何玉鳳，李桂林徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州000；徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州婦幼保健院

子宮內(nèi)膜異位癥(EMT)是一種常見的婦科良性慢性炎癥性疾病，指子宮內(nèi)膜組織(腺體和間質(zhì))出現(xiàn)在子宮體以外的部位生長(zhǎng)，可侵犯全身任何部位，以卵巢、宮骶韌帶最常見，其主要臨床表現(xiàn)為痛經(jīng)、慢性盆腔痛、不孕及性交不適等[1]。育齡婦女EMT發(fā)病率10%～15%，且近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)[2]。該病雖為良性疾病，但其具有惡性腫瘤的特點(diǎn)，如種植、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)等。研究證實(shí)，趨化因子或趨化因子受體(CCR)是慢性炎癥和許多自身免疫性疾病的潛在致病因素[3]。國內(nèi)研究結(jié)果顯示，CCR4、CCR8、CCR9、CXC類趨化因子受體1(CXCR1)在EMT異位灶中高表達(dá)，可能參與EMT的發(fā)展[4]。進(jìn)一步研究[5]發(fā)現(xiàn)，CCR9可能通過改變子宮內(nèi)膜生物學(xué)性狀，參與異位灶局部的免疫耐受及EMT的發(fā)生發(fā)展。而CCR9的惟一配體為趨化因子受體配體25(CCL25)，兩者通常相互作用參與疾病發(fā)生發(fā)展。本研究探討CCR9、CCL25在EMT患者異位子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月～2019年6月在徐州市婦幼保健院婦科住院的EMT患者55例(EMT組)，行腹腔鏡、宮腔鏡手術(shù)治療，且經(jīng)術(shù)后病理檢查確診?；颊吣挲g23～49歲；月經(jīng)周期(30.51±2.64)d，月經(jīng)持續(xù)時(shí)間(5.58±1.12)d；卵巢型EMT 44例、深部浸潤型EMT 11例；按1997年修訂的美國生育學(xué)會(huì)分期標(biāo)準(zhǔn)，EMT分期Ⅰ期(微型，1～5分)7例、Ⅱ期(輕型，6～15分)17例、Ⅲ期(中型，16～40分)28例、Ⅳ期(重型，40分以上)3例；子宮內(nèi)膜增殖期32例，分泌期23例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《婦產(chǎn)科學(xué)》第9版中EMT的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)腹腔鏡、宮腔鏡手術(shù)及術(shù)后病理檢查確診；術(shù)前6個(gè)月內(nèi)未接受過激素類藥物治療；無其他嚴(yán)重器質(zhì)性病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：妊娠期、哺乳期；婦科惡性腫瘤。選取同期子宮肌瘤、單純卵巢囊腫、子宮內(nèi)膜息肉等非EMT患者35例為對(duì)照組，均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診?；颊吣挲g24～48歲；月經(jīng)周期(30.66±2.70)d，月經(jīng)持續(xù)時(shí)間(5.80±1.02)d；子宮內(nèi)膜增殖期20例，分泌期15例。兩組年齡、月經(jīng)周期、月經(jīng)持續(xù)時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。本研究經(jīng)徐州市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，兩組均簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本收集方法 術(shù)中收集對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜及EMT組在位內(nèi)膜、異位內(nèi)膜組織，經(jīng)生理鹽水沖洗和紗布蘸干后，將部分標(biāo)本置于10%甲醛緩沖溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋；另取部分標(biāo)本置于液氮中保存，根據(jù)術(shù)后病理檢查結(jié)果標(biāo)記并保存于-80 ℃冰箱中保存。

1.3 兩組子宮內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取包埋蠟塊做成連續(xù)切片，厚度4 μm，隨機(jī)選取4張切片做免疫組化染色。常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫浸泡玻片10 min，去除過氧化物干擾，PBS水沖洗后置于抗原修復(fù)液中微波處理至沸騰，移至95 ℃水浴30 min；加一抗CCR9兔多克隆抗體/CCL25兔單克隆抗體(abcam公司)4 ℃過夜；加生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察顯色效果，及時(shí)終止顯色；常規(guī)復(fù)染、返藍(lán)、脫水及封片；光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)染色為棕黃色或棕褐色為CCR9、CCL25蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞。根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分：無染色為0分，淺棕黃色為1分，呈現(xiàn)棕黃色為2分，棕褐色為3分。每張切片選擇10個(gè)視野進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算平均值。

1.4 兩組子宮內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法。取組織標(biāo)本各30 mg，剪碎，加入TRIzol(Vazyme公司)200 μL，經(jīng)超聲研磨碎裂；加TRIzol 800 μL混勻，室溫靜置5 min；加入氯仿200 μL，充分混勻；經(jīng)4℃ 12 000 g離心15 min后取上清液；加入異丙醇500 μL，混勻、靜置10 min；經(jīng)4 ℃ 12 000 g離心10 min后棄上清液，吸干，加75%乙醇1 mL混勻；經(jīng)4 ℃ 7 500 g離心5 min后棄上清液，吸干，經(jīng)4 ℃ 5 000 g離心3 min后棄上清液，吸干，靜置至乙醇完全揮發(fā)；加入DEPC水66 μL混勻；用Nanodrop 2000微量紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)RNA在260、280 nm處的純度和濃度，獲得總RNA；再按照Vazyme公司提供的Hiscript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)說明書進(jìn)行操作，獲得cDNA置于-20 ℃保存。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)，以GAPDH作為內(nèi)參。CCR9正向引物序列為5′-TCCTCTTTCTTGTCACTCTTCC-3′，反向引物序列為5′-CAACACACAGCTGTAGAAGTTC-3′；CCL25正向引物序列為5′-TATTCTACCTCCCCAAGAGACA-3′，反向引物序列為5′-GATGGGATTGCTAAACTTGGAC-3′；GAPDH正向引物序列為5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引物序列為5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。嚴(yán)格按照康為世紀(jì)公司提供的UItraSYBR Mixture說明書進(jìn)行操作，經(jīng)Roche LightCycler 480 PCR儀檢測(cè)獲得數(shù)據(jù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組子宮內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25蛋白的表達(dá) EMT組異位內(nèi)膜組織、在位內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜組織(P均<0.05)，且EMT組異位內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25蛋白相對(duì)表達(dá)量高于在位內(nèi)膜組織(P均<0.05)，見表1。EMT組不同分期異位內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表2。EMT組浸潤型內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25蛋白相對(duì)表達(dá)量高于卵巢型內(nèi)膜組織(P<0.05)，見表3。

表1 兩組子宮內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25蛋白表達(dá)比較

表2 EMT組不同分期異位內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25蛋白表達(dá)比較

表3 EMT組不同分型異位內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25蛋白表達(dá)比較

2.2 兩組子宮內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25 mRNA的表達(dá) EMT組異位內(nèi)膜組織、在位內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組正常子宮內(nèi)膜組織(P均<0.05)，且EMT組異位內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于在位內(nèi)膜組織(P均<0.05)，見表4。EMT組不同分期異位內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表5。EMT組浸潤型內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于卵巢型內(nèi)膜組織(P<0.05)，見表6。

表4 兩組子宮內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25 mRNA表達(dá)比較

表5 EMT組不同分期異位內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25 mRNA表達(dá)比較

表6 EMT組不同分型異位內(nèi)膜組織中CCR9、CCL25 mRNA表達(dá)比較

3 討論

EMT是一種極其復(fù)雜的疾病，病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，因此探討其發(fā)生發(fā)展機(jī)制成為目前研究熱點(diǎn)。EMT的發(fā)病機(jī)制主要為經(jīng)血逆流學(xué)說，同時(shí)內(nèi)分泌、免疫炎癥、遺傳、局部微環(huán)境等多種因素可能參與其中[7]。研究表明，炎癥反應(yīng)、免疫異常是其發(fā)病的病理基礎(chǔ)，特定細(xì)胞黏附、侵襲、促使血管生成是其發(fā)生發(fā)展的基本環(huán)節(jié)[8]。EMT根據(jù)異位病灶部位分為卵巢型、腹膜型、深部浸潤型及其他部位型。卵巢最易被異位內(nèi)膜侵犯，是最典型的EMT類型。而深部浸潤型EMT是EMT的一種特殊類型，是指病灶浸潤深度≥5 mm，可累及盆腔不同部位，主要位于后盆腔，累及部位如宮骶韌帶、直腸子宮陷凹、陰道穹隆、陰道直腸隔及結(jié)直腸壁等[9]。深部浸潤型EMT的主要臨床癥狀為疼痛、不孕，疼痛包括痛經(jīng)、慢性盆腔痛、深部性交痛及消化泌尿系統(tǒng)相關(guān)的疼痛等。近年來，其發(fā)病率在逐漸升高，患者趨向年輕化，嚴(yán)重影響患病女性的生活和工作[10]。目前臨床上深部浸潤型EMT疼痛的治療主要以手術(shù)為主，但手術(shù)難度高、安全性難保證，且術(shù)后存在并發(fā)癥。

近年來，趨化因子及其受體在EMT發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸受到重視。趨化因子是一類能趨化特定細(xì)胞定向遷移的低分子分泌蛋白，由70～100個(gè)氨基酸組成，根據(jù)其分子N末端半胱氨酸殘基的數(shù)目及結(jié)構(gòu)排列可分為4個(gè)亞科[11]：CC類、CXC類、XC類、CX3C類。CCR是一類介導(dǎo)趨化因子行使特定功能的GTP-蛋白偶聯(lián)的跨膜受體，通常表達(dá)于多種細(xì)胞表面(免疫細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞膜上)，可分為四個(gè)亞家族[12]：CCR、CXC類受體(CXCR)、C類受體(XCR)和CX3C類受體(CX3CR)。研究證實(shí)，EMT患者盆腹腔內(nèi)環(huán)境中多種趨化因子表達(dá)水平升高，并與該疾病嚴(yán)重程度有著密切聯(lián)系[13～15]。CCR9在EMT患者異位灶中的表達(dá)高于正常子宮內(nèi)膜[16，17]。研究表明，CCR9主要表達(dá)于未成熟T細(xì)胞上，如雙陽性T細(xì)胞、腸道相關(guān)T細(xì)胞等，CCR9可通過CCL25刺激T細(xì)胞發(fā)育，進(jìn)行組織特異性歸巢[18]。CCL25為CCR9的惟一配體，也被證實(shí)是EMT發(fā)病和進(jìn)展的重要危險(xiǎn)因素[5]。但相關(guān)研究均未從臨床角度研究二者表達(dá)變化。

本研究免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示，CCR9、CCL25蛋白在異位內(nèi)膜組織中表達(dá)高于在位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜，而其在位內(nèi)膜表達(dá)量高于正常子宮內(nèi)膜，驗(yàn)證了國內(nèi)外學(xué)者的研究[16，17]結(jié)果。另外，CCR9、CCL25蛋白在不同分期EMT患者的異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可見隨著病情嚴(yán)重程度增加而CCR9、CCL25蛋白表達(dá)量升高，且CCR9、CCL25蛋白在深部浸潤型異位灶表達(dá)量高于卵巢型異位灶。同時(shí)，進(jìn)一步用RT-qPCR法檢測(cè)，獲得的結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。相關(guān)研究證實(shí)，CCL25通過其受體CCR9趨化淋巴細(xì)胞聚集至病變結(jié)腸，并進(jìn)一步激活淋巴細(xì)胞，最終導(dǎo)致Th2介導(dǎo)的腸道黏膜炎癥，即CCL25和CCR9異常表達(dá)及其相互作用參與調(diào)節(jié)結(jié)腸炎癥反應(yīng)[19，20]。

綜上所述，CCR9、CCL25在EMT患者異位內(nèi)膜組織中呈高表達(dá)，且二者的表達(dá)與EMT分期、分型有關(guān)。CCR9、CCL25隨著EMT病變的加重而表達(dá)量增加，二者可能促進(jìn)EMT的發(fā)生進(jìn)展。但本研究所選樣本較為典型，僅論證了CCR9、CCL25在卵巢型及深部浸潤型異位灶中的表達(dá)；本研究缺乏合并腸道相關(guān)性疾病的患者，下一步需將其納入研究，為深部浸潤型EMT發(fā)病機(jī)制的研究提供新思路。