劉南

（上海原能細(xì)胞生物低溫設(shè)備有限公司，上海201203）

阿莫西林膠囊是膠囊劑，填充物為白色或類白色粉末，主要成分是阿莫西林。阿莫西林膠囊成品以阿莫西林為主要原料，填充至藍(lán)黃色的膠殼中。本單位生產(chǎn)的阿莫西林膠囊的膠殼是藍(lán)黃色，型號(hào)1#，主要成分是食用級(jí)明膠。阿莫西林膠囊主要適用于敏感菌所引起的感染，即不能分泌β- 內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌。阿莫西林膠囊作為青霉素類的廣譜抗生素，其抗菌譜范圍較大，主要包括敏感性的球菌或桿菌所引起的上呼吸道感染、敏感菌所引起的泌尿系統(tǒng)感染、敏感菌侵染皮膚傷口造成的感染、敏感菌引起的急性支氣管炎和下呼吸道感染等。

2015 版《中國(guó)藥典》要求企業(yè)在對(duì)藥品進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)對(duì)微生物計(jì)數(shù)方法進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，確保微生物計(jì)數(shù)方法適合該產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。本次試驗(yàn)的技術(shù)難點(diǎn)主要體現(xiàn)在對(duì)阿莫西林膠囊進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，樣品中的抑菌物質(zhì)可能會(huì)抑制樣品中微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性的可能性。阿莫西林膠囊作為β- 內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)革蘭氏陽性菌和芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用；對(duì)革蘭氏陰性菌也有一定的抑制作用，也就是說檢驗(yàn)樣品存在抑菌性，需要在試驗(yàn)過程中找到合適的方法消除抑菌性。根據(jù)2015 版《中國(guó)藥典》四部通則，對(duì)于β- 內(nèi)酰胺類抗生素，可加入β- 內(nèi)酰胺酶用于中和毒性。

在藥品的生產(chǎn)質(zhì)量控制中要能夠準(zhǔn)確地檢出樣品中的微生物，使藥品中的微生物檢驗(yàn)不因檢驗(yàn)方法的缺陷而出現(xiàn)明顯的偏差。為保證產(chǎn)品微生物檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，微生物計(jì)數(shù)方法須進(jìn)行適用性試驗(yàn)，通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)的客觀性來判定方法的可靠性。

微生物回收時(shí)，如何去除樣品中的抑菌物質(zhì)，保證樣品中的微生物能夠被檢出，避免出現(xiàn)假陰性的結(jié)果是一大難題。需要通過試驗(yàn)證明這種去除抑菌物質(zhì)的方法是可靠的，不僅能夠去除抑菌物質(zhì)，還不影響微生物的檢出。試驗(yàn)過程中注意設(shè)置合理的試驗(yàn)組和對(duì)照以判定試驗(yàn)是否存在系統(tǒng)誤差。

β- 內(nèi)酰胺類抗生素是一種殺菌劑，它能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁中肽聚糖的形成，從而殺滅細(xì)菌。真菌細(xì)胞壁的主要成分是幾丁質(zhì)、脫乙酰殼多糖、葡聚糖、纖維素、半乳聚糖等。因此β- 內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)真菌無抑制作用。阿莫西林膠囊屬于β- 內(nèi)酰胺類抗生素，因此對(duì)細(xì)菌的回收可以考慮在供試液中添加β-內(nèi)酰胺酶，用來中和供試品中抑菌活性物質(zhì)；霉菌和酵母菌則可以用平皿法回收。

1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1 樣品

阿莫西林膠囊，上海美優(yōu)制藥有限公司，規(guī)格：0.25g，批號(hào)：150703。

1.2 儀器設(shè)備

生物安全柜（型號(hào)：BSC-02IIA2，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；風(fēng)熱消毒箱（BZF-50，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；生化培養(yǎng)箱（型號(hào)：LRH-70，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；霉菌培養(yǎng)箱（型號(hào)：MJX-250B-Z，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：SPX-250B，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；電子天平（BSA-8201, 德國(guó)賽多利斯公司）；脈動(dòng)蒸汽滅菌器（型號(hào)：SCM-D/JA，連云港千櫻醫(yī)療設(shè)備有限公司）。

1.3 菌種

白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC(F)98001〕、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）〔CMCC(B)10104〕、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC (B)26003〕、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC(B)63501〕、黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC(F)98003〕。微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，將上述的5 種菌株作為試驗(yàn)菌，標(biāo)準(zhǔn)菌株從中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏中心采購(gòu)且能溯源，工作菌株為第三代。

1.4 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB），干粉培養(yǎng)基均由上海盛思生化科技有限公司生產(chǎn)。

1.5 試劑

稀釋液：PH7.0 氯化鈉- 蛋白胨緩沖液，上海盛思生化科技有限公司生產(chǎn)。

中和劑：β- 內(nèi)酰胺酶，杭州北望生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

表面活性劑：聚山梨酯80，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 菌液制備

將金黃色葡萄球菌的第二代標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株、銅綠假單胞菌的第二代標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株、枯草芽孢桿菌的第二代標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株，分別挑出一環(huán)新鮮培養(yǎng)于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中，33℃培養(yǎng)24 小時(shí)，得到第三代工作菌株；白色念珠菌的第二代標(biāo)準(zhǔn)貯備菌株挑出一環(huán)新鮮培養(yǎng)物，接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）中，23℃培養(yǎng)3 天，得到第三代工作菌株；黑曲霉的第二代孢子懸液挑出接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，23℃培養(yǎng)7 天，用5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80 的PH7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液將黑曲霉孢子洗脫。分別取上述濃菌液1ml 加至9ml 的PH7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液中，10 倍梯度稀釋至約為104cfu/ml。

2.2 供試液制備

稱取阿莫西林膠囊10g，分別加PH7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖 液 至100ml、200ml、500ml，37℃水浴，充分搖勻，使成1:10、1:20、1:50 供試液。

2.3 方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 平皿法

試驗(yàn)組：取制備好的1:10、1:20、1:50 供試液分裝至無菌試管中，每管裝量9.9ml，分別加入金黃色葡萄球菌菌懸液、銅綠假單胞菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液、白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液各 0.1ml （含菌量不超過104cfu/ml）。

菌液組：取PH7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液分裝至無菌試管中，每管裝量9.9ml，分別加入金黃色葡萄球菌菌懸液、銅綠假單胞菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液、白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液各 0.1ml （含菌量不超過104cfu/ml）。

供試品對(duì)照組：取制備好的1:10、1:20、1:50 供試液分裝中無菌試管中，每管裝量9.9ml，加PH7.0無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液0.1ml。

回收率：取上述試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組1ml，置直徑90mm 的無菌平皿中，注入15～20ml 溫 度 不 超 過 45℃ 的TSA/SDA，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。TSA：33℃培養(yǎng)3 天；SDA：23℃培養(yǎng)5 天，計(jì)數(shù)。供試品回收率=（試驗(yàn)組菌落數(shù)- 供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液組對(duì)照數(shù)。供試品需進(jìn)行3 次獨(dú)立平行試驗(yàn)。

2.3.2 中和法

試驗(yàn)組：分別將400 萬（800 萬、1200 萬）單位β- 內(nèi)酰胺酶加至1:10、1:20、1:50 供試液中。將1:10、1:20、1:50 經(jīng)中和的供試液分裝至無菌試管中，每管裝量9.9ml，分別加入試驗(yàn)菌各0.1ml（含菌量不超過104cfu/ml）。

菌液組：分別將400 萬（800 萬、1200 萬）單位β- 內(nèi)酰胺酶加于9.9ml 的PH7.0 無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液中，分別加入試驗(yàn)菌各0.1ml（含菌量不超過104cfu/ml）。

供試品對(duì)照組：分別將400 萬（800 萬、1200 萬）單位β- 內(nèi)酰胺酶加于1:10、1:20、1:50 供試液中，每管裝量9.9ml，加PH7.0無菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液0.1ml。

回收率：取上述試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組1ml，置直徑90mm 的無菌平皿中，注入15～20ml 溫度不超過45℃的TSA，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)，33℃培養(yǎng)3 天，計(jì)數(shù)。供試品回收率=（試驗(yàn)組菌落數(shù)- 供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液組對(duì)照數(shù)。供試品需進(jìn)行3 次獨(dú)立平行試驗(yàn)。

表1 平皿法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)方法適用性的回收率

表2 中和法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)方法適用性的回收率

3 試驗(yàn)結(jié)果分析

阿莫西林膠囊采用平皿法進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率為0，即金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌無法通過平皿法回收。銅綠假單胞菌在1:20 供試液下的回收率在0.5～2范圍內(nèi)，即銅綠假單胞菌可采用平皿法（1:20 供試液）收回。霉菌和酵母菌在1:10 供試液下的回收率在0.5～2 范圍內(nèi)，即霉菌和酵母菌可采用平皿法（1:10 供試液）收回。詳見表1。

阿莫西林膠囊采用中和法進(jìn)行金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌在1:10 供試液加1200 單位的β- 內(nèi)酰胺酶、1:20供試液加1200 單位的β- 內(nèi)酰胺酶、1:50 供試液加400 單位的β- 內(nèi)酰胺酶、1:50 供試液加800 單位的β- 內(nèi)酰胺酶的回收率均不在在0.5～2 范圍內(nèi)，無法回收。發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌在1:50 供試液加1200 單位的β- 內(nèi)酰胺酶的回收率在0.5～2 范圍內(nèi)，即金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌可采用稀釋法（1:50 供試液）和中和法加1200 單位的β- 內(nèi)酰胺酶回收。詳見表2。

3.1 平皿法回收率

由表1 可知，霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)可直接采用平皿法（1:10 供試液）。需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)（銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉）通過平皿法可以回收。

3.2 中和法回收率

由表2 可知需氧菌總數(shù)（金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌）計(jì)數(shù)，可采用中和法（1:50 供試液+1200 萬單位的β- 內(nèi)酰胺酶）回收。結(jié)合表1 可知，需氧菌總數(shù)（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉）可采用稀釋法、中和法聯(lián)合使用，即1:50 供試液中，加1200 萬單位的β- 內(nèi)酰胺酶回收。

4 結(jié)論

作為藥品微生物限度檢查的一種方法，微生物計(jì)數(shù)法應(yīng)確保其可靠性，具體驗(yàn)證方法可參考2015 年版《中國(guó)藥典》。通過對(duì)最終產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)，從而判別其檢出結(jié)果是否符合相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求以及企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量要求。檢驗(yàn)結(jié)果符合要求也能為藥品的出廠放行，提供微生物負(fù)載定量證據(jù)。

阿莫西林膠囊屬于β- 內(nèi)酰胺酶類抗生素，本身會(huì)對(duì)部分細(xì)菌產(chǎn)生殺滅作用，也會(huì)使得部分致病菌處于損傷狀態(tài)或在檢驗(yàn)培養(yǎng)體系中抑制致病菌的活性，但在適宜的條件下，這類被抑制的微生物可能會(huì)“復(fù)活”。如果這類被損傷的致病菌進(jìn)入人體，它們可能會(huì)在血液中修補(bǔ)損傷從而恢復(fù)活性，“復(fù)活”后的致病菌會(huì)在血液中大量繁殖，從而危害人體健康。

微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)不僅是2015 版《中國(guó)藥典》的要求，更是確保企業(yè)微生物計(jì)數(shù)方法的可靠性，保證藥品中的微生物能夠被檢出，不會(huì)因?yàn)橐志饔贸霈F(xiàn)“假陰性”的可能性。

綜上所述，對(duì)阿莫西林膠囊這種β- 內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合使用稀釋法、中和法，即在1:50 供試液中加1200 萬單位的β-內(nèi)酰胺酶回收需氧菌。采用平皿法，即1:10 供試液，直接回收霉菌和酵母菌。