劉 英，曾琪瑤，曾炳山，黃烈鍵，何衛(wèi)忠，何碧紅

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520；2.廣東省九連山林場，廣東 河源 517100； 3.廣東省沙頭角林場，廣東 深圳 518081）

南洋楹Albizia falcataria為速生樹種，其樹干通直、圓滿，材質(zhì)穩(wěn)定，易于加工，為制作膠合板、造紙等優(yōu)質(zhì)原料[1]；其根系發(fā)達(dá)，具固氮作用，落葉量大且易腐爛分解，亦是改良土壤的良好樹種[2]。我國于1940年前后開始引進(jìn)南洋楹，在廣東電白、增城、惠東、龍門等地均有種植，種植面積約 2.0×104hm2[3]。

南洋楹是一個典型的熱帶樹種，具有畏寒喜暖的習(xí)性，其抗寒性較差，限制了其擴(kuò)大栽培。選擇速生、抗寒的優(yōu)良無性系，是降低寒害風(fēng)險(xiǎn)、提高造林效益的主要措施之一。近年來，中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所對早期引種林分進(jìn)行了單株選優(yōu)及無性系化[4-6]，利用若干無性系營造幾千畝南洋楹試驗(yàn)示范林。初步觀察發(fā)現(xiàn)，各無性系抗寒性差異明顯。植物的低溫危害包括冷害和凍害，前者由0 ℃以上的低溫引起，后者則由0 ℃以下的低溫造成。不同種類植物、同種植物不同無性系對低溫脅迫表現(xiàn)出抗寒性差異，亦伴隨著不同抗寒生理指標(biāo)的變化[7-8]。黃章平等[9]對1、2年生南洋楹幼林進(jìn)行寒害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，1年生幼樹在遭遇5 ℃氣溫時即可能受到冷害，0 ℃以下低溫持續(xù)時間長可致整株死亡。調(diào)查了0.5 ～2.5年生南洋楹種源/家系試驗(yàn)林的耐寒情況，發(fā)現(xiàn)南洋楹在連續(xù)10 d 出現(xiàn)1 ～8 ℃的氣溫天氣時出現(xiàn)枝葉干枯等現(xiàn)象[10]。為了更好地了解南洋楹的耐寒性，促進(jìn)其種植業(yè)發(fā)展，本研究選擇9 個生長表現(xiàn)較好的南洋楹無性系，開展苗期抗寒性的測定，依據(jù)相對電導(dǎo)率（REC）、脯氨酸（PRO）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性3 個抗寒生理指標(biāo)，初步篩選出一批抗寒性較強(qiáng)的無性系應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為A1、A8、TL17、TL18、B7、D12、S4、S5 和S7 等9個優(yōu)良南洋楹無性系的組培苗。選取長勢較好、無病蟲害、規(guī)格較為一致（高度約50 cm）的苗木，于2017年12月在中國科學(xué)院華南植物園放入智能人工氣候箱進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 低溫脅迫處理

參試苗木共135 株，即9 個無性系，5 個溫度處理，分3 批次（3 次重復(fù)）開展試驗(yàn)。具體而言，每次試驗(yàn)每個無性系處理5 株，除了對照（常溫，25 ℃）1 株，另將4 株幼苗放入濕度約65%、溫度誤差為±0.5 ℃的智能人工氣候箱（RXZ 型，寧波江南儀器廠生產(chǎn)）中，依次經(jīng)過6 h 的6、4、2、0 ℃溫度處理后，每個低溫處理選取1 株幼苗，取樣測定相對電導(dǎo)率（REC）、脯氨酸（PRO）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3 取樣測定

對于每株參試幼苗，經(jīng)上述試驗(yàn)處理后，選取其頂芽以下第1 ～3 片發(fā)育完滿、無病蟲害的健康復(fù)葉，用蒸餾水沖洗，吸干表面水分，進(jìn)行生理指標(biāo)的測定。

REC 的測定參考陳建勛等的方法[11]，具體而言，常溫或低溫脅迫后，每個樣品提取0.5 g 葉片，加入15 mL 去離子水，浸提30 min，用上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的DDS-307A 型電導(dǎo)率儀測定溶液煮沸前的電導(dǎo)率EC1，薄膜封口后，置于100 ℃的恒溫浴鍋中煮20 min，自然冷卻至室溫后，測定煮沸后的電導(dǎo)率EC2。依據(jù)如下公式計(jì)算REC：

REC=(EC1-EC0)/(EC2-EC0)。

式中：EC1和EC2分別為煮沸前、后的電導(dǎo)率；EC0為去離子水的電導(dǎo)率。

PRO 含量采用茚三酮比色法測定[12]，SOD 活性的測定參照Giannopolitis & Ries 的方法[13]。

形態(tài)觀察：低溫脅迫處理的苗木采樣后置于常溫4 h，觀察其葉片形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel 和SPSS18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下南洋楹幼苗葉片的形態(tài)觀察

9 個無性系分別在6、4 ℃溫度下處理6 h，經(jīng)室內(nèi)4 h 恢復(fù)后，葉片形態(tài)未出現(xiàn)冷害癥狀；在2 ℃ 溫度下處理6 h 后，出現(xiàn)不同程度的黃化落葉，其中S5、S7、TL18 黃化落葉率為10%～15%，其它無性系黃花落葉率為20%～30%。在0 ℃處理6 h后，所有無性系均出現(xiàn)頂芽死亡。由此可見，9 個南洋楹無性系的抗寒性差異主要表現(xiàn)在0 ～2 ℃。

2.2 低溫脅迫對南洋楹幼苗葉片相對電導(dǎo)率（REC）的影響

隨著溫度的降低，9 個南洋楹無性系的幼苗REC 表現(xiàn)出2 種變化趁勢：B7、S7、D12、S5、TL18、A1 無性系先上升后下降再上升；TL17、S4、A8 無性系單調(diào)上升（表1）。9 個無性系的REC 均在25 ℃時最低，0 ℃時最高。無性系TL17和A8 分別在溫度降至2 ℃和4 ℃時，其REC 才顯著升高（P＜0.05）；其它7 個無性系在溫度降至6 ℃時即顯著升高。

表1 系列低溫處理下9 個南洋楹無性系的相對電導(dǎo)率（REC）?Table 1 Relative electronic conductivity of nine Albizia falcatariaclones under a serial of low temperature treatments %

同一溫度下不同無性系之間，REC 亦存在顯著差異。如，25 ℃時，S5 的REC 最小，與TL18差異不顯著（P≥0.05），而顯著低于其它無性系；A8 最大，顯著高于其它無性系。0 ℃時，無性系S5、S7 的REC 最小，與TL18、A1、D12 差異不顯著，而顯著低于其它無性系；A8 最大，與B7、TL17、S4 差異不顯著，顯著高于其它無性系。9 個南洋楹無性系0 ℃時的REC 從小到大的排序?yàn)椋篠5 ＜S7＜TL18 ＜A1 ＜D12 ＜S4 ＜B7 ＜TL17 ＜A8。

2.3 低溫脅迫對幼苗葉片脯氨酸（PRO）含量的影響

各無性系隨著溫度的降低，PRO 含量整體上呈現(xiàn)上升趨勢（表2）。在25 ℃時，9 個無性系的PRO 含量均相對較低，但無性系間差異顯著 （P＜0.05）；0 ℃時，9 個無性系的PRO 含量均達(dá)到最高值，無性系間PRO 含量差異顯著，以A8為最高，與A1 差異不顯著（P≥0.05），而顯著高于其它無性系；TL17 最低，與S7、D12、S4 和TL18 差異不顯著，顯著低于其它無性系。

PRO 從25 ℃降至0 ℃的過程中增幅差異明顯。TL17 和A1 無性系呈緩慢遞增趨勢，在0 ～ 25 ℃區(qū)間無顯著差異，增幅較?。籇12 呈現(xiàn)先升后降的趨勢；B7、A8 呈現(xiàn)先升高后趨于穩(wěn)定；S7、S4、S5、TL18 呈現(xiàn)先變化緩慢后急劇升高的趨勢。無性系PRO 含量增幅從小到大的排序如下：D12 ＜TL17 ＜A1 ＜S4 ＜B7 ＜TL18 ＜S7 ＜ S5 ＜A8。

表2 低溫脅迫下9 個南洋楹無性系的脯氨酸（PRO）含量Table 2 Response of PRO contents of nine Albizia falcatariaclones under low temperature stress μg·g-1

2.4 低溫脅迫對幼苗葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

各無性系SOD 活性隨著溫度的降低變化規(guī)律不明顯（表3）。在每個溫度下，各無性系間SOD 活性均差異顯著（P＜0.05）。常溫（25℃）時，S7 與S5 含量最高，與S4、D12、TL18 差異不顯著（P≥0.05），顯著高于A1、B7、TL17、A8；0 ℃時，僅S4 顯著高于A8，與其它無性系差異不顯著。整體而言，S7、S5、S4、D12 和TL18 的SOD 活性高，TL17、A8、B7 和A1 的SOD 活性低。

2.5 抗寒指標(biāo)間的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果（表4）表明，REC 與25 ℃下的SOD 活性顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），并隨溫度降低相關(guān)性減弱；2 ℃與25 ℃下的PRO 含量呈顯著正相關(guān)；從25 ℃降至0 ℃ PRO 含量增幅與0 ℃下的PRO 含量極顯著相關(guān)（P＜0.01），與0 ℃下的SOD 活性顯著負(fù)相關(guān)，而與25 ℃下的PRO 含量相關(guān)不顯著（P≥0.05）。

2.6 南洋楹無性系抗寒性評價

隨著處理溫度的降低，以REC 的變化規(guī)律最為明顯，PRO 含量和SOD 活性的規(guī)律性相對較弱，因此選擇REC 進(jìn)行南洋楹無性系抗寒性評價。應(yīng)用K-均值聚類法進(jìn)行聚類分析，將9 個無性系分為3 類（表5）。S7、S5、TL18 聚為一類，屬于最抗寒的無性系；A8 單獨(dú)聚為一類，屬于抗寒性最差的無性系；A1、S4、D12、TL17、B7 等其它5 個無性系抗寒性居中。表5 列出了各類無性系的REC 以及PRO 含量和SOD 活性差異。

表3 低溫脅迫下9 個南洋楹無性系的超氧化物歧化酶（SOD）含量變化Table 3 Response of SOD contents of nine Albizia falcatariaclones under low temperature stress U·g-1

表4 REC 及PRO 和SOD 含量的相關(guān)性分析（Pearson 系數(shù)）?Table 4 Relationship between REC and contents of PRO and SOD (Pearson coefficient)

表5 南洋楹無性系抗寒性分類與評價Table 5 Classification and evaluation of Albizia falcataria clones based on cold resistance

3 討 論

植物受到低溫脅迫時，會引起細(xì)胞膜透性增大，電解質(zhì)外滲，相對電導(dǎo)率（REC）升高[15]，REC 與耐寒性呈負(fù)相關(guān)。本研究采用REC 指標(biāo)反映細(xì)胞膜的受損傷程度，發(fā)現(xiàn)抗寒性相對較差的無性系A(chǔ)8、S4、TL17 呈單調(diào)上升趨勢，其0 ℃時的相對電導(dǎo)率亦較高，可能與其細(xì)胞透性變化不可逆轉(zhuǎn)、恢復(fù)能力差有關(guān)；而抗寒性較強(qiáng)的無性系S5、S7、TL18、A1、D12、B7 呈先上升后下降再上升的趨勢，尤其是S5、S7，其0 ℃時相對電導(dǎo)率最小，抗寒性最強(qiáng)，說明其細(xì)胞膜透性變化可逆轉(zhuǎn)，易恢復(fù)。

低溫脅迫下，為防止細(xì)胞過度失水，植物通過主動積累細(xì)胞內(nèi)可溶性物質(zhì)來降低細(xì)胞液的滲透勢[16]?？扇苄晕镔|(zhì)主要包括脯氨酸（PRO）、可溶性糖及可溶性蛋白等，為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以保持原生質(zhì)膠體性質(zhì)及組織內(nèi)代謝過程的穩(wěn)定，是一種自我保護(hù)物質(zhì)[17]。然而，其含量高低與抗寒性的相關(guān)性仍存在爭議，一些學(xué)者認(rèn)為含量與抗寒性呈正相關(guān)[15]，也有人認(rèn)為PRO 含量不是越高越好，過量的PRO 會產(chǎn)生傷害效應(yīng)，是一把“雙刃劍”[18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從25 ℃降至0 ℃時PRO 含量增幅與25 ℃下的PRO 含量相關(guān)不顯著（P≥0.05），而與0 ℃時的PRO 含量極顯著相關(guān)（P＜0.01），說明PRO 含量增幅主要取決于0 ℃時的PRO 含量，由此可見，PRO含量增幅反映其對低溫脅迫的防御能力。從25 ℃降至0 ℃時，PRO 含量增幅以TL18、S7、S5、A8 最高，其增幅均在1 倍以上。前3 個無性系在0 ℃時的電導(dǎo)率也最低，說明其對低溫脅迫的耐受能力高，而且恢復(fù)能力強(qiáng)；而A8 的電導(dǎo)率最高，顯示其抗寒性差，但受適度脅迫后恢復(fù)能力強(qiáng)。

低溫脅迫下植物細(xì)胞膜損傷，釋放活性氧自由基（O2-），形成氧化脅迫。當(dāng)發(fā)生氧化脅迫時，SOD、POD、CAT 等抗氧化酶會相互作用清除O2-，避免超氧自由基對膜的傷害，從而降低細(xì)胞膜的受損傷程度[19]，其含量高低說明其清除活性氧的能力，亦與抗寒性密切相關(guān)[20]?？寡趸钚栽礁?，植物抵御低溫引起的氧化脅迫能力越強(qiáng)。SOD 的相關(guān)研究比較多，其變化規(guī)律較為復(fù)雜，其隨低溫脅迫增強(qiáng)一般表現(xiàn)出先升后降的單峰變化趨勢[21]，一些植物表現(xiàn)出雙峰變化趨勢[22]。本研究中，9 個南洋楹無性系的SOD 活性變化多樣，沒有明顯的規(guī)律性，不宜直接用于評定南洋楹的抗寒性，與高京草等[15]對棗樹的研究結(jié)果一致。高福元等[23]研究4 種彩葉植物SOD 活性對冬季低溫的響應(yīng)亦得出，SOD 活性的高低與植物抗寒性強(qiáng)弱無直接關(guān)系。0 ℃下的南洋楹葉片REC 與 25 ℃下的SOD 活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說明南洋楹葉片SOD 活性對于低溫脅迫的響應(yīng)相對較弱，其抗寒性取決于常溫下的SOD 含量。SOD 活性無明顯變化規(guī)律，可能與SOD 不是南洋楹清除O2-的主要酶有關(guān)，需要研究低溫脅迫對POD、CAT 等其它酶的影響，才能更為有效地評價南洋楹無性系清除O2-的能力強(qiáng)弱。

植物受低溫脅迫的抗寒性強(qiáng)弱，主要受細(xì)胞膜受損程度、啟動細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)合成的強(qiáng)弱程度、清除活性氧自由基O2-的能力的影響。許多植物抗寒性研究表明，抗寒生理指標(biāo)間存在相關(guān)性，而且相關(guān)性與試驗(yàn)材料有關(guān)，王樹剛等[24]即用生理生化指標(biāo)相關(guān)性及主成分分析評價不同小麥品種的抗寒性。本研究發(fā)現(xiàn)，南洋楹相對電導(dǎo)率變化比較明顯，為抗寒性的主要因子，其次是PRO，再者是SOD。3 項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律相關(guān)性有時達(dá)到顯著水平。因此，在研究經(jīng)費(fèi)足夠的條件下，今后宜采用更多生理生化指標(biāo)評價南洋楹無性系的抗寒性。

4 結(jié) 論

1）南洋楹無性系的相對電導(dǎo)率（REC）隨著溫度的降低呈現(xiàn)兩種變化趨勢：抗寒性相對較差的無性系A(chǔ)8、S4、TL17 呈單調(diào)上升趨勢，其0 ℃ 時的REC 亦較高；抗寒性較強(qiáng)的無性系S5、S7、TL18、A1、D12、B7 呈先上升后下降再上升的趨勢，尤其是S5、S7，其0 ℃時REC 最小，抗寒性最強(qiáng)。

2）無性系隨著溫度的降低，南洋楹葉片脯氨酸（PRO）含量整體上呈現(xiàn)上升趨勢，無性系間差異顯著，從25 ℃降至0℃時，PRO 含量增幅以TL18、S7、S5、A8 最高，其增幅均在1 倍以上，細(xì)胞的修復(fù)能力最強(qiáng)。D12、S4 增幅少于50%，細(xì)胞的修復(fù)能力弱。

3）南洋楹無性系的葉片超氧化物歧化酶（SOD）活性隨著溫度的降低變化規(guī)律不明顯，而且在0 ℃時各無性系間差異大多不顯著，不宜用于南洋楹抗寒性評價。

4）通過聚類分析得出，9 個測試無性系中，S7、S5、TL18 的抗寒性最強(qiáng)，A8 最差，與大田無性系示范林觀察結(jié)果基本一致[6]。