郝志明，章 悅，張力菁，溫樹敏，劉桂茹，王睿輝

(河北農業(yè)大學 農學院/華北作物種質資源研究與利用教育部重點實驗室，河北 保定 071001)

麥紅吸漿蟲 (Sitodiplosis mosellana Géhin) 是嚴重影響我國小麥生產的重要害蟲，以幼蟲吸食灌漿期小麥籽粒汁液造成為害，使受害籽粒空癟，導致小麥產量和品質下降。一般情況下，受害麥田減產幅度在10%～60%之間，嚴重為害時甚至顆粒無收［1-2］。在包括加拿大、美國、英國、德國在內的小麥主產國，均有麥紅吸漿蟲造成嚴重損失的報 道［3-7］。在我國，麥紅吸漿蟲曾于20 世紀50 年代和80 年代兩度嚴重爆發(fā)，造成小麥大規(guī)模損失［8-9］。21 世紀以來，麥紅吸漿蟲危害仍為嚴重。近年來，我國小麥吸漿蟲年均發(fā)生面積在2.0×106hm2左右 (http://www.agri.gov.cn/)，已成為影響華北、黃淮和西北麥區(qū)小麥生產的重要蟲害 (https://www.natesc.org.cn/)。生產上，可通過噴灑農藥、輪作倒茬或種植抗蟲小麥品種等方法對吸漿蟲進行防治［4,10-11］，其中選用抗蟲品種是最為經濟、安全、有效的控制措施［12］。雖然20 世紀選育的抗吸漿蟲小麥品種如‘西農6028’‘南大2419’等對防治蟲害發(fā)揮了作用，但目前抗蟲品種匱乏的現(xiàn)狀仍未得到顯著改變［8］。同時，由于吸漿蟲危害的毀滅性，小麥對吸漿蟲抗性遺傳的復雜性以及人工抗蟲鑒定的不穩(wěn)定性，使得小麥抗蟲育種進展緩慢［13-14］。而分子標記輔助選擇 (Marker-assisted selection, MAS) 技術在小麥等主要作物育種中的應用，能夠顯著提高針對目標性狀的育種效率，同時有利于實現(xiàn)目標性狀與其他優(yōu)良性狀的同步改良［15-16］。因此，開發(fā)與抗吸漿蟲基因/QTL 緊密連鎖甚至共分離的分子標記，不僅能夠提高抗蟲育種效率，還有利于實現(xiàn)抗蟲性與其他優(yōu)良品質性狀的聚合。

Sm1 是最早發(fā)現(xiàn)并被定位的小麥抗麥紅吸漿蟲基因［3,17］，與該基因連鎖的標記Xbarc35 和XWM1已被應用于小麥MAS 育種中［18］；后來Kassa 等人又找到7 個與抗蟲性緊密連鎖的競爭性等位基因特異性PCR (KASP, Kompetitive Allele-Specific PCR) 標記，可用于鑒定抗/感蟲單倍型［19］。而中國小麥品種可能攜帶了與Sm1 不同的抗性基因。來自國外抗蟲基因Sm1 的連鎖標記雖已被應用于當?shù)匦←溈瓜x品種的培育中，但這些標記在我國小麥品種中要么不具多態(tài)性，要么檢測結果與抗蟲性不相符，并不適用于我國小麥品種的抗蟲性鑒定［20］。有鑒于此，開發(fā)我國小麥種質中與抗蟲位點緊密連鎖甚至共分離的分子標記，不但有助于準確鑒定我國小麥種質資源的抗蟲性，也能更好地滿足國內抗蟲分子標記輔助育種的需要。

在前期研究中，通過對構建的2 個重組近交系 (RIL) 群體進行連鎖分析，將我國小麥品種中的抗蟲主效QTL 位點 (QSm.hbau-4A) 定位于4A 染色體上［13,20-21］；并利用混池轉錄組測序 (BSR-Seq)［22］方法結合 QTL-Seq［23］的分析思路，對抗/感蟲小麥樣本 (親本、混池及株系) 進行了轉錄組數(shù)據(jù)分析，結合基因功能注釋、qRT-PCR 及基因序列分析，在4AL 抗蟲候選區(qū)間中挖掘到6 個與抗蟲性緊密相關的基因［24］。其中2 個基因 (TraesCS4A01G436100, TraesCS4A01G437800) 不僅富集于與抗蟲性相關的異黃酮生物合成代謝通路 (Isoflavonoid biosynthesis pathway) 中，而且在抗、感近等基因系間的表達水平呈現(xiàn)顯著差異，因此為重點關注的基因。但由于基因TraesCS4A01G436100 在抗蟲親本‘冀麥24’中的序列上存在一個無義突變，導致編碼蛋白結構不完整，因此推測基因TraesCS4A01G437800 為抗蟲候選基因的可能性更高［24］。后來，利用上述6個抗蟲相關基因序列中存在的插入缺失 (InDel) 和單核苷酸多態(tài)性位點 (SNP) 成功開發(fā)了8 個標記，其 中6 個KASP 標 記 (K3-1-1、K3-7-1、K3-7-3、K3-16-1、K10-10-6 和K10-13-x) 和1 個EST 標 記 (E1-2) 可較好地檢測供試品種在QSm.hbau-4A 位點上的基因型［25］。雖然KASP 技術可以很好地將基因序列中存在的差異位點 (SNP/InDel) 轉化為可分型的標記，并可以簡便、快速地檢測標記在供試材料中的分型，但開發(fā)成本較高［26］，對于需要進行大量分型檢測的MAS 而言，開發(fā)和使用成本較低且通量高的分子標記更具重要意義。四引物擴增受阻突變體系PCR (四引物ARMS-PCR, Tetra-primer amplification refractory mutation system PCR) 標記體系是一種在普通PCR 基礎上發(fā)展起來的單核苷酸多態(tài)性分型技術，與KASP 標記在原理及開發(fā)上具有相似性，即這2 種標記都是基于核苷酸序列中的差異位點，以突變位點作為引物的3’末端，并以相應3’末端堿基所對應的擴增目的片段的有無來確定分型結果［27］。四引物ARMS-PCR 標記解決了傳統(tǒng)方法分型通量低的問題，具有簡便、快速和費用低廉等特點，但對擴增條件要求更為嚴格，目前較為廣泛地應用于醫(yī)學［28-29］和水稻［30-32］研究中，在小麥中的應用相對較少［33］。

因此， 本研究根據(jù)推定抗蟲候選基因TraesCS4A01G437800 序列上的SNP 位點，設計并開發(fā)四引物ARMS-PCR 標記，并利用抗/感蟲RIL株系和不同抗性的小麥品種驗證標記在小麥吸漿蟲抗性鑒定中的可用性。

1 材料與方法

1.1 植物材料及DNA 提取

用于標記分型檢測的植物材料包括抗蟲小麥親本‘冀麥24’、感蟲小麥親本‘6218’，從6218/冀麥24 重組近交系 (RIL) 群體中選擇的47 個抗蟲RIL 株系和45 個感蟲RIL 株系，以及95 個具有不同抗性水平的小麥品種 (表1)。供試樣本在培養(yǎng)皿中生長，待生長至兩葉一心時剪取新鮮葉片，采用CTAB 法［34］提取小麥基因組DNA。

表1 供試小麥材料的表型及基因型Table 1 The phenotypes and genotypes for selected wheat materials

續(xù)表：

續(xù)表：

1.2 供試小麥材料的抗蟲性鑒定

利用抗性指數(shù)對小麥材料的抗蟲性進行評價［13］。 在小麥灌漿至乳熟期時，每重復、每株系取10 ～15個穗子，密封于紙袋中，帶回室內對籽粒上的蟲子進行計數(shù)。根據(jù)籽粒上吸漿蟲數(shù)目，將待鑒定小麥株系的籽?？剐苑譃? 級，根據(jù)以下公式計算每個株系的估計損失率(L)［2,13］：

L(%) = Σ(xf) / 4Σf × 100%

式中，x 為相應子粒的抗性級別，f 為各級別的籽粒數(shù)目。

用每個株系的估計損失率 (L) 除以全部參試株系( 品種) 的平均估計損失率 (ML)，計算出抗性指數(shù) (RI) 來確定株系的抗性分級。當同一株系在不同重復間的鑒定結果存在較大差異時，以最重重復數(shù)據(jù)進行L、RI 值的估算［2］?；赗I 值將供試小麥材料的抗性分為免疫 (RI=0) (Immune, I)、高抗 (0.01 ≤RI ≤0.19) (Highly resistant, HR)、 中抗 (0.20 ≤RI＜0.49) (Moderately resistant, MR)、低 抗 (0.50 ≤RI＜0.99) (Lowly resistant, LR)、感 蟲 (1.00 ≤RI＜1.50) (Susceptible, S) 和高感 (RI ≥1.50) (Highly susceptible, HS)。

1.3 抗蟲相關基因序列檢測

對推定抗蟲候選基因TraesCS4A01G437800［35］進行四引物ARMS-PCR 標記開發(fā)。從‘中國春’參考基因組 (IWGSCv1.0, https://wheat-urgi.versailles.inra.fr/) 中提取該基因的參考序列及其側翼序列，用Primer 5 軟件設計測序引物 (表2)。利用高保真酶擴增該基因在小麥親本 (‘冀麥24’‘6218’) 中的序列。PCR 擴增采用10 μL 反應體系，包括模板DNA 50 ng、正反引物各0.4 μmol/L、1×Pfu PCR MasterMix (天根生化科技(北京)有限公司)。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 終延伸5 min。擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳分離，對目的條帶進行回收，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。將測序結果與‘中國春’ (IWGSCv1.0) 的基因組序列進行比對。

表2 基因TraesCS4A01G437800 的測序引物Table 2 Sequencing primer for gene TraesCS4A01G437800

1.4 四引物擴增受阻突變體系PCR 標記的設計與開發(fā)

根據(jù)基因的測序結果，對抗、感親本間存在的SNP 位點設計并開發(fā)四引物ARMS-PCR 標記。根據(jù)SNP 側翼各300 bp 的序列設計多對外引物，并根據(jù)SNP 兩側相鄰序列設計退火溫度、GC 含量較為適宜的內引物，再利用引物設計軟件 (Primer 5) 對設計的引物質量進行評判，選擇評分最好的引物進行后續(xù)試驗。對設計好的引物采用Taq DNA 聚合酶進行PCR 擴增。優(yōu)化的擴增反應體系包括模板DNA 50 ng、外引物各0.16 μmol/L、內引物各0.24 μmol/L、1×Es Taq MasterMix (5 μL)。擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。擴增產物在30 %的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染顯色。統(tǒng)計全部樣本的基因型 (帶型)，分別計算該標記在高抗品種、中抗品種、感蟲品種和高感品種中的檢測有效率 (即檢測基因型與某一表型吻合的品種數(shù)占該表型品種數(shù)的百分比)，計算方法如下：

檢測有效率(抗蟲品種)=檢測出抗蟲基因型的抗蟲品種數(shù)/抗蟲品種總數(shù)。

檢測有效率(感蟲品種)=檢測出感蟲基因型的感蟲品種數(shù)/感蟲品種總數(shù)。

2 結果與分析

2.1 基因序列分析

對抗蟲相關基因TraesCS4A01G437800 的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)該基因在抗、感小麥親本中均能擴增到目的大小的條帶。將目的條帶的測序結果與參考序列比對，結果顯示該基因在兩親本中的測序結果與參考基因序列相符。在兩小麥親本 (‘冀麥24’‘6218’) 間進行序列比對，發(fā)現(xiàn)存在1 個使氨基酸發(fā)生改變的非同義突變SNP，位于748 bp 處，該位點在‘中國春’和感蟲親本‘6218’中的堿基為“G”，而在抗蟲親本‘冀麥24’中的堿基為“T” (圖1)。將這個SNP 位點及其側翼序列與小麥參考基因組 (IWGSCv1.0) 比對，發(fā)現(xiàn)在參考基因組中全部同源序列對應的堿基位點上，都不存在突變型堿基“T”，即該SNP 在抗蟲親本中的突變?yōu)榛蚪M特異性突變，因此該特異性SNP 位點可用于標記開發(fā)。

2.2 四引物ARMS-PCR 標記T3-1-1 的多態(tài)性檢測

根據(jù)基因TraesCS4A01G437800 上的特異性SNP 位點設計了四引物ARMS-PCR 標記T3-1-1 (表3)。經檢測，T3-1-1 在兩小麥親本間均能檢測出相應的分型，且具有多態(tài)性。該標記在兩親本中，均能擴增出170 bp 的外引物擴增條帶；在感蟲親本‘6218’中能擴增出111 bp 的條帶 (B 帶型)，在抗蟲親本‘冀麥24’中能擴增出96 bp 和111 bp 的雜合條帶 (H 帶型)，所擴增出條帶片段大小符合預期 (圖2)。根據(jù)該標記位點側翼序列與小麥參考基因組序列 (IWGSCv1.0) 的比對結果得知，該序列在參考基因組中存在多個同源序列，且每個同源序列在標記位點上的堿基均為“G”，因此無論在抗、感蟲小麥親本中均能擴增出等位基因型 “G” 的條帶 (111 bp)；而在抗蟲親本中，標記位點的堿基為“T”，該突變在基因組中任何一個同源序列上均不存在，因此只能在抗蟲親本中擴增出等位基因型 “T” 的條帶 (96 bp)。根據(jù)這一擴增特性，可以在供試材料中檢測出具有抗蟲標記位點和不具有抗蟲標記位點的小麥品種(株系)。

圖 1 基因TraesCS4A01G437800 在兩小麥親本間 (‘6218’與‘冀麥24’) 的序列比對Fig. 1 Sequence comparisons of gene TraesCS4A01G437800 aligned with two wheat parents (‘6218’ and ‘Jimai 24’)

表3 四引物ARMS-PCR 標記T3-1-1 的引物序列Table 3 Primer sequences for tetra-primer ARMS-PCR marker T3-1-1

圖2 四引物ARMS-PCR 標記T3-1-1 在抗、感蟲小麥親本及部分RIL 系中的擴增結果Fig. 2 Molecular detection of two parents and partial RIL lines by tetra-primer ARMS-PCR markers of T3-1-1

2.3 四引物ARMS-PCR 標記T3-1-1 的有效性檢測

檢測結果顯示，T3-1-1 在小麥抗蟲RIL 株系中的檢測有效率為87.23 %，在感蟲RIL 株系中的檢測有效率為95.56 %。在供試95 個小麥品種中，該標記在高抗品種、中抗品種、感蟲品種和高感品種中的檢測有效率分別為63.16 %、12.50 %、75.00 %和96.43 % (圖3)；即在34.88 %的抗蟲品種 (高抗和中抗) 中檢測出抗蟲標記位點 (H 帶型)，在90.% 的感蟲品種 (感蟲和高感) 中檢測出純合感蟲標記位點 (B 帶型)。這說明，如果在供試品種中檢測到抗蟲標記位點，則該品種為抗蟲品種 (具有QSm.hbau-4A 抗蟲位點) 的可能性約為90 %、為感蟲品種 (基因型與表型不相符) 的概率為10 %，因此這個標記可以較好地篩選具有QSm.hbau-4A 位點的抗蟲小麥種質。

利用該標記，檢測出20 份小麥品種具有抗蟲位點 (帶型同抗蟲親本‘冀麥24’)，其中包括14 個抗蟲品種，分別是‘南大2419’ (1932 年引進種質)、‘中農28’ (1932 年引進種質)、‘西農6028’ (1956 年審定，下同)、‘豐產2 號’ (1968)、‘晉麥33’(1985)、‘冀麥23’ (1986)、‘河農215’ (與‘冀麥23’、‘冀麥24’互為姊妹系)、‘晉麥47’ (1998)、‘邯麥9 號’ (2003)、‘石家莊11 號’ (2003) 、‘石麥12 號’ (2004)、‘河農4198’ (2005)、‘小偃81’ (2005)、‘河農6049’ (2008)，5 個感蟲或中間型 (低抗) 品種 (‘洛麥21’‘石家莊8 號’‘藁優(yōu)9908’‘河農826’‘冀糯200’)，1 個無表型鑒定結果的品種 (‘咸農39’) (表1)。可以看出，在具有抗蟲位點的14 個抗蟲品種中，多為生產上已停止推廣的老品種，比較新的品種審定時間也在10年以上。因此，利用已有的抗蟲小麥品種和新開發(fā)的分子標記鑒定和創(chuàng)新小麥抗蟲種質資源尤為重要。

圖3 標記T3-1-1 在供試小麥品種中不同抗性級別下各基因型所占個數(shù)Fig. 3 The number of genotypes for T3-1-1 in tested wheat cultivars for each resistance evaluation

3 討論

3.1 四引物ARMS-PCR 標記與KASP 標記檢測結果的比較

在前期研究中，基于基因TraesCS4A01G437800 上的這個SNP 位點已成功開發(fā)1 個KASP 標記K3-1-1，通過檢測發(fā)現(xiàn)K3-1-1 同樣可在抗蟲親本中檢測出雜合分型T:G (同H 帶型)，在感蟲親本中檢測出純合分型G:G (同B 帶型)。該標記在抗蟲RIL 株系中的檢測有效率為86.67%，在感蟲RIL 株系中的檢測有效率為 95.56%；在供試高抗小麥品種、中抗品種、感蟲品種和高感品種中，該標記的檢測有效率分別為61.11%、13.64%、75.00%和100.00%［25］。可以看出，本研究基于該SNP 位點開發(fā)的四引物ARMSPCR 標記T3-1-1 與KASP 標記K3-1-1 在相應供試材料間的檢測有效率基本一致。根據(jù)表1 可知，除6份分型數(shù)據(jù)缺失的小麥材料 (RIL-38、RIL-218、‘小偃81’‘白硬冬2 號’‘煙農23’和‘冀糯200’) 外，標記K3-1-1 與T3-1-1 僅在1 個品種中的檢測結果不同，即T3-1-1 對‘豐產2 號’檢測出雜合型 (H 帶型)，而K3-1-1 對該品種檢測出純合抗蟲分型T:T。由于理論上K3-1-1 和T3-1-1 對供試材料的檢測結果僅可能為雜合型或純合感蟲基因型，不會檢測出純合抗蟲基因型，因此推測K3-1-1 對‘豐產2 號’檢測出純合抗蟲分型可能是由于該品種在標記位點兩側的序列與其同源序列差異較大所造成的，有待后續(xù)檢驗。除在‘豐產2 號’中的檢測結果不同外，K3-1-1與T3-1-1對其他全部材料的基因型檢測結果均相同，表明四引物ARMS-PCR 標記技術是開發(fā)小麥分子標記的可行方法，所開發(fā)的標記可準確檢測供試小麥材料的基因型。因此，本研究開發(fā)的四引物ARMSPCR 標記可對小麥種質資源進行抗蟲等位基因型選擇，并為在小麥中開發(fā)分子標記的方法提供了一個重要參考。

3.2 四引物ARMS-PCR 標記T3-1-1 的應用及展望

本研究根據(jù)前期BSR-Seq 分析結果，結合qRTPCR、KEGG Pathway、基因功能注釋及基因序列分析初步確定的抗蟲候選基因TraesCS4A01G437800上的SNP 位點，利用四引物ARMS-PCR 技術開發(fā)了1 個抗蟲相關標記T3-1-1。在供試小麥材料中進行基因型檢測發(fā)現(xiàn)，該標記在感蟲小麥品種中的檢測有效率高 (90%)，而在抗蟲小麥品種中的檢測有效率較低 (34.88 %)，表明在一些小麥品種的基因組中可能存在不同于QSm.hbau-4A 的抗蟲基因/QTL。由于T3-1-1 在感蟲小麥品種中的檢測有效率高達90%，因此在供試感蟲品種中檢測出抗蟲基因型的可能性低 (即檢測錯誤率為10%)；反之，只要在供試材料中檢測出抗蟲基因型，則該品種實際為抗蟲品種的可能性在90%左右。因此該標記可作為專門篩選抗蟲小麥種質的標記。通過圖3 可以看出，大多數(shù)高抗小麥品種 (63.16%) 都具有抗蟲等位位點，而其他表型的品種很少具有該抗蟲等位位點，因此該標記可以很好地檢測供試小麥品種是否具有QSm.hbau-4A 抗蟲位點，對我們篩選具有QSm.hbau-4A 位點抗蟲種質以及鑒定早代育種材料的抗蟲性具有重要幫助。本研究中，有14 個抗蟲品種被檢測到攜帶了標記T3-1-1 的抗蟲等位基因 (表1)，這些品種多為生產上已經停止推廣的老品種，比較近的品種其審定時間也在10 年以上，因此有效利用老品種創(chuàng)新小麥抗蟲資源的任務十分迫切。

本研究基于混池轉錄組測序并結合多種方法, 快速準確地實現(xiàn)了潛在功能標記的開發(fā)。雖然目前尚未實現(xiàn)抗蟲主效QTL 的圖位克隆，但所獲得的抗蟲相關標記T3-1-1 在作圖群體和不同抗性小麥品種中被證明是有效的, 不僅能用于鑒定小麥種質資源抗蟲性, 還可對小麥抗吸漿蟲主效QTL 的精細定位和圖位克隆提供重要幫助。

4 結論

本研究基于抗蟲候選基因TraesCS4A01G437800序列上的SNP 位點成功設計并開發(fā)了1 個四引物ARMS-PCR 標記，該標記在抗、感RIL 株系間的檢測有效率在90%左右，在抗蟲小麥品種中的檢測有效率為34.88%，而在感蟲品種中的檢測有效率可達90%，因此對于鑒定出抗蟲基因型的小麥品種來說，其表型符合基因型 (為抗蟲品種) 的可能性為90%左右，可用于抗蟲小麥種質資源篩選與抗蟲性MAS育種。此外，具有抗蟲位點的14 個抗蟲小麥品種多為生產上已停止推廣的老品種，因此鑒定并創(chuàng)新小麥抗蟲種質資源尤為重要。