李占鴻，廖德芳，楊振興，張 潔，肖 雷，李華春*，楊 恒*

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院 熱帶亞熱帶動物病毒重點實驗室，云南 昆明 650224；2.云南農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，云南 昆明 650224）

2012 年以來本實驗室相繼在云南省、廣東省及廣西壯族自治區(qū)相繼分離出CHUV、BCV 與DAV 3種PALV 血清型病毒株[7]。血清學調查結果顯示我國內蒙古、新疆、甘肅、江蘇、湖北、廣西、云南和海南等省自治區(qū)牛羊中CHUV 抗體陽性率介于6%（江蘇）～48.65%（海南）之間[8-9]。以上研究結果表明PALV 在我國流行范圍遍及由南（海南）至北（內蒙），由東（江蘇）至西（新疆）的廣泛區(qū)域，對我國牛羊養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展構成了潛在的威脅。

PALV 在基因組結構以及病毒形態(tài)上與同屬的藍舌病病毒（Bluetongue Virus，BTV）和鹿流行性出血病病毒（Epizootic haemorrhagic disease virus，EHDV）十分相似。PALV 的基因組由Seg-1～Seg-10 等10 個基因節(jié)段構成，可編碼VP1～VP7 等7 種結構蛋白與NS1～NS3 等3 種 非 結 構 蛋 白[10-11]。Seg-7 編 碼 的VP7蛋白構成PALV 的內層衣殼，VP7 蛋白為環(huán)狀病毒屬病毒的群特異性抗原，可誘導產(chǎn)生病毒的群特異性抗體，其核苷酸和氨基酸序列在不同血清型病毒株之間高度保守，是鑒定環(huán)狀病毒種屬最為重要候選靶序列之一[12-13]。

根據(jù)我國PALV 流行株的序列特征，建立準確、可靠的PALV 核酸檢測方法對我國PALV 感染的疫病防控工作具有重要意義。目前，國內尚未報道針對我國流行的CHUV、BCV 和DAV 3 種血清型PALV群特異性RT-PCR 檢測方法。本研究根據(jù)我國CHUV、BCV 和DAV 3 種PALV 血清型病毒株的Seg-7基因序列信息，設計針對PALV 的群特異性擴增引物，建立針對國內流行PALV 的群特異性一步法RT-PCR檢測方法，為我國PALV的快速檢測和疫病流行病學調查等提供了一種有效可靠的技術手段。

1 材料與方法

1.1 病毒株、血液樣品、細胞與質粒 2012 年～2016 年，本研究室從云南省、廣東省與廣西自治區(qū)的牛羊蟲媒病毒監(jiān)控點分離的19 株PALV[7]及相應的PALV 核酸陽性EDTA 抗凝血液樣品見表1；BTV-1/Y863[14]、EHDV-10 型（YNSZ/V277/2013）病毒株[15]與廣西環(huán)狀病毒（Guangxi orbivirus，GXOV）[16]由本實驗室分離保存；非洲馬瘟病毒（African horse sickness virus，ASHV）滅活疫苗購自世界動物衛(wèi)生組織（OIE）參考實驗室Onderstepoort Veterinary Institute：South Africa；BHK-21 細胞由本實驗室保存；CHUV 病毒株（CHUV/V144/2014）Seg-7 全長基因序列克隆質粒pLB-CHUV/V144/Seg-7 由本實驗室構建保存。

1.2 主要試劑 一步法RT-PCR 試劑盒、病毒RNA/DNA 提取試劑盒、DNA 膠回收試劑盒與DNA Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司；T7 啟動子RNA 體外轉錄試劑盒購自Promega 公司；MagMax 磁珠法病毒RNA 抽提試劑盒與RNA 純化試劑盒購自Thermo 公司；XbaⅠ限制性內切酶購自NEB 公司。

1.3 引物設計 根據(jù)本研究室前期獲得的中國PALV 株的序列[7]以及GenBanK 登錄的其它國家PALV 株的序列，選擇PALV 群保守基因Seg-7，利用Primer5.0 設計特異性RT-PCR 擴增引物： PALVS7-F：5'-GAAACATCAATYCAGCAAGGAAC-3'/PALVS7-R：5'-TCATACATAAGGTCGCACGCAA-3'，預 期擴增DNA 片段長度為388 bp，引物由上海捷瑞公司合成。

1.4 RNA 標準品的制備 使用XbaⅠ內切酶將pLBCHUV/V144/Seg-7 質粒線性化后，采用T7 啟動子RNA體外轉錄試劑盒按說明書體外轉錄，經(jīng)DNAseⅠ酶消化后，利用RNA 純化試劑盒進行轉錄ssRNA 的純化。將純化的PALV Seg-7 ssRNA 經(jīng)電泳檢測，采用Nanodrop ND-2000 測定核酸濃度，計算RNA 拷貝數(shù)后分裝于-80 ℃保存?zhèn)溆?，作為RNA 標準品。

1.5 一步法RT-PCR 擴增 使用病毒RNA/DNA 提取試劑盒提取CHUV/V144/YN/2012 株、BCV/V256/GD/V2015 株、DAV/V157/YN/2015 株核酸作為模板，參照One Step PrimeScript RT-PCR Kit 產(chǎn)品說明書，采用25 μL 反應體系，利用方陣法對引物濃度（0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L）與退火溫度（55 ℃～62 ℃）進行優(yōu)化，確定最佳反應條件，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳對擴增產(chǎn)物檢測后，將陽性擴增產(chǎn)物膠回收純化后測序分析。

表1 2012 年～2016 年我國分離的PALV 株信息Table 1 The basic isolation information of Chinese PALV strains isotated from 2012 to 2016

1.6 特異性試驗 使用病毒RNA/DNA 提取試劑盒提取CHUV、BCV、DAV、BTV-1、EHDV-10、GXOV、ASHV 滅活疫苗核酸為模板，同步提取空白BHK-21細胞核酸，作為陰性對照，按照1.5 確立的最佳反應條件進行RT-PCR 擴增，評估PALV 一步法RT-PCR 方法的特異性。

從圖1還可看出，加法口算和減法口算的發(fā)展趨勢較為一致．在這7種口算中，add12、jadd12、2-1退位、2-1不退位這4種廣度為3類型的加減法口算，學生在四~五年級的口算速度發(fā)展最快；而口算廣度為2的3種口算類型中，add11和jadd11在一~三年級發(fā)展最快，1-1不退位在二~三年級發(fā)展最快．由此可說明，小學二年級和四年級是口算速度發(fā)展的關鍵期，其中口算廣度為2的發(fā)展關鍵期在二年級，而口算廣度為3的發(fā)展關鍵期在四年級．

1.7 敏感性試驗 將PALV Seg-7 ssRNA 標準品10 倍倍比稀釋，分別取6.9×108拷貝/μL～6.9×101拷貝/μL 的RNA 為模板，經(jīng)一步法RT-PCR 擴增，確定PALV一步法RT-PCR 檢測方法的敏感性。

1.8 分離病毒的RT-PCR 檢測 使用MagMax 磁珠法病毒RNA 抽提試劑盒提取表1 所示的19 株PALV病毒核酸，利用本研究建立的PALV 群特異性一步法RT-PCR 進行擴增，分析該方法是否具有普遍適用性，能否有效檢測不同時間、不同地點分離的PALV。

1.9 血液樣品的RT-PCR 檢測 為評估本研究建立的方法能否用于檢測臨床血液樣品中的PALV 核酸。使用MagMax 磁珠法病毒RNA 抽提試劑盒提取表1 所示的19 株PALV 對應的EDTA 抗凝血液樣品核酸，利用本研究建立的PALV 群特異性一步法RT-PCR 方法進行檢測。

2 結 果

2.1 RNA 標準品的制備 使用限制性內切酶XbaⅠ將PLB-CHUV/V144/Seg-7 質粒線性化后體外轉錄，通過DNAseⅠ酶消化去除殘留的線性化質粒，以RNA 純化試劑盒純化后經(jīng)電泳檢測，結果顯示轉錄出大小約1 150 bp 的ssRNA 條帶，與預期相符（圖略）。測定ssRNA 核酸濃度為450 ng/μL。根據(jù)RNA拷貝數(shù)計算公式“ssRNA 拷貝數(shù)（拷貝/μL）=（6.02×1023）×RNA 濃度（ng/μL）×10-9/（RNA length×340）”，計算出轉錄的PALV Seg-7 ssRNA 拷貝數(shù)為：6.9×1011拷貝/μL 作為標準品。

2.2 PALV 一步法RT-PCR 檢測方法的建立 分別對PALV 一步法RT-PCR 的退火溫度與引物濃度進行優(yōu)化，優(yōu)化結果為：最佳引物濃度為0.8 μmol/L，最佳退火溫度為56 ℃。反應體系為：12.5 μL 2×1 step Buffer，1 μL PrimeScript 1 step Enzyme Mix，上、下游引物各1 μL（0.8 μmol/L），5 μL RNA 模板，加水 補 齊 至25 μL；PCR 反 應 程 序 為：50 ℃30 min；94 ℃2 min；94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。以提取的CHUV、BCV 與DAV的核酸為模板，進行一步法RT-PCR 擴增，結果顯示擴增產(chǎn)物約為388 bp，符合預期大?。▓D1）。將擴增產(chǎn)物的測序結果在NCBI 網(wǎng)站進行BLAST 比對分析，結果顯示3 種擴增產(chǎn)物與PALV Seg-7 基因的核酸序列相似度均在98%以上，表明PALV 一步法RT-PCR 檢測方法初步建立。

圖1 CHUV、BCV 與DAV Seg-7 基因的RT-PCR 擴增結果Fig.1 Amplification for the Seg-7 gene of CHUV,BCV and DAV by RT-PCR

圖2 RT-PCR 的特異性試驗結果Fig.2 Specificity test of the RT-PCR

2.3 特異性試驗結果 分別以提取的CHUV、BCV、DAV、BTV-1、EHDV-10、GXOV 與ASHV 滅活疫苗的RNA 為模板，經(jīng)一步法RT-PCR 擴增，結果顯示僅PALV 的核酸模板擴增出符合大小的目的片段，BTV、EHDV、GXOV 和ASHV 疫苗核酸擴增結果均為陰性（圖2），表明該方法具有較強的特異性。

2.4 敏感性試驗結果 將PALV Seg-7 ssRNA 標準品10 倍倍比稀釋，分別取6.9×108拷貝/μL～6.9×101拷貝/μL 的核酸為模板，經(jīng)一步法RT-PCR 擴增。結果顯示，該方法對Seg-7 ssRNA 的檢測下限為6.9×101拷貝/μL（圖3）。表明本研究建立的PALV一步法RT-PCR 檢測方法具有較高的敏感性。

2.5 分離病毒的檢測 對本實驗室分離并保存的12 株CHUV、4 株DAV 與3 株BCV 共計19 株PALV 病毒株經(jīng)一步法RT-PCR 檢測，結果顯示19 株病毒的檢測結果均為陽性，表明該方法可有效檢測不同時間、不同地點分離的PALV。

2.6 血液樣品檢測結果 提取表1 所示的19 株PALV對應的EDTA 抗凝血液樣品核酸經(jīng)一步法RT-PCR檢測，結果顯示19 份血液樣品的檢測結果均為陽性，與病毒分離結果[7]完全一致（表2），表明本研究建立的PALV 群特異性RT-PCR 檢測方法可用于檢測臨床血液樣品。

圖3 RT-PCR 的敏感性試驗Fig.3 Sensitive test of the RT-PCR assay

表2 血液樣品RT-PCR 檢測結果與病毒分離結果的比較Table 2 The comparison of detection results for both RT-PCR and virus isolation

3 討 論

目前，PALV 的檢測方法主要包括：病原分離、血清抗體檢測及病毒核酸檢測等方法。其中病原分離存在工作量大、耗時長等缺點，不便于病原的快速檢測和開展大規(guī)模流行病學調查；抗體檢測方法包括經(jīng)典的病毒中和試驗[12]、瓊脂免疫擴散試驗[17]、競爭ELISA[18]等，雖然以上血清抗體檢測方法可同時進行大量樣品的檢測，但是血清抗體的產(chǎn)生相對于病毒感染存在一定的滯后性，因此不利于疫病的早期診斷和防控[19]。Aradaib 建立的PALV 核酸巢式PCR 檢測方法雖然具有較高的敏感性，但需要二次PCR 擴增，存在耗時較長，容易出現(xiàn)假陽性結果的問題；一步法RT-PCR 檢測方法，反轉錄與PCR 擴增一步完成，減少了操作步驟，縮短檢測時間的同時，降低了檢測過程中發(fā)生污染的可能性，提高了檢測結果的準確性。

PALV 與BTV、EHDV、GXOV 同屬于環(huán)狀病毒屬成員，均可通過庫蠓的叮咬傳播感染牛；ASHV雖僅感染馬屬動物，但遺傳進化分析表明，ASHV與PALV 具有最近的親緣關系[20]。因此保證PALV 群特異性檢測方法的特異性，對疫病的準確診斷十分重要。特異性試驗結果顯示本研究建立的PALV 特異性RT-PCR 檢測方法對BTV、EHDV、GXOV 與ASHV 均無擴增，具有較強的特異性。

關于RNA 病毒RT-PCR 檢測方法的敏感性試驗，有文獻報道使用倍比稀釋的重組質?；虮侗认♂尩牟《疽禾崛『怂嶙鳛槟０暹M行測試。但使用重組質粒為模板進行RT-PCR 擴增，并不能反映RT-PCR 檢測方法對RNA 模板的真實擴增效率；同時，將病毒液高倍稀釋后可能存在核酸提取效率降低的問題[21-22]。因此本研究采用體外轉錄的方法制備PALV Seg-7 ssRNA 作為標準品進行敏感性試驗，得出的結果更為準確可靠。

由于存在內外兩層衣殼蛋白的保護，環(huán)狀病毒屬的病毒粒子可在4 ℃冷藏條件下保藏數(shù)年之久[7,23]。在對2012 年～2016 年采集的19 份分 離出PALV 的血液樣品進行檢測時，結果顯示CHUV/SZ187、CHUV/V144 與CHUV/V078 株等3 份血液樣品擴增條帶較弱，推測可能是血液樣品在4 ℃存放時間過長，致使血液中PALV 的病毒核酸發(fā)生部分降解，導致RT-PCR 擴增條帶較弱。本研究建立了針對國內流行PALV 的群特異性一步法RT-PCR 檢測技術，該方法可對細胞培養(yǎng)的PALV 及PALV 核酸陽性血液樣品進行檢測，為我國PALV 的快速檢測和疫病的早期診斷、流行病學調查等提供了一種有效可靠的技術手段。