導致番茄皂苷提取率的下降[26]。因此，選擇料液比1∶40（g/mL）為宜。這與鄭威等[27]在人參總皂苷提取條件優(yōu)化中的料液比趨勢一致。

圖2 料液比對圣女果皂苷提取率的影響

2.3 復合酶濃度對圣女果皂苷提取率的影響

由圖3可知，隨著復合酶濃度的增加，圣女果皂苷提取率呈逐漸上升后降低的趨勢，酶濃度0.2%時得率最高。復合酶濃度繼續(xù)增加，總皂苷提取率有所下降。其原因可能是復合酶對圣女果細胞壁起到酶解作用，使圣女果中的有效物質充分提取出來，將圣女果較大程度酶解；當底物濃度不能對酶達到飽和時[28]，酶解作用受到抑制，圣女果皂苷提取率發(fā)生下降趨勢。陳思呈等[22]研究番茄的總皂苷提取時發(fā)現當酶用量到達最佳值時后逐漸下降，這與此次試驗結果基本一致。因此選擇復合酶濃度0.2%為宜。

2.4 酶解時間對圣女果皂苷提取率的影響

由圖4可知，隨著酶解時間的逐漸增大，圣女果皂苷提取率顯著增高。當酶解時間為1.5 h時，提取率最高；當酶解時間大于1.5 h時，隨著酶解時間的延長，皂苷提取率呈現下降趨勢。其原因可能是酶解時間到達1.5 h時圣女果細胞的細胞壁基本被破壞，圣女果總皂苷已完全溶解出，再延長酶解時間，會使圣女果總皂苷結構發(fā)生變化，從而導致提取率呈現下降趨勢[29]。這與李祥等[29]在研究茶皂苷酶法提取工藝的結果一致。因此選擇酶解時間1.5 h為宜。

圖3 酶濃度對圣女果皂苷提取率的影響

圖4 酶解時間對圣女果皂苷提取率的影響

2.5 超聲時間對圣女果皂苷提取率的影響

由圖5可知，超聲時間30 min提取率最高。超聲時間在10～30 min范圍內，圣女果皂苷提取率逐漸增大；超聲時間在30 min后降低呈現穩(wěn)定趨勢。說明超聲30 min已將圣女果皂苷最大溶解出，過長的超聲時間會使生產成本變高，不適宜工業(yè)化生產。因此選取超聲時間30 min為宜。

2.6 正交試驗

在上述單因素試驗的基礎上，選取料液比、酶濃度、酶解時間、超聲時間為試驗因素，以圣女果皂苷提取率為考察指標，選取L9(34)進行正交試驗，優(yōu)化超聲波協(xié)同復合酶法提取工藝條件。正交試驗結果及分析見表2，方差分析見表3。

由表2可見，由R值可得出提取率影響因素大小依次為A＞B＞C＞D，試驗最佳提取條件為A3B3C1D3。由表3方差分析可知，料液比、酶濃度、酶解時間對圣女果總皂苷提取率影響顯著，超聲時間影響不顯著，這表明在各個因素所考察的范圍內，料液比、酶濃度、酶解時間是一個重要因素，因此圣女果總皂苷最佳提取條件為A3B3C1D3，而超聲時間對圣女果皂苷提取率影響不大，從節(jié)約時間和經濟的方面考慮，最佳條件選擇D2。因此，試驗最佳提取條件定為A3B3C1D2，即料液比1∶60（g/mL）、酶濃度0.3%、提取時間1 h、超聲時間20 min。

圖5 超聲時間對圣女果皂苷提取率的影響

表2 圣女果皂苷L9(34)正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

2.7 驗證試驗

按照正交試驗結果篩選出最佳提取條件A3B3C1D2進行驗證，重復5次。驗證試驗結果表示，提取率平均值與正交試驗結果差距不大，提取率平均值為0.37%。驗證結果見表4。

表4 驗證性試驗結果

3 結論

研究結果表明，通過比較水提法、酶提法、醇提法、超聲波協(xié)同復合酶法4種不同提取方法對圣女果皂苷提取率的影響，得出超聲波協(xié)同復合酶法為最佳提取方法。在單因素試驗中，料液比、酶濃度、酶解時間、超聲時間4個因素隨著因素水平的增加，均呈先上升后下降的趨勢。在正交試驗中，各因素對圣女果皂苷提取率影響順序為：料液比＞酶濃度＞酶解時間＞超聲時間。圣女果提取皂苷的最佳工藝條件為：料液比1∶60（g/mL）、酶濃度0.3%、提取時間1 h、超聲時間20 min。此條件下圣女果皂苷提取率為0.37%。此次試驗優(yōu)化的工藝可為圣女果皂苷工業(yè)化生產以及皂苷化合物的綜合利用提供一種新的途徑。