成 昭, 苗延青, 鄭 蕾, 何 昊

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

皮膚是阻擋異物和病原體侵入、防止體液流失的重要人體防線。當(dāng)皮膚完整性遭到破壞時，須及時進行皮膚創(chuàng)口保護與缺損修復(fù)，以防其裸露于外界、造成創(chuàng)面急慢性感染。傳統(tǒng)創(chuàng)口處理和修復(fù)方式有皮膚敷料覆蓋[1]、術(shù)后縫合等，但傳統(tǒng)的方式側(cè)重傷口覆蓋與促愈、不易固定，使用時需注意防水、需進行創(chuàng)面換藥等，或固定傷口的方式使得正?；顒邮芟蕖o法保持創(chuàng)面的濕潤、需拆線，存在諸多應(yīng)用局限和再次感染風(fēng)險。

Scheme 1

為了克服傳統(tǒng)創(chuàng)口處理和修復(fù)方式的局限、實現(xiàn)傷口快速閉合、避免再次感染，同時進行皮膚功能模擬、促進傷口愈合，本文創(chuàng)新性地設(shè)計了復(fù)合遇水固化貽貝粘附蛋白MAP[2](mussel adhesive protein)粘合材料作為基材。在此基礎(chǔ)上，將新西蘭兔動脈血提取富含多種天然生長因子的富血小板纖維蛋白PRF[3](platelet-rich fibrin)進行MAP復(fù)合，合成了功能性的新型MAP-PRF復(fù)合創(chuàng)口敷料。相關(guān)研究工作在國內(nèi)外均未見報道。

以MAP實現(xiàn)創(chuàng)口閉合、PRF實現(xiàn)創(chuàng)口促愈，針對皮膚創(chuàng)傷愈合經(jīng)歷的3個時期(炎癥期、增生期和重塑期)，實現(xiàn)：1)創(chuàng)口初期處理時快速止血、閉合傷口防止二次感染[4]；2)中后期側(cè)重促生和修復(fù)[5]、為新生組織提供營養(yǎng)，實現(xiàn)潮濕環(huán)境下的黏附性[6-7]，滿足創(chuàng)口修復(fù)材料的防水要求與復(fù)雜環(huán)境適用性。同時，以仿生合成、生物提取等技術(shù)手段最大限度保證MAP-PRF材料的生物安全性及相容性、降低免疫排斥反應(yīng)[8-9]。此外，MAP粘合材料能夠滿足特種環(huán)境免拆線、防水[10-11]、抗低溫等需求，應(yīng)用前景廣闊。

以含有多羥基鍵連結(jié)構(gòu)單元的聚合醇PPG1000、氰基鍵連結(jié)構(gòu)單元的異氰酸酯IPDI為初始原料，在擴鏈劑DMPA、催化劑DBTL、碳二亞胺類縮合劑DCC作用下，通過聚氨酯預(yù)聚物合成、預(yù)聚物擴鏈兩步合成得到可修飾調(diào)控的高分子基體，再接入鄰二酚粘合單元[12-13]，完成貽貝粘附蛋白的仿生合成(Scheme 1)。粘合基材的仿生設(shè)計與MAP仿生合成能夠初步保證其低毒性及生物相容性；同時，以分段調(diào)控方式合成聚氨酯材料，其高修飾性還可使該類新型粘合材料未來的功能化修飾成為可能。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UNICO UV-2012C/PC/PCS型紫外-可見分光光度計；BRUKER AVANCE Ⅲ 400 MHz型超導(dǎo)核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標)；Agilent Technologie PL-GPC50型凝膠滲透色譜儀；Perkin Elmer PE-TGA7型熱失重分析儀；Thermo Fisher 1510 Mwltiskan Go型多功能酶聯(lián)免疫檢測儀。

二丁基二月桂酸錫(DBTL)，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；聚丙二醇1000(PPG 1000)、異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)、二羥甲基丙酸(DMPA)、N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)和多巴胺鹽酸鹽等，分析純，阿拉丁試劑有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 聚氨酯預(yù)聚物(1)合成

按摩爾比2/1.2混合IPDI與預(yù)處理后的PPG1000，攪拌均勻后，減壓蒸餾，殘余物真空干燥，加入干燥DMF，氮氣氛圍下反應(yīng)6 h得透明油狀的聚氨酯預(yù)聚物。間隔取樣，用二正丁胺-鹽酸法確定-NCO已消耗完全。

(2) 聚氨酯預(yù)聚物擴鏈產(chǎn)物(2)的合成

以物質(zhì)的量比為1/2/0.2混合聚氨酯預(yù)聚物、擴鏈劑DMPA和催化劑DBTL，攪拌均勻，在氮氣氛圍下反應(yīng)3 h，得到透明油狀的擴鏈產(chǎn)物。

(3) MAP粘合材料(3)的合成

擴鏈反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系冷卻至0 ℃，向擴鏈反應(yīng)產(chǎn)物中加入縮合劑DCC、黏性結(jié)構(gòu)單元多巴胺鹽酸鹽、三乙胺和DMF，使擴鏈產(chǎn)物、DCC、多巴胺鹽酸鹽、三乙胺和DMF 的物質(zhì)的量比為1/0.12/1/0.1/15，攪拌均勻，置于室溫下反應(yīng)6 h，反應(yīng)結(jié)束后，用濃度為2 mol/L的稀鹽酸反復(fù)沉淀，對沉淀物進行多次透析、純化后，所得的產(chǎn)物自然干燥，得到淺黃色至近無色的目標粘合基材MAP。

(4) PRF微粒及MAP-PRF復(fù)合敷料的合成

取新西蘭兔動脈血，離心，分出淡黃色凝膠層，即為凝膠狀PRF。將新鮮PRF 放入無菌培養(yǎng)皿，冷凍干燥24 h后，于無菌研缽中研磨，過200目無菌篩網(wǎng)收集冷凍干燥的PRF微粒，存于無菌EP管中，密封于-80 ℃保存。

質(zhì)量濃度/(g·L-1)
圖1催化劑DBTL加入前后，PPG1000-DMPA-多巴胺粘合材料的吸光度-質(zhì)量濃度曲線

Figure 1Absorption-mass concentration curves of PPG1000-DMPA-dopamine with and without DBTL catalyst

圖2PPG1000-DMPA-多巴胺粘合材料的1H NMR譜圖

分別將PRF與MAP于水中均勻分散，恒溫攪拌條件下將兩者緩慢混合均勻，加入24孔板，每孔0.5 mL，于-20 ℃下存放24 h，再經(jīng)25 ℃復(fù)融24 h得MAP-PRF復(fù)合修飾的創(chuàng)口敷料。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征

(1) UV-Vis吸光度-質(zhì)量濃度線性關(guān)系與枝節(jié)率

分別配制5×10-5、 1×10-4、 5×10-4、 1×10-3g/L的多巴胺、PPG1000-DMPA-多巴胺與PPG1000-DMPA-DBTL-多巴胺的DMSO溶液，進行常溫UV-Vis測定實驗，建立吸光度-質(zhì)量濃度的吸收曲線(圖1)。對比多巴胺的標準吸收曲線，可判斷粘合材料聚氨酯側(cè)鏈中粘合單元多巴胺的引入量，進一步分析催化劑DBTL加入與否對聚氨酯預(yù)聚物在擴鏈反應(yīng)中枝節(jié)率的影響，以及枝節(jié)率與多巴胺對MAP材料粘合性能的影響。未來研究工作中，還可通過調(diào)控催化劑DBTL的加入量，進一步調(diào)控材料粘合性能與枝節(jié)率等。

(2)1H NMR

圖2為PPG1000-DMPA-多巴胺粘合材料的1H NMR譜圖。由圖2可見，δ8.12處特征峰與多巴胺酚羥基與酰胺鍵活性氫的特征峰位置一致，說明擴鏈反應(yīng)發(fā)生，聚氨酯側(cè)鏈成功接入鄰二酚粘合功能單元多巴胺。

(3) GPC

在40 ℃下，聚苯乙烯作為標準聚合物、含0.01 mol/L溴化鋰的DMF作為流動相，流速1.0 mL/min，用GPC測得聚合物分子量及其分布，結(jié)果見表1。由表1可知，多分散指數(shù)PD數(shù)值接近1，可見聚合材料分布均勻，黏均摩爾質(zhì)量Mv為1039。

表1 PPG1000-DMPA-多巴胺分子量及分布

2.2 MAP粘合材料熱穩(wěn)定性

取樣量約為5 mg，氮氣氛圍下，在20 ℃/min、 40～600 ℃條件下進行目標粘合材料熱失重分析(圖3)。由圖3可見，PPG1000-DMPA-多巴胺熱失重呈平滑曲線，與彈性體的熱穩(wěn)定趨勢一致[14-16]，熱穩(wěn)定性良好。PPG1000-DMPA-多巴胺存在兩個主要失重段，集中在250～350 ℃，是由聚氨酯具有的軟段及硬段結(jié)構(gòu)決定的：第一個片段是由于異氰酸酯IPDI和擴鏈劑DMPA分解產(chǎn)生，第二個片段是由于聚二醇PPG1000的分解產(chǎn)生[15]。

圖3粘合材料PPG1000-DMPA-多巴胺的熱重分析曲線

2.3 MAP-PRF復(fù)合創(chuàng)口敷料對ECV304細胞的增殖抑制作用

將處于對數(shù)生長期的EVC304細胞，接種于96孔板，37 ℃、 5%CO2及90%濕度培養(yǎng)24 h使細胞貼壁，更換新的培養(yǎng)基，加入目標粘合材料的DMF溶液，使其終質(zhì)量濃度為100 μg/L，對照組加入等體積溶劑，每組設(shè)6個平行孔。加樣完畢后，將96孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，除去培養(yǎng)基，每孔加入配置好的20 μL MTT溶液和180 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)4 h。移去上清液，每孔加入150 μLDMSO，以60次/min的頻率震蕩10 min后，用酶標儀測定490 nm處吸光度A值，計算RGR(%)(relative growth rate，細胞相對增值率，表2)。依據(jù)細胞毒性評價標準[17-18]：RGR≥100%，細胞毒性等級為0級；80%～99%為1級毒性；50%～79%為2級毒性；30%～49%為3級毒性；0～29%為4級毒性。結(jié)果表明，MAP-PRF創(chuàng)口敷料在ECV304細胞中的毒性較小，毒性等級評價為0級。

以粘合材料MAP為基體、復(fù)合生物提取的PRF，結(jié)合MAP的生物粘合與PRF促愈性能，經(jīng)預(yù)聚物合成、預(yù)聚物擴鏈得到側(cè)鏈含羧基聚氨酯、鄰二酚粘合單元接入得到側(cè)鏈含多巴胺聚氨酯、PRF復(fù)合等步驟，合成得到一種新型MAP-PRF復(fù)合創(chuàng)口敷料。該復(fù)合創(chuàng)口敷料細胞毒性低、熱穩(wěn)定性好，可進一步用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域的軟組織快速縫合及硬組織粘接。

此外，可在保證材料的生物安全性及生物相容性的基本前提下，還可針對MAP合成路徑中得到的聚氨酯結(jié)構(gòu)-性能可調(diào)控性、易于制備等優(yōu)點，進行材料功能性再修飾，考查以PEG、 PPG等多種二元醇為初始原料制備得到MAP的粘合度、親水性、生物相容等性能，再復(fù)合快速止血、促進愈合、防水等功能因子，實現(xiàn)快速閉合創(chuàng)口、免拆線或減少創(chuàng)口換藥次數(shù)等特性，擴大MAP-PRF復(fù)合創(chuàng)口敷料的適用性，解決傳統(tǒng)皮膚敷料的不足。