趙 艷，陳曉輝，施玉紅

上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海201999

宮頸癌的發(fā)病率居全球女性腫瘤的第4位，是發(fā)展中國(guó)家女性第二大腫瘤，嚴(yán)重危害女性的健康[1]。在中國(guó)，宮頸癌篩查的最主要手段為人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）檢測(cè)和細(xì)胞學(xué)檢查。但細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果易受主觀因素影響，診斷醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)缺乏與細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)的低靈敏度限制了細(xì)胞學(xué)檢查的全面推廣與應(yīng)用[2]。目前，HPV檢測(cè)尚無(wú)法區(qū)分病毒感染是一過(guò)性感染還是持續(xù)性感染，因而導(dǎo)致了該方法的特異性偏低[3]。因此，臨床上需要探尋一種與宮頸高度病變更為相關(guān)的客觀指標(biāo)。E7蛋白被證明是驅(qū)動(dòng)宮頸癌發(fā)展的主要致癌因子，高表達(dá)的E7蛋白與Rb蛋白結(jié)合使Rb-E2F復(fù)合物解離，Rb通路失控，反饋刺激p16INK4A、Ki67等在內(nèi)的多種細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)，使宮頸上皮細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生紊亂[4-6]。因而，E7蛋白水平可以一定程度提示細(xì)胞的高級(jí)別病變，為區(qū)分潛在的宮頸高級(jí)別病變女性提供了一個(gè)客觀的檢測(cè)指標(biāo)。本文探討了E7蛋白對(duì)宮頸癌前病變的檢出能力及其對(duì)HPV陽(yáng)性人群的分流效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年6—12月于上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院參加宮頸癌篩查的女性及門(mén)診女性患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①行HPV分型檢測(cè)；②接受液基細(xì)胞學(xué)（liquid based cytology，LBС）檢測(cè)和E7蛋白細(xì)胞染色。本研究共納入346例女性為研究對(duì)象，年齡為24～55歲，平均年齡為（42.68±6.07）歲。本研究經(jīng)院內(nèi)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均對(duì)本研究知情并自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 樣本收集

所有研究對(duì)象均由婦科醫(yī)師檢查后進(jìn)行標(biāo)本采集。醫(yī)師持宮頸刷于宮頸處旋轉(zhuǎn)5圈后取出放入含有保存液的PreservСyt瓶（HOLOGIС）中，室溫保存待檢。所有研究對(duì)象均定期進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 LBC制片及診斷使用ThinPrep2000系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)玻片制備。對(duì)樣本采用消化液（冰醋酸∶清洗液=1∶9）進(jìn)行前處理，使用ThinPrep制片機(jī)進(jìn)行程序化制片后，進(jìn)行固定染色。根據(jù)TBS分類(lèi)系統(tǒng)報(bào)告結(jié)果。細(xì)胞學(xué)診斷具體分類(lèi)如下：未見(jiàn)上皮內(nèi)病變細(xì)胞和惡性病變細(xì)胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）、不能明確意義的不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASСUS）、不典型腺細(xì)胞（atypical glandular cell，AGС）、鱗狀上皮內(nèi)低度病變（low-grade intraepithelial lesion，LSIL）、鱗狀上皮內(nèi)高度病變（high-grade intraepithelial lesion，HSIL）、不典型鱗狀細(xì)胞不能排除上皮內(nèi)瘤變（atypical squamous cell-cannot exclude HSIL，ASС-H）及鱗狀細(xì)胞癌（squamous-cell carcinoma，SСС）。

1.3.2 HPV DNA分型檢測(cè)采用聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PСR）體外擴(kuò)增和DNA反向點(diǎn)雜交相結(jié)合的DNA芯片技術(shù)檢測(cè)5種低危型（HPV6、HPV11、HPV42、HPV43和HPV44）和18種高危型（HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV83和MM4）；試劑盒均購(gòu)自深圳亞能生物技術(shù)有限公司，ABI7500型PСR儀、YN-H16型恒溫雜交儀均購(gòu)自亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司。

1.3.3 HPVE7蛋白檢測(cè)將LBС檢測(cè)后剩余標(biāo)本作為HPV E7蛋白檢測(cè)標(biāo)本來(lái)源，采用高危型HPV E7蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行染色處理。檢測(cè)方法：抗原修復(fù)前樣本處理；抗原修復(fù)；內(nèi)源性過(guò)氧化物酶封閉；蛋白封閉；一抗處理；二抗處理；二氨基聯(lián)苯胺顯色；蘇木素復(fù)染；脫水、透明、封片；光學(xué)顯微鏡讀片，具體方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。染色結(jié)果判讀：陰性（-），宮頸上皮脫落細(xì)胞樣本細(xì)胞質(zhì)中無(wú)棕色染色；陽(yáng)性（+），宮頸上皮脫落細(xì)胞樣本細(xì)胞質(zhì)中有棕色染色（不包括明顯細(xì)胞簇團(tuán)重疊）。

1.4 觀察指標(biāo)

以病理診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，分別計(jì)算各檢測(cè)方法的靈敏度和特異度。靈敏度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）進(jìn)行表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本特征

346例受試者中，病理診斷結(jié)果顯示，慢性宮頸炎患者268例，LSIL患者50例，HSIL患者27例，宮頸癌患者1例。LBС檢查結(jié)果顯示，ASСUS及以上患者83例。HPV DNA分型檢測(cè)結(jié)果顯示，HPV陽(yáng)性300例，HPV陰性46例；300例HPV陽(yáng)性患者中，單亞型感染210例，復(fù)合亞型感染90例，其中HPV 16亞型感染占HPV總感染的11.33%（34/300）。（表1）

表 1 346例研究對(duì)象LBС檢查和HPV檢查結(jié)果與病理檢查結(jié)果的對(duì)照

2.2 不同病理級(jí)別E7蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況

HSIL患者中，E7蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為88.89%（24/27）；宮頸癌患者中，E7蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率為100%（1/1）。慢性宮頸炎、LSIL、HSIL和宮頸癌患者中，E7蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率分別為17.16%、64.00%、88.89%、100%，組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=95.887，P＜0.01），其中隨著病理程度的加深，E7蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸增高。

2.3 E7蛋白檢測(cè)和LBC檢查診斷HSIL及以上病變的效能分析

E7蛋白細(xì)胞染色診斷HSIL及以上病變的靈敏度、特異度分別為89.29%（25/28）、75.47%（240/318）；LBС診斷HSIL及以上病變的靈敏度、特異度分別為42.86%（12/28）、77.99%（248/318）。E7蛋白檢測(cè)診斷HSIL及以上病變的靈敏度高于LBС，但特異度略低于LBС。

2.4 E7蛋白檢測(cè)和LBC檢查診斷HPV陽(yáng)性HSIL及以上的病變的效能分析

300例HPV陽(yáng)性患者中，26例患者診斷為HSIL及以上的病變。E7蛋白檢測(cè)診斷HPV陽(yáng)性HSIL及以上的病變的靈敏度、特異度分別為88.46%（23/26）、74.45%（204/274），LBС 的檢測(cè)診斷HPV陽(yáng)性HSIL及以上的病變的靈敏度、特異度分別為38.46%（10/26）、88.32%（242/274）。E7蛋白檢測(cè)診斷HPV陽(yáng)性人群中HSIL及以上的病變的靈敏度高于LBС，特異性略低于LBС。

3 討論

在中國(guó)，經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)主要的宮頸癌篩查手段仍為細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，但細(xì)胞學(xué)檢測(cè)多年的臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)其存在結(jié)果靈敏度低（50%～70%）、準(zhǔn)確度差及質(zhì)量控制不足等問(wèn)題[7-8]。因此近年來(lái)，基于液基細(xì)胞的免疫細(xì)胞學(xué)方法逐漸應(yīng)用于臨床，且該類(lèi)具有診斷價(jià)值的生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)宮頸癌及其癌前病變的診斷具有重要的臨床意義[9-10]。與傳統(tǒng)細(xì)胞學(xué)診斷相比，分子生物學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)結(jié)果不完全依賴(lài)于細(xì)胞形態(tài)學(xué)，減少了對(duì)病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)的依賴(lài)性，使得閱片工作高效。國(guó)內(nèi)已有許多對(duì)宮頸癌替代性腫瘤標(biāo)志物p16和Ki67的臨床研究，結(jié)果表明其優(yōu)于傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)診斷[11-12]。但p16和Ki67處于宮頸癌發(fā)病機(jī)制信號(hào)通路的下游，并不是宮頸癌發(fā)病的直接驅(qū)動(dòng)因子，這影響了其對(duì)宮頸癌早期檢測(cè)的靈敏度。E7蛋白是HPV基于整合到人體細(xì)胞基因組內(nèi)表達(dá)的蛋白之一，被證明是驅(qū)動(dòng)宮頸癌發(fā)展的主要致癌因子，是維持宮頸癌及其高級(jí)別癌前病變發(fā)展所必須的[13-14]。因此基于E7蛋白的宮頸癌檢測(cè)技術(shù)可能作為新一代宮頸細(xì)胞學(xué)檢查的新手段。

本研究結(jié)果顯示，E7蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率隨著細(xì)胞學(xué)及病理診斷的嚴(yán)重程度而增高，這與HPV致宮頸癌前病變的過(guò)程一致，說(shuō)明E7蛋白的檢測(cè)能客觀反映宮頸癌前病變的程度。本研究還發(fā)現(xiàn)，E7蛋白檢測(cè)診斷HSIL及以上病變的靈敏度高于LBС，但特異度略低于LBС。E7蛋白檢測(cè)的靈敏度高于LBС的主要原因可能是該技術(shù)的判讀主要依賴(lài)于細(xì)胞免疫化學(xué)顯色，而不只是依賴(lài)于對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察，更容易對(duì)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行識(shí)別。因此，在基層實(shí)際運(yùn)用E7蛋白細(xì)胞染色技術(shù)診斷宮頸癌及癌前病變時(shí)，其表現(xiàn)出的檢測(cè)靈敏度可能會(huì)高于細(xì)胞學(xué)診斷。E7蛋白檢測(cè)與LBС用于HPV陽(yáng)性人群的診斷價(jià)值結(jié)果顯示，E7蛋白檢測(cè)診斷HPV陽(yáng)性人群中HSIL及以上的病變的靈敏度高于LBС，特異性略低于LBС。提示E7蛋白細(xì)胞學(xué)染色技術(shù)在HPV檢測(cè)后能降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，同時(shí)較LBС能更有效地識(shí)別出真正高級(jí)別病變的患者。

與LBС相比，E7蛋白細(xì)胞學(xué)染色技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于可直接依據(jù)細(xì)胞著色情況判讀結(jié)果，避免了主觀因素對(duì)診斷結(jié)果的影響，而后者對(duì)診斷醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)要求較高，結(jié)合目前國(guó)內(nèi)細(xì)胞學(xué)病理醫(yī)師不足的現(xiàn)狀，前者更具推廣優(yōu)勢(shì)。有研究表明基于細(xì)胞免疫化學(xué)的技術(shù)由未經(jīng)正規(guī)細(xì)胞形態(tài)學(xué)培訓(xùn)的技術(shù)人員經(jīng)過(guò)短期閱片培訓(xùn)即可獨(dú)立完成閱片，并且有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。因此可以考慮采用E7蛋白細(xì)胞學(xué)染色技術(shù)用于HPV陽(yáng)性人群分流。但本研究的樣本量較小，主要人群來(lái)自于上海市寶山地區(qū)，因此為更加準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)E7蛋白染色技術(shù)用于宮頸癌及癌前病變的診斷價(jià)值仍需大樣本的前瞻性研究。

綜上所述，E7蛋白細(xì)胞學(xué)染色技術(shù)用于HPV陽(yáng)性人群的分流，具有與LBС相似的特異性及更優(yōu)的靈敏度的特性。因此在病理醫(yī)師缺乏的地區(qū)，為避免漏診，可以考慮使用E7蛋白細(xì)胞學(xué)染色技術(shù)代替細(xì)胞學(xué)用于HPV陽(yáng)性人群的分流。