莊其宏，陳嵐蘭，盧 芳，黃申暉

廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科，福建 廈門361003

近年來，隨著城市化和工業(yè)化的發(fā)展，人們生活水平提高的同時(shí)，多種疾病的發(fā)生率也在不斷上升[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年有100多萬人死于肺癌[2]，肺癌主要包括小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SСLС）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSСLС），后者包括鱗狀細(xì)胞癌、腺癌及大細(xì)胞癌。近年來，肺癌的治療取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，除傳統(tǒng)治療手段（手術(shù)、化療、放療）外，靶向治療的興起也為肺癌的臨床治療提供了一種新的方法。在各種類型的肺癌中，NSСLС最常見，占全部肺癌的80%～90%[3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)NSСLС的研究不僅僅停留在藥物治療上，在發(fā)病機(jī)制上也有了深層次的了解[4]。表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因過表達(dá)或突變均會(huì)影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)展。研究表明，EGFR基因是NSСLС靶向治療中最重要的靶點(diǎn)之一，且EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）已成為治療NSСLС的重要藥物之一[5]。然而臨床中發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKI治療數(shù)月后NSСLС患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的耐藥，因此目前關(guān)于其耐藥機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)[6]。研究發(fā)現(xiàn)，notch受 體1（notch receptor 1，NOTСH1）基因 參 與NSСLС的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)NOTCH1基因也與靶向藥物的耐藥性有關(guān)[7]。本研究通過免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)NSСLС組織中NOTСH1的表達(dá)情況及其與患者臨床特征和EGFR基因突變狀態(tài)的關(guān)系，旨在探討EGFR-TKI的耐藥機(jī)制，為NSСLС的靶向藥物治療提供新思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2017年3月至2018年2月于廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受手術(shù)治療的67例NSСLС患者。納入標(biāo)準(zhǔn)[8]：①均經(jīng)術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為NSСLС；②術(shù)前未進(jìn)行中藥治療、生物治療、放療、化療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：肺部出現(xiàn)嚴(yán)重感染的患者。67例患者中，男43例，女24例；年齡為39～75歲，平均（54.18±12.19）歲；病理類型：鱗狀細(xì)胞癌24例，腺癌43例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期19例；分化程度：高/中分化45例，低分化22例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移41例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移26例。所有患者均進(jìn)行EGFR基因檢測(cè)，根據(jù)EGFR基因突變狀態(tài)的不同將患者分為3組，其中野生組患者29例，突變組（18、19、21外顯子突變）患者20例，耐藥組（20外顯子T790M點(diǎn)突變）患者18例。3組患者的病理類型、臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過，所有患者均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑

Leica Bond-max全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)、RM2235切片機(jī)、Bond聚合物精細(xì)檢測(cè)系統(tǒng)、脫蠟液均購(gòu)自德國(guó)Leica公司，兔抗人NOTСH1多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色方法

采用免疫組織化學(xué)兩步法檢測(cè)NSСLС組織中NOTСH1的表達(dá)情況，首先對(duì)石蠟標(biāo)本行4 μm連續(xù)切片，保證切片完整無空洞、平整無褶皺，無氣泡，常規(guī)脫蠟入水。滴加3%H2O2，室溫下孵育10 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶的活性。熱抗原修復(fù)后，室溫下自然冷卻，加入一抗，4℃下放置過夜；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗 3次，每次2 min，加入NOTСH1抗體，于37℃恒溫箱內(nèi)孵育20 min；PBS沖洗3次，每次2 min，加入1∶500稀釋的山羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）二抗，稀釋液使用3%脫脂牛奶，于37℃恒溫箱內(nèi)孵育30 min；再用PBS沖洗3次，每次2 min，然后采用二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑進(jìn)行顯色，蒸餾水沖洗，蘇木素襯染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知NOTСH1陽性表達(dá)的石蠟切片作為陽性對(duì)照[9]。

表 1 3組患者的基線特征[ n（%）]

1.4 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定

由3名及以上病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行閱片。NOTСH1陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜和（或）細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或黃色顆粒。200倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞所占百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分相加，0～1分為陰性，2～3分為陽性[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；多因素分析采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者中NOTCH 1表達(dá)情況影響因素的單因素分析

臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSСLС患者的NOTСH1陽性表達(dá)率均高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、分化程度為高/中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同病理類型的NSСLС患者的NOTСH1陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

表 2 NSСLС患者中NOTСH 1表達(dá)情況影響因素的單因素分析（n=67）

2.2 NSCLC患者中NOTCH 1表達(dá)情況影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量納入多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均是NSСLС患者NOTСH1表達(dá)情況的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。（表3）

表 3 NSСLС患者中NOTСH 1表達(dá)情況影響因素的多因素分析（n=67）

2.3 3組患者中NOTCH 1陽性表達(dá)率的比較

野生組、突變組、耐藥組患者的NOTСH1陽性表達(dá)率分別為51.7%（15/29）、40.0%（8/20）、83.3%（15/18），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.766，P＜0.05）。其中，耐藥組患者的NOTСH1陽性表達(dá)率高于野生組和突變組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.806、7.446，P＜0.05）。

3 討論

NSСLС是一種常見的惡性腫瘤，隨著近年來環(huán)境的不斷惡化，NSСLС的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)[11]。因此，研究NSСLС的治療方法意義重大。目前晚期NSСLС的常用治療方法是以EGFR為靶點(diǎn)的藥物治療，然而患者易產(chǎn)生原發(fā)性耐藥及獲得性耐藥，因此，探討EGFR-TKI的耐藥機(jī)制已成為醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，NOTСH1與NSСLС靶向藥物的耐藥有關(guān)。NOTСH1是NOTСH信號(hào)通路中的關(guān)鍵受體之一，越來越多的證據(jù)表明NOTСH1參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及化學(xué)抗性的調(diào)節(jié)[13]。Lamb等[14]研究發(fā)現(xiàn)，60%～70%的EGFR-TKI獲得性耐藥與EGFR基因20外顯子T790M突變密切相關(guān)。相關(guān)研究顯示，在EGFRTKI獲得性耐藥的肺癌細(xì)胞中，NOTСH1的表達(dá)水平上調(diào)，更重要的是，NOTСH1促進(jìn)了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化表型的獲得，這與EGFR-TKI的獲得性耐藥密切相關(guān)[15]。然而，目前有關(guān)不同EGFR突變狀態(tài)的NSСLС患者中NOTСH1的表達(dá)情況及臨床意義尚未完全明確，本研究通過檢測(cè)NSСLС組織中NOTСH1的表達(dá)情況，分析NOTСH1表達(dá)情況與EGFR基因突變狀態(tài)的關(guān)系，以期為NSСLС耐藥機(jī)制的研究提供新思路。在耐藥組中，EGFR基因20外顯子T790M突變頻率增加，EGFR基因突變可能導(dǎo)致NOTСH信號(hào)通路激活，進(jìn)而導(dǎo)致NOTСH1表達(dá)水平上調(diào)。

本研究采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)67例NSСLС組織中NOTСH1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、分化程度為高/中分化、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSСLС患者的NOTСH1陽性表達(dá)率均低于臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、分化程度為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。不同病理類型的NSСLС患者的NOTСH1陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步的Logistic回歸分析結(jié)果顯示，臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均是NSСLС患者中NOTСH1表達(dá)情況的獨(dú)立影響因素（P＜0.05）。

根據(jù)EGFR基因突變狀態(tài)的不同，本研究將NSСLС患者分為3組，即野生組、突變組（18、19、21外顯子突變）及耐藥組（20外顯子T790M點(diǎn)突變），并分析不同組別患者的NOTСH1表達(dá)情況，結(jié)果顯示，耐藥組患者的NOTСH1陽性表達(dá)率為83.3%，高于野生組患者的51.7%和突變組患者的40.0%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

綜上所述，臨床分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況均是NSСLС患者中NOTСH1表達(dá)情況的獨(dú)立影響因素。EGFR-TKI獲得性耐藥的NSСLС中NOTСH1的陽性表達(dá)率較高，NOTСH1高表達(dá)可能是EGFR-TKI耐藥的重要原因。本研究?jī)H對(duì)NOTСH1靶點(diǎn)進(jìn)行分析，隨著對(duì)EGFR-TKI耐藥機(jī)制研究的不斷深入，相信越來越多的與EGFR-TKI治療相關(guān)的分子標(biāo)志物及其相互關(guān)系也會(huì)被發(fā)現(xiàn)。