溫利娟,薛曉鷗,馬秀麗,米 鑫,謝 偉

1.北京市順義區(qū)婦幼保健院(北京101300);2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院(北京100700)

宮頸癌是女性惡性腫瘤發(fā)病率第2位的腫瘤，根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的數(shù)據(jù)，每年約25萬(wàn)女性死于宮頸癌[1-2]。ERK及P38是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員，參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育等生理過(guò)程，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。目前ERK及 P38信號(hào)通路的研究對(duì)腫瘤防治工作有重要意義[3]。

名老中醫(yī)郭志強(qiáng)教授創(chuàng)立了紫草散治療宮頸HPV感染，經(jīng)薛曉鷗教授團(tuán)隊(duì)劑型優(yōu)化為紫柏凝膠，前期實(shí)驗(yàn)研究表明紫柏凝膠可抑制宮頸癌Siha細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。然而，紫柏凝膠治療宮頸癌的具體機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究建立人宮頸癌裸鼠荷瘤模型，觀察ERK及P38/MAPK信號(hào)通路在紫柏凝膠影響宮頸癌裸鼠移植瘤致癌蛋白E6、E7 表達(dá)中的作用，以期從分子生物學(xué)水平為闡明紫柏凝膠治療宮頸癌作用機(jī)制。

材料與方法

1 動(dòng) 物 35只SPF級(jí)BALB/c(nu/nu)雌性裸小鼠，5～6周齡，體質(zhì)量16～18 g，由維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京) 2012-0001)。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK( 京) 20120028。

2 細(xì)胞株 宮頸癌Siha細(xì)胞株購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

3 藥 物 紫柏凝膠由紫草、黃柏、莪術(shù)、銀花、苦參、百部、兒茶、白及、冰片九味中藥組成，藥物比例為20∶20∶20∶20∶20∶20∶15∶6∶2，飲片由北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門醫(yī)院藥劑科提供，按工藝提取后制作而成，由北京百川飛虹技術(shù)有限公司生產(chǎn)(15 g/瓶，含生藥量約2.7 g，批次號(hào)：20160501)。注射用順鉑，10 mg/支，齊魯制藥有限公司(生產(chǎn)批號(hào)：H37021358)。

4 主要試劑及儀器 抗人乳頭瘤病毒16(E7)抗體(英國(guó)abcam公司)，山羊抗兔 IgG(英國(guó)abcam公司)，山羊抗鼠 IgG(英國(guó)abcam公司)，抗人乳頭瘤病毒16(E6)，18(E6)抗體(英國(guó)abcam公司)，抗p-ERK抗體(英國(guó)abcam公司)，抗p-p38抗體(英國(guó)abcam公司)，免疫組化試劑盒(北京中衫生物科技有限公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon)，細(xì)胞培養(yǎng)箱( 德國(guó)Thermo公司)，生物潔凈使用超凈臺(tái)(杭州Opti MAIR公司)。

5 Siha細(xì)胞懸液制備方法 Siha細(xì)胞株復(fù)蘇→細(xì)胞培養(yǎng)→對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞→胰酶消化→離心→丟上清→懸浮細(xì)胞→細(xì)胞計(jì)數(shù)。培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清DMEM液、100 mg/ml濃度的鏈霉素和青霉素，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。最后調(diào)整細(xì)胞濃度2×107/ml。

6 模型制備及分組方法 無(wú)菌條件下，用0.5 ml注射器抽取0.2 ml(濃度為2×107/ml)Siha細(xì)胞懸液，并注射于裸鼠右前肢腋窩。皮下結(jié)節(jié)直徑>0.5 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)[5]，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，觀察裸鼠生長(zhǎng)狀態(tài)及腫瘤生長(zhǎng)情況。本實(shí)驗(yàn)共35只裸鼠成瘤率為100%。成瘤后將裸鼠稱重，用隨機(jī)數(shù)字表法分成紫柏凝膠高、中、低劑量組，順鉑組及模型組，每組7只。

7 干預(yù)方法 紫柏凝膠各劑量組分別用無(wú)菌棉簽在瘤體表面涂抹紫柏凝膠0.9428(相當(dāng)臨床劑量的2倍)、0.4714(等同于臨床劑量)、0.2357(相當(dāng)于臨床劑量的1/2)g/kg，1 d/次；順鉑組腹腔內(nèi)注射0.5 ml順鉑5 mg/kg，相當(dāng)于臨床化療方案中 100 mg /(m2·d)用量，4 d/次；模型組不干預(yù)。各組均干預(yù)4周。

8 觀察指標(biāo)

8.1 一般觀察指標(biāo):包括裸鼠精神狀態(tài)、反應(yīng)力、活動(dòng)力、飲食情況，同時(shí)包含抑制瘤皮下種植區(qū)外觀及觸感。治療過(guò)程中死亡裸鼠均行解剖以明確死因。

8.2 裸鼠體質(zhì)量及瘤體體積:測(cè)量每日用藥前裸鼠體質(zhì)量，并測(cè)量裸鼠瘤體的長(zhǎng)徑(a)和短徑(b)，計(jì)算腫瘤體積(V)，V=ab2/2。

8.3 瘤重及抑瘤率檢測(cè):停藥24 h后，頸椎脫臼法處死裸鼠，完整剝?nèi)×鼋M織，測(cè)量體積并稱瘤重。抑瘤率(%)：[(對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重]×100%。

8.4 瘤體組織病理學(xué)觀察:采用HE染色法。常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4 μm，二甲苯去蠟處理，乙醇及蒸餾水清洗切片，蘇木精液染色，流水及蒸餾水沖洗。0.5%伊紅液染色，乙醇清洗。中性樹(shù)膠封固[6]。

8.5 免疫組化法檢測(cè)瘤組織中E6、E7、p-ERK和p-p38蛋白表達(dá):采用免疫組化SP法，第1天行組織切片，脫蠟，滅活，熱修復(fù)抗原處理，室溫內(nèi)靜置冷卻，PBS清洗；滴加5%BSA封閉液室溫放置；滴加一抗后切片放置于4 ℃冰箱過(guò)夜[7]。第2天清洗后滴加二抗，室溫放置后清洗，滴加SABC，室溫放置后清洗，DAB室溫顯色后中止反應(yīng)，蘇木素輕度復(fù)染后中止反應(yīng)，切片放入酒精中，中性樹(shù)膠封片。

9 判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化法檢測(cè)下p-ERK、p-p38、E6和E7蛋白表達(dá)水平，結(jié)果判讀采用人工計(jì)數(shù)方法，即根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞的比例評(píng)分。所有切片的觀察經(jīng)三名研究人員獨(dú)立在光鏡下完成，隨機(jī)選擇高倍視野共10個(gè)，計(jì)算的陽(yáng)性細(xì)胞比例；>75記4分；50%～75%記3分；25%～50%記2分；5%～25%記1分；<5%記0分。染色強(qiáng)度：棕褐色為3分；棕黃色為2分；淺黃色或黃色為1分；無(wú)顯色為0分。蛋白表達(dá)水平=染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞比例。光鏡下以上各蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞膜或細(xì)胞漿呈棕黃色[8]。

結(jié) 果

1 各組裸鼠一般狀態(tài)比較 Siha細(xì)胞接種后，2 d裸鼠皮膚種植區(qū)呈白色，5～6 d種植區(qū)皮下可觸及2～3 mm結(jié)節(jié)，質(zhì)韌，7～8 d結(jié)節(jié)直徑達(dá)5 mm，質(zhì)地略硬。順鉑組裸鼠在7 d出現(xiàn)飲食量及活動(dòng)量明顯減少，形體消瘦，該組2只裸鼠分別治療在17、18 d死亡，解剖肝腎等內(nèi)臟未見(jiàn)明顯異常，考慮為化療不良反應(yīng)致死。其余各組裸鼠無(wú)明顯消瘦，無(wú)死亡。

2 各組裸鼠瘤重及抑瘤率比較 見(jiàn)表1。 與模型組比較，順鉑組及紫柏凝膠高、中劑量組瘤重降低(P<0.05)。與順鉑組比較，各劑量紫柏凝膠組瘤重升高(P<0.05)，抑瘤率降低(P<0.05)。與低劑量紫柏凝膠組比較，中、高劑量紫柏凝膠組瘤重降低(P<0.05)，抑瘤率升高(P<0.05)。

3 各組裸鼠移植瘤組織肉眼及鏡下觀察 肉眼觀察，移植瘤組織呈結(jié)節(jié)狀，切面呈魚肉樣，伴見(jiàn)局灶性壞死。顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞呈簇團(tuán)狀、漩渦狀生長(zhǎng)，細(xì)胞呈卵圓形或圓形，核大，見(jiàn)病理性核分裂，細(xì)胞核染色加深，見(jiàn)核固縮、溶解、碎裂瘤團(tuán)間可見(jiàn)壞死病灶形成，呈均質(zhì)紅染色樣。順鉑組腫瘤組織壞死區(qū)域增大較為明顯，紫柏凝膠各劑量組腫瘤組織壞死區(qū)域面積與劑量呈正比關(guān)系(圖1)。

表1 各組裸鼠瘤重及抑瘤率比較

注：與模型組比較， *P<0.05；與順鉑組比較，△P<0.05；與低劑量紫柏凝膠組比較，▲P<0.05

A：模型組；B：紫柏凝膠低劑量組；C：紫柏凝膠中劑量組；D：紫柏凝膠高劑量組； E：為順鉑組。箭頭所指為腫瘤壞死細(xì)胞

4 紫柏凝膠對(duì)E6、E7蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表2、3。 與模型組比較，中劑量、高劑量紫柏凝膠組及順鉑組E6蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，高劑量紫柏凝膠組及順鉑組E7蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；與順鉑組相比，紫柏凝膠各組E6表達(dá)上升(P<0.05)，紫柏凝膠各組E7表達(dá)上升(P<0.05)；與低劑量紫柏凝膠組比較，中、高劑量紫柏凝膠組E6蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，中、高劑量紫柏凝膠組E7蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。提示紫柏凝膠有下調(diào)E6、E7蛋白表達(dá)的作用(圖2)。

5 紫柏凝膠對(duì)ERK及P38/MAPK信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表2、3。

表2 各組平均陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度比較(分)

注：與模型組比較， *P<0.05；與順鉑組比較，▲P<0.05；與低劑量紫柏凝膠組比較，△P<0.05

表3 各組E6、E7、p-ERK、p-p38蛋白表達(dá)比較(分)

注：與模型組比較，*P<0.05；與順鉑組比較，▲P<0.05；與低劑量紫柏凝膠組比較，△P<0.05

與模型組比較，中、高劑量紫柏凝膠組及順鉑組p-ERK及p-p38蛋白表達(dá)均明顯下降(P<0.05)；與順鉑組比，紫柏凝膠各組p-ERK及p-p38蛋白表達(dá)上升(P<0.05)；與低劑量紫柏凝膠組比較，中、高劑量組及順鉑組蛋白表達(dá)均明顯下降(P<0.05)。提示紫柏凝膠有下調(diào)p-ERK及p-p38蛋白表達(dá)的作用(圖2)。

A：紫柏凝膠高劑量組；B：紫柏凝膠中劑量組；C：紫柏凝膠低劑量組；D：為模型組； 1：E6蛋白； 2： E7蛋白； 3：p-ERK蛋白； 4：p-p38蛋白；箭頭所指為蛋白表達(dá)

圖2 各組裸鼠E6、E7、p-ERK、p-p38免疫組化染色蛋白表達(dá)結(jié)果(免疫組化染色，×200)

討 論

中醫(yī)古籍并無(wú)“宮頸癌”這一病名，其屬于中醫(yī)“崩漏”及“癥瘕病”疾病[9]，名老中醫(yī)郭志強(qiáng)教授認(rèn)為該病的主要病機(jī)是正氣邪盛，邪毒瘀阻于胞中[10]。在宮頸癌患者手術(shù)、放化療中，采用中醫(yī)四診合參，辨證論治后治以扶正祛邪，中醫(yī)方法的干預(yù)，可有效改善宮頸癌患者生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，降低患者放化療治療的毒副作用，具有減毒增效之優(yōu)勢(shì)[11]。郭志強(qiáng)教授認(rèn)為應(yīng)在感受濕熱之邪早期針對(duì)宮頸HPV感染治以清熱利濕，解毒殺蟲，并選用清熱利濕法，并創(chuàng)立了紫草散，全方以紫草為君藥，以金銀花、苦參、黃柏、莪術(shù)為臣藥，佐以白及、百部及冰片，以兒茶為使[12]。前期研究表明紫柏凝膠具有抑制宮頸癌Siha細(xì)胞增值，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用[13]。然而其抑癌的具體機(jī)制尚不明確，并未得到更進(jìn)一步的闡明。

研究證實(shí)，HR-HPV基因由3個(gè)部分組成：早期區(qū)，晚期區(qū)，長(zhǎng)控制區(qū)。早期區(qū)(Early region，E)含E1至E7共6個(gè)基因，HR-HPV其致癌機(jī)理主要與 E6、E7 蛋白有關(guān)。 E7 與成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(Rb)腫瘤抑制蛋白結(jié)合，導(dǎo)致蛋白降解；而E6 與 p53 結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡[14]。ERK及p38參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育等生理過(guò)程。ERK及p38 是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用，ERK及p38信號(hào)通路的研究對(duì)腫瘤防治工作有重要意義[15]。

本研究采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，通過(guò)建立Siha(+)宮頸癌荷瘤裸鼠模型，研究各劑量組紫柏凝膠治療宮頸癌療效及優(yōu)勢(shì)，陰性對(duì)照組選用模型組，陽(yáng)性對(duì)照組選用順鉑組，研究結(jié)果顯示紫柏凝膠各組對(duì)宮頸癌荷瘤裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用。高、中、低劑量組的腫瘤抑制率分別為36.23%、31.24%及14.94%。研究結(jié)果表明：紫柏凝膠可下調(diào)致癌蛋白E6和E7的表達(dá)，同時(shí)阻斷ERK及p38/MAPK信號(hào)通路，下調(diào)p-ERK、p-p38蛋白的表達(dá)。ERK及P38/MAPK信號(hào)通路未必是紫柏凝膠抑制腫瘤、影響癌蛋白表達(dá)的全部?jī)?nèi)容，此過(guò)程還有哪些通路的參與尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證明。