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蜂毒素靶向PTEN/PI3K/Akt 信號通路調(diào)控非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡

2020-06-05 11:06:00李玲霞張英民
吉林中醫(yī)藥 2020年4期
關(guān)鍵詞:毒素引物肺癌

李玲霞,張英民

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,河南 洛陽 471000)

肺癌是一類世界范圍內(nèi)常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤,其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中都居于首位[1]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是最常見的一類肺癌類型,占肺癌總發(fā)病率的80%左右[2]。肺癌發(fā)病前期并無明顯臨床癥狀,因此往往確診時已經(jīng)是晚期。腫瘤細(xì)胞的異常增殖是腫瘤惡化的主要原因,而大部分腫瘤細(xì)胞的無限增殖能力是通過死亡逃逸獲得的[3],因此,尋找安全有效的靶點誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡,抑制細(xì)胞的增殖成了腫瘤研究的熱點。

蜂毒是蜜蜂工蜂分泌的一種毒液,蜂毒素(Melittin,Mel)是從蜂毒中提取的一種小分子蛋白,具有抗菌、抗病毒及抗炎鎮(zhèn)痛作用[4],蜂毒素對多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用,且作用靶點多樣化,包括直接殺傷細(xì)胞、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞血管生成等方面[5-6]。本研究中,我們探討了蜂毒素對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響,并探討了其可能存在的作用機(jī)制,為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療尋找更安全、有效的治療手段。

1 材料與方法

1.1 實驗用細(xì)胞與試劑 人源性非小細(xì)胞肺癌系A(chǔ)549 購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;蜂毒素購自上海吉爾公司;含雙抗的RPMI1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hy Clone 公司,MTT 試劑盒、Annexin V FITC/PI試劑盒購自美國BD 公司;兔抗人PTEN、p-PI3K 多克隆抗體、鼠抗人p-Akt 單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體均購自美國Santa Cruz 公司,p53、CytC 及內(nèi)參序列由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成,Trizol 購自美國Invitrogen 公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代 將凍存的A549 細(xì)胞復(fù)蘇、重懸于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中,于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部70%以上時,將細(xì)胞用胰蛋白酶消化、重懸,按1:3 比例進(jìn)行傳代培養(yǎng),取傳代后對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 MTT 檢測細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)期細(xì)胞接種于96 孔板,調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升1×106個,按照實驗設(shè)計將細(xì)胞分為4 組,分別為對照組、Mel 低劑量組、Mel 中劑量組和Mel 高劑量組,依次向各組細(xì)胞內(nèi)加入不同濃度的蜂毒素,調(diào)整最終濃度為0、1、2、4 mg/L,每個濃度組設(shè)置5 個復(fù)孔。將各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h 后,加入20 μL 的MTT 試劑,培養(yǎng)箱中孵育4 h,離心,棄上清液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μL,充分震蕩至澄清無結(jié)晶,于紫外分光光度計480 nm 波長處測吸光度(OD 值),增殖抑制率(%)=(1-處理組OD/對照組OD 值)×100%。

1.4 Annexin V FITC/PI 聯(lián)合流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將對數(shù)期細(xì)胞接種至6 孔板,調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升5×105個,每孔內(nèi)加細(xì)胞懸液2 mL,按1.3 所示分組,繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后,胰蛋白酶消化細(xì)胞,預(yù)冷PBS 洗滌2 次,離心,將細(xì)胞重懸于200 μL Binding Buffer 中,加入5 μLAnnexin V-FITC 混勻,室溫條件下避光反應(yīng)15 min,繼續(xù)加入300 μLBinding Buffer,上流式細(xì)胞儀前加入5 μLPI,之后1 h 內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.5 Western Blot 檢測細(xì)胞內(nèi)PTEN、p-PI3K 和p-Akt蛋白表達(dá) 將對數(shù)期細(xì)胞接種至6 孔板,調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升5×105個,每孔內(nèi)加細(xì)胞懸液2 mL,按1.3所示分組,繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后,胰蛋白酶消化細(xì)胞,二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行蛋白定量,取30 μg 待測樣本蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳,轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,加入封閉液搖床孵育2 h,加入稀釋一抗(1:1 000),4 ℃搖床過夜,加入稀釋二抗(1:5 000),常溫孵育2 h,洗膜后暗室中曝光顯影。以內(nèi)參β-actin為對照,采用Quality One 分析條帶灰度值,以目的蛋白灰度值與β-actin 比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.6 RT-PCR 檢測細(xì)胞內(nèi)p53 和CyclinD1 基因表達(dá) 將對數(shù)期細(xì)胞接種至6 孔板,調(diào)整細(xì)胞密度為每毫升5×105個,每孔內(nèi)加細(xì)胞懸液2 mL,按1.3 所示分組,繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后,胰蛋白酶消化細(xì)胞,Trizol 提取總RNA,異丙醇處理后收集RNA 沉淀,75%乙醇洗滌,離心,棄上清液,DEPC 水溶解RNA。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明,以β-actin 為內(nèi)參進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,反應(yīng)條件:95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,共35 個循環(huán);72 ℃總延伸6 min。取5 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,進(jìn)行灰度掃描分析,比較目的基因與β-actin 條帶灰度之比。引物序列:p53 上游引物:5’-TCGGATTCGGATCGATCGGC-3;下游引物:5’-GCTTAGCTTTCGATCGGATC-3’;CyclinD1 上游引物:5’-TAGCTTTGCTAGCCTACGAT-3;下游引物:5’-TAGCTATTGCTAGGGGCTTA-3’;GAPDH 上 游引物:5’-TAGCTTTAGCTAGGGCTTAG-3;下游引物:5’-TAGCTTTAGCTAGCTTTAGC-3’。

1.7 統(tǒng)計分析 用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析;計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組計量資料間的比較用ANOVA檢驗,組內(nèi)兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 實驗結(jié)果

2.1 蜂毒素對A546 細(xì)胞增殖活性的影響 MTT 實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,各個時間點的蜂毒素處理組細(xì)胞的增值抑制率顯著增加(P<0.05),且抑制效果與藥物濃度呈正相關(guān);Melittin 低劑量組24 h 和48 h 間抑制率無顯著性差異(P>0.05),而72 h 抑制率顯著高于24 h(P<0.05),同時,中劑量和高劑量組的抑制效果隨著培養(yǎng)時間的延長而增加,呈時間依賴性(P<0.05)(見圖1)。

圖1 各組A549 細(xì)胞增殖抑制率

2.2 蜂毒素對A546 細(xì)胞凋亡的影響 蜂毒素作用組細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.05),且隨著藥物濃度的增加,凋亡率隨之增加(P<0.05),各藥物濃度組間存在顯著性差異(P<0.05)(見圖2)。

圖2 各組細(xì)胞凋亡率

2.3 蜂毒素對A546 細(xì)胞PTEN、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)的影響 蜂毒素作用組細(xì)胞PTEN 的蛋白表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05),而p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)量顯著低于對照組(P<0.05),同時,隨著藥物濃度的增加,蜂毒素對PTEN 表達(dá)的誘導(dǎo)作用和對p-PI3K 和p-Akt 的抑制作用隨之增加,各藥物劑量組之間存在顯著性差異(P<0.05)(見圖3,表1)。

圖3 各組細(xì)胞PTEN、p-PI3K 和p-Akt 蛋白表達(dá)

表1 各組細(xì)胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)(,n=5)

表1 各組細(xì)胞PTEN、p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)(,n=5)

注:與對照組比較,# P <0.05;與Mel 低劑量組比較,△P <0.05;與Mel 中劑量組比較,▲P <0.05

2.4 蜂毒素對A546 細(xì)胞p53 和CyclinD1 mRNA 表達(dá)的影響 蜂毒素作用組細(xì)胞內(nèi)p53 mRNA 的表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05),隨著藥物濃度的增加,表達(dá)量遞增(P<0.05);蜂毒素作用組細(xì)胞內(nèi)CyclinD1 mRNA 的表達(dá)顯著弱于對照組(P<0.05),隨著藥物濃度的增加而遞減(P<0.05)(見表2)。

表2 各組細(xì)胞p53 和CyclinD1 mRNA 表達(dá)水平比較(,n=5)

表2 各組細(xì)胞p53 和CyclinD1 mRNA 表達(dá)水平比較(,n=5)

注:與對照組比較,# P <0.05;與Mel 低劑量組比較,△P <0.05;與Mel 中劑量組比較,▲P <0.05

3 討論

蜂毒素是從蜂毒中提取出來的活性物質(zhì),具有多種生物學(xué)功能,其抗腫瘤作用已在多種腫瘤細(xì)胞中得到證實,蜂毒素能抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖,同時促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[5-9]。本研究中,我們檢測了不同濃度蜂毒素對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 增殖、凋亡的影響,結(jié)果顯示,低劑量蜂毒素即能有效抑制其增殖活性,這種作用隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長而加強(qiáng),同時,蜂毒素能顯著促進(jìn)A549 細(xì)胞的凋亡,這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。以上實驗結(jié)果表明,蜂毒素對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞有生長抑制作用,為了進(jìn)一步了解蜂毒素對A549 細(xì)胞的作用機(jī)制,我們進(jìn)一步探討了其對A549 細(xì)胞中PTEN/PI3K/Akt 通路相關(guān)分子表達(dá)的影響。

人第10 號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物(Gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)是目前已知的能抑制腫瘤活性的磷酸酶[10],磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/絲氨酸—蘇氨酸激酶(Protein kinase B,Akt)信號通路在腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用,其異?;钅艽龠M(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞的凋亡[11]。有研究證實,在腫瘤細(xì)胞中,PTEN 通過其脂質(zhì)磷酸酶活性作用于PI3K/Akt 通路,阻斷該通路活性從而發(fā)揮抑癌作用[12]。在肺癌細(xì)胞的一項研究中發(fā)現(xiàn),PI3K 抑制劑GSK2636771 能抑制PTEN 表達(dá)缺失的肺癌細(xì)胞株的增殖并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,將載有PTEN 基因的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞后,PI3K 抑制劑對肺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響增強(qiáng),說明該通路在肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡過程中發(fā)揮重要作用[13]。有報道稱,蜂毒素能上調(diào)HepG2 肝癌細(xì)胞中PTEN 并抑制下游Akt 通路的激活,從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡,抑制其增殖[14]。基于以上理論,本研究中,我們探討了蜂毒素對A549 細(xì)胞中PTEN/PI3K/Akt 通路中相關(guān)分子表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,蜂毒素能刺激A549 細(xì)胞中PTEN 的表達(dá),同時抑制PI3K 和Akt的磷酸化,且這種作用隨著藥物劑量的增加而加強(qiáng),說明蜂毒素能有效調(diào)控A549 細(xì)胞內(nèi)PTEN/PI3K/Akt 通路的活性。

為了進(jìn)一步探討蜂毒素對A549 細(xì)胞的作用機(jī)制,我們檢測了蜂毒素對PTEN/PI3K/Akt 通路兩個重要的下游因子的作用。p53 是PI3K/Akt 信號通路的一個下游抑癌基因,p53 被活化后能通過上調(diào)Caspase-3 和Caspase-9 而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,PI3k/Akt 通路的活化能引起p53的降解,從而影響細(xì)胞凋亡[15],同時有研究證實,p53 介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡在肺癌細(xì)胞的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[16]。cyclinD1 是PI3K/Akt 通路的另一下游分子,其過表達(dá)時能導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖,細(xì)胞周期發(fā)生異常變化,對肺癌細(xì)胞的增殖起到重要作用[17]。本研究中我們發(fā)現(xiàn),蜂毒素能誘導(dǎo)A549 細(xì)胞中p53 蛋白的表達(dá),而抑制cyclinD1 的表達(dá),且這種作用呈劑量依賴性,說明蜂毒素可能時通過抑制PTEN/PI3K/Akt的活性,從而刺激p53 的表達(dá),抑制cyclinD1 的表達(dá)而對A549 細(xì)胞發(fā)揮作用的。

綜上所述,蜂毒素能抑制A549 細(xì)胞的增殖,促進(jìn)其凋亡,這種作用可能是通過調(diào)控PTEN/PI3K/Akt信號通路相關(guān)分子的表達(dá)而實現(xiàn)的。

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