彭?yè)P(yáng)洋，邱 樊，王 剛

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院（南京市第一醫(yī)院）南京臨床核醫(yī)學(xué)中心，南京210017

2遼寧省遼陽(yáng)市第九人民醫(yī)院外科，遼寧 遼陽(yáng)111000

前列腺癌是歐美國(guó)家男性常見(jiàn)的惡性腫瘤，近年以中國(guó)為代表的亞洲國(guó)家前列腺癌發(fā)病率急速增長(zhǎng)[1]。有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，腫瘤登記地區(qū)前列腺癌發(fā)病率約為9.92/10萬(wàn)，在男性惡性腫瘤發(fā)病率中居第6位，而病死率在男性惡性腫瘤中居第2位[2]。目前，前列腺癌臨床篩查手段仍比較匱乏，主要包括直腸指診和血清前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）檢測(cè)兩種手段，但前者靈敏度低，后者特異性差，易發(fā)生漏診和誤診，嚴(yán)重影響前列腺癌的療效及預(yù)后[3]。因此，尋找靈敏度和特異度均較高的檢查手段，以縮短確診時(shí)間，提高治療效果，改善預(yù)后是目前前列腺癌研究的重點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA）是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移及侵襲等過(guò)程推進(jìn)腫瘤發(fā)展[4]。與組織miRNA比較，外周血miRNA相對(duì)穩(wěn)定，且更易獲取及檢測(cè)，是腫瘤早發(fā)現(xiàn)和早診斷的新型生物標(biāo)志物，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究中占有一席之地[5]。趙宇明等[6]發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者血清miRNA-135明顯升高，且與Gleason評(píng)分和臨床分期有一定相關(guān)性，但未涉及其診斷效能、臨床特征及預(yù)后的深入研究。為此，本研究選取108例前列腺癌患者、62例前列腺良性病變患者和40例男性健康體檢者作為研究對(duì)象，探討血清miRNA-135在前列腺癌中的表達(dá)情況，并分析其與PSA聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值及與臨床特征、預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年2月至2016年2月南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院和遼陽(yáng)市第九人民醫(yī)院收治的108例前列腺癌患者（前列腺癌組）和62例前列腺良性病變患者（良性病變組）作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①前列腺穿刺活檢或前列腺術(shù)后組織病理結(jié)果確認(rèn)為前列腺癌或前列腺良性病變；②預(yù)期生存期＞3個(gè)月；③臨床資料完整且無(wú)其他原因失訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②嚴(yán)重肝腎功能受損；③依從性差；④精神病史或家族遺傳史。另選取同期40名男性健康體檢者作為健康對(duì)照組。3組研究對(duì)象基線特征比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有研究對(duì)象均知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 血清標(biāo)本收集抽取所有研究對(duì)象空腹靜脈血5 ml于血清分離管中，顛倒混勻，室溫靜置，2 h內(nèi)完成離心（4000 r/min離心5 min），留取血清，將其分為兩等份后置于EP管中，并于-80℃冰箱中保存。

1.2.2 血清miRNA-135檢測(cè)提取總RNA，將標(biāo)本從冰箱中取出，冰上解凍，參考Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，用紫外分光光度儀檢測(cè)其濃度和純度，在保證光密度（optical density，OD）260/OD280值為1.8～2.1的前提下可進(jìn)行后續(xù)步驟。制備cDNA，根據(jù)miRNA-135序列設(shè)計(jì)特殊引物（由上海吉?jiǎng)P科技有限公司完成），參考M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA。以上述產(chǎn)物作為模板，以RNU6B為內(nèi)參，參考FQ-聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PСR）試劑盒配置PСR體系，檢測(cè) miRNA-135。以 2-△△Сt表示 miRNA-135相對(duì)表達(dá)量。以前列腺癌患者miRNA-135均值為界限，超過(guò)（包括）該值為高表達(dá)，低于該值為低表達(dá)。

1.2.3 血清PSA檢測(cè)將標(biāo)本從冰箱中取出，37℃水浴解凍，待其充分溶解，輕輕搖勻混合，參考酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行血清PSA檢測(cè)，PSA正常值為0～4 ng/ml。

1.3 隨訪

對(duì)108例前列腺癌患者進(jìn)行隨訪，共3年，截止日期為2019年2月，記錄其總生存期（overall survival，OS）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROС）曲線探討診斷效能；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并用Log-rank法進(jìn)行比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miRNA-135和PSA水平的比較

前列腺癌組血清miRNA-135和PSA水平均高于良性病變組和健康對(duì)照組，良性病變組血清miRNA-135和PSA水平均高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表 1 3-組研究對(duì)象血清miRNA-135和PSA水平的比較（±s）

表 1 3-組研究對(duì)象血清miRNA-135和PSA水平的比較（±s）

注：a與良性病變組比較，P＜0.05；b與健康對(duì)照組比較，P＜0.05

組別miRNA-135 PSA（ng/ml）前列腺癌組（n=108）18.71±2.63a b 76.32±13.98a b良性病變組（n=62）8.20±1.27b 33.35±9.75b健康對(duì)照組（n=40）4.24±1.05 2.61±1.51 F值942.108 702.291 P值0.000 0.000

2.2 血清miRNA-135和PSA的相關(guān)性

經(jīng)Pearson相關(guān)分析法得知，血清miRNA-135與PSA呈正相關(guān)（r=0.908，P=0.000）。

2.3 血清miRNA-135和PSA檢測(cè)對(duì)前列腺癌的診斷效能

繪制ROС曲線圖，miRNA-135診斷前列腺癌的曲線下面積為 0.933（95%СI：0.876～0.989，P=0.000），截?cái)嘀禐?6.51，靈敏度和特異度分別為81.6%和93.4%；PSA診斷前列腺癌的曲線下面積為 0.805（95%СI：0.625～0.984，P=0.002），截?cái)嘀禐?9.38，靈敏度和特異度分別為73.5%和90.0%；miRNA-135聯(lián)合PSA檢測(cè)診斷前列腺癌的曲線下面積為 0.981（95%СI：0.901～1.000，P=0.000），截?cái)嘀禐?5.34和67.62，靈敏度和特異度分別為90.2%和98.6%。（圖1）

圖1 血清miRNA-135和PSA單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)診斷前列腺癌的ROС曲線

2.4 血清miRNA-135表達(dá)情況與前列腺癌患者臨床特征的關(guān)系

在108例前列腺癌患者中，68例為高表達(dá)者，40例為低表達(dá)者；不同Gleason評(píng)分、分化程度、TNM分期及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的血清miRNA-135表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同年齡及組織學(xué)類(lèi)型患者的血清miRNA-135表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表2）

2.5 血清miRNA-135表達(dá)情況與前列腺癌患者生存的關(guān)系

隨訪3年，miRNA-135高表達(dá)者生存率為26.47%（18/68），低于 miRNA-135低表達(dá)者的47.50%（19/40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.945，P=0.026）；miRNA-135高表達(dá)者生存時(shí)間為（20.03±1.32）個(gè)月，明顯短于miRNA-135低表達(dá)者的（27.86±1.46）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=28.616，P=0.000）。（圖2）

表 2 血清miRNA-135表達(dá)情況與前列腺癌患者臨床特征的關(guān)系（n=108）

圖1 血清miRNA-135高表達(dá)（n=68）與低表達(dá)（n=40）前列腺癌患者的生存曲線

3 討論

miRNA是人體內(nèi)源性表達(dá)的微小單鏈小RNA，平均約由22個(gè)核苷酸組成，主要通過(guò)結(jié)合體內(nèi)靶基因信使RNA 3'端非翻譯區(qū)抑制靶基因翻譯，誘導(dǎo)靶基因信使RNA降解，從而影響細(xì)胞增殖及凋亡[8-9]。腫瘤發(fā)生發(fā)展便是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞增殖及凋亡異常所致，目前關(guān)于miRNA的研究逐漸增多，其價(jià)值也日漸凸顯[10]。在前列腺癌中，部分miRNA 呈高表達(dá)，如 miRNA-141、miRNA-298、miRNA-346及miRNA-375等，而部分miRNA則呈低表達(dá)，如 miRNA-24、miRNA-93和 miRNA-106a等[11]。此外，有學(xué)者選取其中部分異常miRNA進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-145在前列腺癌中表達(dá)下調(diào)，且與組織浸潤(rùn)程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[12]。趙宇明等[13]通過(guò)miRNA基因芯片對(duì)非激素依賴(lài)性前列腺癌和激素依賴(lài)性前列腺癌組織進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了miRNA-135的差異性，并通過(guò)體外轉(zhuǎn)染miRNA-135至DU145和PС3前列腺癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)其通過(guò)下調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子6（signal transducer and activator of transcription 6，STAT6）抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力，從細(xì)胞水平肯定了miRNA-135對(duì)前列腺癌的價(jià)值；隨后趙宇明等[6]從臨床探討了其診斷價(jià)值，但不夠全面。

本研究通過(guò)對(duì)108例前列腺癌患者、62例前列腺良性病變者和40例健康體檢者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌組血清miRNA-135和PSA水平均高于良性病變組和健康對(duì)照組，良性病變組血清miRNA-135和PSA水平均高于健康對(duì)照組，再次肯定了miRNA-135在前列腺癌中的高表達(dá)狀態(tài)。本研究通過(guò)繪制ROС曲線分別探討了血清miRNA-135和PSA單個(gè)及聯(lián)合診斷前列腺癌的效能，發(fā)現(xiàn)血清miRNA-135診斷前列腺癌效果尚可，其曲線下面積可達(dá)0.933，靈敏度和特異度分別為81.6%和93.4%，二者聯(lián)合檢測(cè)的曲線下面積可上升至0.981，靈敏度上升到90.2%，特異度上升到98.6%，具有一定創(chuàng)新及臨床參考價(jià)值。此外，本研究還通過(guò)繪制Kaplan-Meier生存曲線發(fā)現(xiàn)miRNA-135高表達(dá)者生存率為26.47%（18/68），低于miRNA-135低表達(dá)者的47.50%（19/40），miRNA-135高表達(dá)者生存時(shí)間為（20.03±1.32）個(gè)月，明顯短于miRNA-135低表達(dá)者的（27.86±1.46）個(gè)月，提示血清miRNA-135有望成為前列腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)的重要指標(biāo)，后續(xù)可擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，血清miRNA-135在前列腺癌中呈高表達(dá)，有一定診斷價(jià)值，聯(lián)合PSA可提高其診斷效能，且有望成為臨床特征評(píng)估及預(yù)后預(yù)測(cè)的有效指標(biāo)。