張卓鵬

摘要：試圖從不斷減少酶的種類，有利于反應(yīng)條件的控制角度來推測科學(xué)家們當(dāng)初的PCR設(shè)計思路。

關(guān)鍵詞：PCR技術(shù);DNA復(fù)制;酶

中圖分類號：Q-49 文獻標(biāo)志碼：E

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polvmerase chain reaction，PCR）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的新技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在幾個小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。這項技術(shù)有效解決了因為樣品中DNA含量太低而難以對樣品進行分析研究的問題，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、基因工程及其他與DNA鑒定相關(guān)的領(lǐng)域。PCR雖然為一個簡單的實驗，但在實際過程中可能會出現(xiàn)各種問題。產(chǎn)生問題的原因可能來源于以下幾個方面：實驗操作、試劑質(zhì)量、PCR反應(yīng)過程中各種試劑的含量，以及反應(yīng)條件、溫度設(shè)置等。下面試圖從不斷減少酶的種類，有利于反應(yīng)條件的控制角度來推測科學(xué)家們當(dāng)初的PCR設(shè)計思路。

1PCR技術(shù)與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較

PCR的循環(huán)過程分為三部分：模板變性、引物退火、熱穩(wěn)定DNA聚合酶在適當(dāng)溫度下催化DNA鏈延伸合成。PCR過程和細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的比較見表1。

2PCR技術(shù)從需要多種酶到一種酶的推測

PCR技術(shù)是由穆里斯等人于1988年發(fā)明的，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎。核酸體外擴增的最早設(shè)想是由美國的教授科蘭納（曾獲得1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎）1971年提出：“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆基因”。當(dāng)時，科蘭納實驗室己具備了進行PCR的條件，遺憾的是沒有付諸實踐，后來正是穆里斯等人把PCR技術(shù)引向了實際應(yīng)用。然而，1983年8月，穆里斯首次進行有關(guān)PCR原理的報告，其他人卻反應(yīng)冷淡甚至持懷疑態(tài)度，認(rèn)為這個原理太簡單了，如果可行，早就有人做了。

從表1胞內(nèi)DNA復(fù)制和PCR過程的異同比較可看出，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制是一個復(fù)雜的化學(xué)過程，需經(jīng)過多步連續(xù)反應(yīng)，且需要一系列的酶參與反應(yīng)。理論上講，體外要模擬成功，就應(yīng)與體內(nèi)條件模擬的越接近、越相似，成功的可能性才會越大。實際上，要在體外條件下進行，應(yīng)使反應(yīng)過程簡單化，包括酶種類的減少，中間反應(yīng)步驟的減少，這樣所獲得產(chǎn)物的純度將會提高，便于鑒定;酶種類的減少，也使反應(yīng)的具體條件如溫度、pH等便于控制。那么，在PCR設(shè)計中，如何減少酶的種類呢？

（1）解旋酶、DNA連接酶、ATP的去除。

在高溫（90～95℃）下，DNA分子會自動解旋，且兩條單鏈將完全解開。因此，體外DNA復(fù)制時，不需要解旋酶，也不需要消耗ATP;體外又因DNA兩條單鏈完全解開，故將來合成子鏈時，兩條子鏈都是連續(xù)合成的，于是就不會出現(xiàn)岡崎片段。這樣就不再需要DNA連接酶來連接一個個岡崎片段。

（2）引物由RNA片段改換成DNA單鏈片段，RNA酶的去除。

利用PCR技術(shù)擴增目的基因的前提，是要有一段己知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。知道引物的核苷酸序列，通過DNA合成儀用化學(xué)方法便可直接人工合成。故PCR技術(shù)中引物由原先細(xì)胞內(nèi)的RNA片段改換成DNA單鏈片段。這樣就不再需要RNA酶水解RNA引物，PCR反應(yīng)體系中酶的種類再次減少。

（3）耐高溫DNA聚合酶的成功分離。

由于DNA子鏈合成延伸時，需DNA聚合酶將單個的核苷酸加到已存在的DNA單鏈片段上，形成磷酸二酯鍵，故PCR設(shè)計中DNA聚合酶不可或缺。然而，從體內(nèi)提取的DNA聚合酶一般在高溫條件下都會變性失活，尋找耐高溫的DNA聚合酶勢必成為PCR技術(shù)突破的瓶頸。我國臺灣科學(xué)家錢嘉韻第一個報道分離耐高溫DNA聚合酶的工作。她從美國黃石國家公園里熱泉中的嗜熱菌中成功分離出了耐高溫的DNA聚合酶，即Taq DNA聚合酶，從而使PCR變成真正的成熟技術(shù)。穆里斯等人正是按照錢嘉韻發(fā)明的操作步驟，成功分離出Taq/DNA聚合酶。

科學(xué)上許多偉大的發(fā)現(xiàn)，往往離不開眾多科學(xué)家不懈的努力，尤其離不開科學(xué)家大膽的猜想和實踐創(chuàng)新，PCR技術(shù)從需要多種酶到一種酶的推測便是一個經(jīng)典范例，讓人深受啟發(fā)。