陳蕾，鄧燕，潘月影華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院，武漢430030

肺癌是呼吸系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居高不下，嚴重威脅著人們身心健康[1]。非小細胞肺癌是肺癌中常見的類型之一，占比85%以上[2]，包括鱗癌、腺癌及大細胞癌，其主要臨床癥狀有發(fā)熱、咳嗽、氣促、咯血等。目前非小細胞肺癌的主要治療方法是手術(shù)切除，早期患者治愈率較大，而晚期患者病死率較高。因此，積極尋找非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的調(diào)控因素，并研究其與疾病發(fā)展過程的關(guān)系，對非小細胞肺癌的早發(fā)現(xiàn)、早治療有至關(guān)重要的作用。Jun二聚化蛋白2(Jdp2)是轉(zhuǎn)錄活化因子(AP-1)的一部分，可與原癌基因Fos、活化轉(zhuǎn)錄因子(ATF)形成二聚體，具有多種生物學功能[3]，還參與細胞分化、衰老、凋亡等過程[4]。Jdp2在多種腫瘤(胰腺癌、肝癌、骨肉瘤等)細胞中均呈低表達[5]。Phf手指蛋白2(Phf2)是Jmjc家族的一員，其基因位于染色體9q22.31上，由1個結(jié)構(gòu)域和1個功能域組成[6]，Phf2在甲狀腺癌、胃癌及結(jié)腸癌中均呈低表達。因此，相關(guān)研究指出Phf2在腫瘤發(fā)展過程中可能充當抑癌基因角色，對腫瘤的進展具有負向調(diào)控作用[7]。但Jdp2、Phf2在非小細胞肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究較少。本研究分析非小細胞肺癌組織中Jdp2、Phf2表達變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年3月～2015年6月本院收治的非小細胞肺癌患者86例，男44例，女42例；年齡42～74(60±5)歲，≥60歲44例，<60歲42例；TNM分期為Ⅰ期25例，Ⅱ期30例，Ⅲ期31例；組織分化程度為中低分化57例，高分化29例；組織學分型為鱗狀細胞癌(鱗癌)34例，腺癌52例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例；腫瘤直徑<3 cm 46例，≥3 cm 40例。納入標準：均符合2008版非小細胞肺癌指南診斷標準[8]，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診；均首次診斷為非小細胞肺癌，既往未接受過抗腫瘤治療；臨床病理資料完整并接受隨訪，且患者及家屬簽署知情同意書。排除標準：患有其他呼吸系統(tǒng)疾病，如肺炎、支氣管炎等；患有其他系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤，如胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等；伴免疫系統(tǒng)功能缺陷疾病等。

1.2 取材 以上患者均采用手術(shù)治療，術(shù)中切除非小細胞肺癌組織及正常肺組織(距腫瘤邊緣>5 cm)，經(jīng)病理學檢查確診。用中性甲醛固定組織，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，切成厚度為2 μm的切片。

1.3 非小細胞肺癌及正常肺組織中Jdp2、Phf2表達檢測 采用免疫組化法。將切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗3次，每次3 min。將切片浸入pH值為6的枸櫞酸緩沖液中，加熱至100 ℃，3 min后冷卻至室溫，PBS緩沖液清洗3次，每次3 min。在切片上滴加3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS清洗3次，每次3 min。加入兔抗人Jdp2(山東捷世康生物科技有限公司)和兔抗人Phf2抗體(Abcam公司)，稀釋比例均為1∶100，4 ℃儲存過夜。第2天用PBS清洗3次，每次3 min，加二抗，30 min后PBS清洗3次。DAB顯色3 min，蘇木素復染3 min，用自來水沖洗后乙醇梯度水化，晾干后中性樹脂封片。結(jié)果判定標準[9]：由病理醫(yī)師用顯微鏡鏡檢，Jdp2、Phf2蛋白主要表達于細胞核。染色程度評分：未染色為0分，淺黃色1分，黃色為2分，棕黃色為3分；陽性細胞百分比評分：隨機選取每張切片的5個視野(×400)，計算5個視野陽性細胞的平均百分比，<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分。將以上兩項評分相乘<2為陰性，≥2為陽性。

1.4 隨訪 從患者出院日起，每隔2個月隨訪1次，以門診隨訪或電話隨訪為主，隨訪時間為2～60個月，隨訪至2019年6月或患者死亡，收集患者生存數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。率的比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析使用Spearman相關(guān)法；用Kaplan-Meier法建立生存曲線，生存率比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細胞肺癌組織與正常肺組織中Jdp2、Phf2表達比較 非小細胞肺癌組織與正常肺組織中Jdp2蛋白陽性表達率分別為48.83%(42/86)、73.25%(63/86)，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。非小細胞肺癌組織與正常肺組織中Phf2陽性表達率分別為52.32%(45/86)、79.06%(68/86)，比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 非小細胞肺癌組織中Jdp2與Phf2表達的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，非小細胞肺癌組織中Jdp2與Phf2表達呈正相關(guān)(r=0.672，P<0.05)。

2.3 非小細胞肺癌組織中Jdp2、Phf2表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 非小細胞肺癌組織中Jdp2、Phf2陽性表達與腫瘤TNM分期、組織分化程度有關(guān)(P均<0.05)，與患者性別、年齡及腫瘤直徑、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.4 非小細胞肺癌組織中Jdp2、Phf2表達與患者預后的關(guān)系 86例非小細胞肺癌患者均成功隨訪，隨訪5年，死亡36例，5年總體生存率為58.1%。Jdp2陽性表達42例，死亡19例，5年生存率為54.8%；Jdp2表達陰性44例，死亡17例，5年生存率為61.4%。二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Phf2陽性表達45例，死亡22例，5年生存率為51.1%；Phf2表達陰性41例，死亡14例，5年生存率為65.9%。二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表1 非小細胞肺癌組織中Jdp2、Phf2陽性表達與患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

3 討論

非小細胞肺癌是肺癌的類型之一，與小細胞癌相比，其轉(zhuǎn)移擴散較慢，易復發(fā)、預后較差，患者長期生存率較低。早期非小細胞肺癌的主要治療手段是手術(shù)切除，但往往部分患者發(fā)現(xiàn)患病時已發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，深入探討非小細胞肺癌的發(fā)病機制，對治療及預后有至關(guān)重要的作用。

Jdp2是由AP-1中Jun蛋白亞基分離出來，可與JunD、JunB、活化轉(zhuǎn)錄因子(ATF)等結(jié)合，達到抑制癌基因活性的作用[10]。Jdp2主要分為三型，其中Ⅰ型最常見[11]，由163個氨基酸組成，且有1個堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)位于其結(jié)構(gòu)中心。有文獻報道，Jdp2可以抑制Ras癌基因，從而抑制小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3轉(zhuǎn)化，進而發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖的作用[12]。本研究非小細胞肺癌組織中Jdp2陽性表達率低于癌旁組織，且Jdp2表達與腫瘤分化程度、臨床分期有關(guān)，說明Jdp2可能參與非小細胞肺癌的進展。其機制可能為Jdp2與組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶結(jié)合，抑制組蛋白的乙?；种颇[瘤基因的轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤細胞的增殖及分化、停滯其生長周期，進一步抑制了腫瘤細胞的臨床分期[13]。當組織中該蛋白表達減少時，使得抑癌作用減弱，間接促進了腫瘤細胞的增殖，使腫瘤組織生長速度加快，惡性程度增加，提高了腫瘤組織的臨床分期，且分化程度降低。此外，Jdp2激活腫瘤細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，促進腫瘤細胞增殖，加快了腫瘤細胞的生長周期，亦增加了腫瘤組織的惡性程度，提高了腫瘤組織的臨床分期。這一研究結(jié)果與其他研究[5]結(jié)果相似。另一方面Jdp2蛋白與羧基末端延伸部分結(jié)合，具有促進腫瘤細胞基因轉(zhuǎn)錄及分化的功能，使腫瘤分化程度降低，促進腫瘤惡性進展[11]。

KDM7(Jmic)家族包括KDM 7A、KDM 7B、KDM 7C三個成員，KDM 7C又名Phf2，也是最新的KDM7成員，其廣泛表達于全身各個組織中，可使賴氨酸末端甲基化，進而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。其中Phf2結(jié)構(gòu)中的結(jié)構(gòu)域?qū)被峒谆δ苡驅(qū)⒓谆鶐ё?。有研究表明，Phf2可以調(diào)節(jié)H3K9Me2基因去甲基化，促進p53凋亡基因的表達，發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用[7]，本研究非小細胞肺癌組織中Phf2陽性表達率低于癌旁組織，提示Phf2可能參與非小細胞肺癌的進展。其機制可能為Phf2可使組蛋白賴氨酸末端去甲基化，上調(diào)凋亡基因的表達，使得腫瘤細胞凋亡增多、正常組織細胞生成增多，抑制腫瘤細胞的增殖及分化過程，進而抑制腫瘤的惡性進展。而當Phf2表達降低時，其抑癌及促腫瘤細胞凋亡的作用減弱，腫瘤細胞逐漸向周圍正常組織轉(zhuǎn)移浸潤，加快了腫瘤細胞的生長速度，促進了腫瘤的惡性進展。因此，癌組織中Phf2的陽性表達率低于癌旁組織。本研究結(jié)果還顯示，非小細胞肺癌組織中的Phf2表達與腫瘤分化程度、腫瘤臨床分期有關(guān)，機制可能為Phf2亦具有類似抑癌基因的作用，當Phf2表達下調(diào)時，其抑制腫瘤細胞的增殖功能減弱，對腫瘤細胞生長起著正向調(diào)控的作用，對腫瘤細胞的分化起著負向調(diào)控的作用，促進了腫瘤的惡性進展，進一步提高了腫瘤細胞的臨床分期，并降低了腫瘤細胞分化程度[14]。Phf2還是AP-1的抑制物，可調(diào)節(jié)ccna2基因的表達，上調(diào)細胞周期蛋白A-2的表達，因此Phf2低表達加快了腫瘤細胞的生長周期，使得腫瘤細胞數(shù)量增加，促使腫瘤細胞的臨床分期[15,16]。

本研究中Jdp2、Phf2表達陽性的患者5年生存率均高于表達陰性患者。說明二者均可能具有抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，Jdp2和Phf2表達降低可以反映患者預后不良。研究還顯示，Jdp2和Phf2表達呈正相關(guān)。原因可能為兩者均為AP-1的抑制物，抑制腫瘤細胞增殖、分化，抑制其向周圍正常組織侵襲及轉(zhuǎn)移。二者具有協(xié)同作用，共同發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長的作用[17，18]。

綜上所述，非小細胞肺癌組織中Jdp2、Phf2表達均降低，與腫瘤分化、臨床TNM分期相關(guān)。但TNM分期受腫瘤大小及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響，因此，非小細胞肺癌組織中Jdp2、Phf2低表達狀態(tài)可能只與另一因素遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)，但本研究未對此進行分析；且也未涉及二者在非小細胞肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制。后期需進行大樣本的研究對以上問題進行探討。