鄭曉倩 金傳山 張亞中 劉軍玲 俞年軍 歐金梅

中圖分類號(hào) R282.71;R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）10-1185-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.10.06

摘 要 目的：建立測定3種藥用石斛中3種單/雙糖成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜-電噴霧式檢測器法。色譜柱為Shodex Asahipak NH2P-50 4E，流動(dòng)相為乙腈-水（75 ∶ 25，V/V），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 ?L，數(shù)據(jù)采集頻率為5 Hz，過濾常數(shù)為5 s，霧化器溫度為35 ℃，氣源為氮?dú)猓瑝毫?.012×105 Pa。結(jié)果：果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.156 2～1.873 8 mg/mL（r=0.999 5）、0.012 7～0.152 4 mg/mL（r=0.999 7）、0.277 6～3.331 2 mg/mL（r=0.999 8）;定量限分別為0.002 61、0.004 24、0.005 12 mg/mL，檢測限分別為0.000 78、0.001 27、0.001 54 mg/mL;精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性試驗(yàn)的RSD均小于3%，加樣回收率分別95.98%～98.15%（RSD=0.83%，n=6）、95.64%～98.62%（RSD=1.10%，n=6）、97.53%～98.94%（RSD=0.53%，n=6）;含量分別為0.28%～1.12%、0.02%～0.13%、0.76%～2.67%;總含量為1.38%～3.10%。3種石斛中糖類成分含量高低依次為蔗糖>果糖>D-無水葡萄糖，其中蔗糖含量及總含量高低依次均為霍山石斛>銅皮石斛>鐵皮石斛，D-無水葡萄糖含量高低依次為霍山石斛>鐵皮石斛>銅皮石斛，果糖含量高低依次為銅皮石斛>鐵皮石斛>霍山石斛。結(jié)論：所建方法靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡單，可用于測定3種藥用石斛中3種糖類成分的含量;3種藥用石斛中糖類成分的含量存在差異。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜-電噴霧式檢測器法;霍山石斛;鐵皮石斛;銅皮石斛;單糖成分;雙糖成分;含量測定

Content Determination of 3 Saccharides in 3 Kinds of Medicinal Dendrobii Caulis by HPLC-CAD

ZHENG Xiaoqian1，JIN Chuanshan1，ZHANG Yazhong2，LIU Junling2，YU Nianjun1，OU Jinmei1（1. College of Pharmacy， Anhui University of TCM， Hefei 230012， China; 2. Anhui Institute for Food and Drug Control， Hefei 230051， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the content determination method of 3 mono/disaccharides in 3 kinds of medicinal Dendrobii Caulis. METHODS： HPLC-CAD method was established. The determination was performed on Shodex Asahipak NH2P-50 4E column with mobile phase consisted of acetonitrile-water （75 ∶ 25，V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and sample size was 10 ?L. CAD detection condition included that data acquisition frequency was 5 Hz， filter constant was 5 s， atomization temperature was 35 ℃， gas source was nitrogen with pressure of 4.012×105 Pa. RESULTS： The linear range of fructose， D-anhydrous glucose and sucrose were 0.156 2-1.873 8 mg/mL（r=0.999 5）， 0.012 7- 0.152 4 mg/mL（r=0.999 7）， 0.277 6-3.331 2 mg/mL（r=0.999 8）， respectively. The limits of quantification were 0.002 61， 0.004 24 and 0.005 12 mg/mL， and the limits of detection were 0.000 78， 0.001 27 and 0.001 54 mg/mL， respectively. RSDs of precision， stability， reproducibility and durability tests were all lower than 3%. The recoveries were 95.98%-98.15%（RSD=0.83%， n=6）， 95.64%-98.62%（RSD=1.10%， n=6） and 97.53%-98.94%（RSD=0.53%， n=6）. The contents of them were 0.28%-1.12%， 0.02%-0.13%， 0.76%-2.67%， respectively. The total content was 1.38%～3.10%. The order of saccharide content in 3 kinds of Dendrobii Caulis was sucrose>fructose>D-anhydrous glucose; the order of sucrose content and total content were Dendrobium huoshanense>D. moniliforme>D. officinale; the order of D-anhydrous glucose content was D. huoshanense>D. officinale>D. moniliforme;? the order of fructose content was D. moniliforme >D. officinale >D. huoshanense. CONCLUSIONS： Established method is sensitive， reproducible and simple in operation， and can be used for content determination of 3 saccharides in 3 kinds of medicinal Dendrobii Caulis. There are differences in the contents of saccharides among 3 kinds of Dendrobii Caulis.

KEYWORDS? ?HPLC-CAD; Dendrobium huoshanense; Den- drobium officinale; Dendrobium moniliforme; Monosaccha- rides; Disaccharides; Content determination

石斛屬（Dendrobium）是蘭科大屬植物之一[1]，分布極其廣泛?！吨袊参镏尽分杏涊d的石斛藥用品種有近51種[2]，其中安徽霍山境內(nèi)及其鄰近山區(qū)主產(chǎn)的霍山石斛（Dendrobium huoshanense C. Z. Tang et S. J. Cheng）、鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）和細(xì)莖石斛（又名銅皮石斛）[Dendrobium moniliforme（L.）Sw.]等3種藥用石斛的臨床價(jià)值極高[3]。有研究表明，藥用石斛主要含有糖類[4]、生物堿類[5]、菲類[6]等成分，且糖類成分是該藥材發(fā)揮抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)血糖、增強(qiáng)免疫等[7-9]功效的重要活性成分，且該類成分的藥理活性與其單糖組成密切相關(guān)[1，10-11]。由此可見，測定藥用石斛中糖類成分的含量具有重要意義。目前，關(guān)于藥用石斛糖類成分中多糖的含量測定已有較多研究報(bào)道，但對(duì)于其單糖、雙糖的含量測定研究相對(duì)較少。單糖和雙糖是多糖組成的基礎(chǔ)，其中果糖具有養(yǎng)胃、護(hù)肝、潤腸、滑腸通便、平衡腸道菌群的活性，有預(yù)防便秘、腸炎、腸道癌的功效[12];葡萄糖具有營養(yǎng)、解毒、強(qiáng)心、利尿的作用，是機(jī)體所需能量的主要來源，除對(duì)肝臟具有保護(hù)和解毒作用外，還可加強(qiáng)記憶、刺激鈣質(zhì)吸收和促進(jìn)細(xì)胞間的溝通[13];蔗糖可以增加機(jī)體三磷酸腺苷的合成，有利于維持氨基酸的活力與蛋白質(zhì)的合成，具有解毒保肝、抑制細(xì)菌繁殖、止血、消炎、增強(qiáng)鈣鐵吸收等作用[14];且果糖、葡萄糖和蔗糖混合物具有補(bǔ)血的活性[15]。因此，測定藥材中單糖和雙糖的含量顯得十分重要。

有學(xué)者采用高效液相色譜（HPLC）-蒸發(fā)光散射法[16]和高效陰離子交換色譜-脈沖安培法[1]測定了藥用石斛中單糖和雙糖的含量，但蒸發(fā)光散射檢測的耐用性和穩(wěn)定性欠佳[17]，脈沖安培檢測的成本較高、穩(wěn)定性差且對(duì)色譜條件要求較為嚴(yán)格[18]。近年來，電噴霧式檢測器（CAD）作為一種新型的通用檢測器，可在一定程度上彌補(bǔ)上述檢測器的不足，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域，尤其是脂質(zhì)、糖類、生物堿類、甾體皂苷類等弱紫外吸收和無紫外吸收化合物的定量分析[19-21];此外，CAD還具有無需衍生化處理就可直接分離以測定單糖、雙糖的優(yōu)點(diǎn)[22]?；诖?，本研究采用HPLC-CAD法測定霍山石斛、鐵皮石斛、銅皮石斛等3種藥用石斛中單糖（果糖、葡萄糖）和雙糖（蔗糖）的含量，以探討不同來源藥用石斛的差異，旨在為霍山石斛、鐵皮石斛、銅皮石斛的鑒別提供依據(jù)，亦為藥用石斛的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate-3000型HPLC儀，包括Corona Ultra型電霧式檢測器、Chromeleon 7.1色譜工作站（美國Dionex公司）;Elma S120H型超聲波清洗機(jī)（德國Elma公司）;Simplicity-185型超純水儀（美國 Millipore公司）;YF-103型搖擺式6兩裝高速中藥粉碎機(jī)（瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）;HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）;ML204型萬分之一分析天平、XP26 型百萬分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥材

24批藥用石斛藥材（編號(hào)：S1～S24）均購自九仙尊霍山石斛股份有限公司，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定，S1～S8為霍山石斛（D. huoshanense C. Z.Tang et S. J. Cheng）、S9～S16為鐵皮石斛（D. officinale Kimura et Migo）、S17～S24為銅皮石斛[D. moniliforme（L.）Sw.]的莖。石斛樣品信息來源見表1。

1.3 試劑

果糖對(duì)照品（批號(hào)：100231-201305，純度：99.7%）、D-無水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：110833-201506，純度：99.9%）、蔗糖對(duì)照品（批號(hào)：111507-201303，純度：99.8%）均由中國食品藥品檢定研究院提供;乙腈為色譜純，乙醇、甲醇等其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E（250 mm×4.6 mm，5 ?m），流動(dòng)相：乙腈-水（75 ∶ 25，V/V）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：10 ?L;檢測器：CAD;數(shù)據(jù)采集頻率：5 Hz;過濾常數(shù)：5 s;霧化器溫度：35 ℃;氣源：氮?dú)?壓力：4.012×105 Pa。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取果糖對(duì)照品390.375 mg、D-無水葡萄糖對(duì)照品31.750 mg、蔗糖對(duì)照品694.050 mg，分別置于5 mL量瓶中，加80%乙醇溶解并定容，搖勻，制得各單一對(duì)照品貯備液。取上述各單一對(duì)照品貯備液1 mL，置于25 mL量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，混勻，制成果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖質(zhì)量濃度分別為3.123、0.254、5.552 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取藥用石斛藥材樣品粉碎，過三號(hào)篩，取粉末，約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加80%乙醇30 mL，超聲（功率：500 W，頻率：30 kHz）處理60 min，濾過，減壓回收溶劑，殘?jiān)舆m量80%乙醇溶解，并用80%乙醇定容至10 mL量瓶中，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 以80%乙醇為陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（以S4、S11、S24為例）、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于6 000，陰性對(duì)照對(duì)測定無干擾，詳見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于 10 mL量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，制成系列濃度工作溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分的質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果，果糖的回歸方程為y=44.665 7x-0.474 8（r=0.999 5）、D-無水葡萄糖的回歸方程為y=45.171 8x+0.133 0（r=0.999 7）、蔗糖的回歸方程為y=46.555 3x+0.350 1（r=0.999 8），上述3種成分檢測質(zhì)量濃度的線性范圍分別為0.156 2～1.873 8、0.012 7～0.152 4、0.277 6～3.331 2 mg/mL。

2.5 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用80%乙醇逐級(jí)稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別以信噪比10 ∶ 1、 3 ∶ 1計(jì)算定量限、檢測限。結(jié)果，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖的定量限分別為0.002 61、0.004 24、0.005 12 mg/mL，檢測限分別為0.000 78、0.001 27、0.001 54 mg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0 mL，置于5 mL量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，混勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD分別為1.1%、1.2%、1.0%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S4）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖峰面積的RSD分別為1.3%、1.4%、1.3%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取藥用石斛藥材樣品（編號(hào)：S4）粉末約1.0 g，共6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中3種成分的含量。結(jié)果，果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖含量的RSD分別為2.0%、1.4%、1.9%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（編號(hào)：S4）粉末約0.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液（含果糖3.001 6 mg/mL、D-無水葡萄糖1.303 mg/mL、蔗糖25.809 4 mg/mL）0.5 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 耐用性試驗(yàn)

取藥用石斛藥材樣品（編號(hào)：S4）粉末適量，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別以不同色譜柱[Shodex Asahipak NH2P-50 4E（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Agilent Zorbax NH2（250 mm×4.6 mm，5 ?m）、Phenomenex Luna? NH2（250 mm×4.6 mm，3 ?m）]、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中3種成分的含量，結(jié)果見表3。

2.11 樣品含量測定

取24批藥用石斛藥材樣品粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中3種成分的含量，結(jié)果見表4、圖2。

由圖2、表4可知，3種藥用石斛中糖類成分的含量高低依次為蔗糖>果糖>D-無水葡萄糖，其中蔗糖含量及總含量高低依次均為霍山石斛>銅皮石斛>鐵皮石斛，D-無水葡萄糖含量高低依次為霍山石斛>鐵皮石斛>銅皮石斛，果糖含量高低依次為銅皮石斛>鐵皮石斛>霍山石斛，提示3種石斛中糖類成分的含量存在差異。

3 討論

在前期預(yù)試驗(yàn)中，本課題組分別比較了以5種比例乙腈-水（83 ∶ 17、? 80 ∶ 20、78 ∶ 22、75 ∶ 25、70 ∶ 30，V/V）的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水（75 ∶ 25，V/V）為流動(dòng)相時(shí)所得的色譜峰分離度適宜，峰寬較小、峰高較高，且在20 min內(nèi)即可達(dá)到良好的分離效果，故選擇流動(dòng)相為乙腈-水（75 ∶ 25，V/V）。同時(shí)，本課題組在“耐用性試驗(yàn)”項(xiàng)下又考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流速的變化對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小;但當(dāng)流速為1.0 mL/min時(shí)，各色譜峰的分離度良好、峰寬較小，故選擇流速為1.0 mL/min。此外，本課題組在“耐用性試驗(yàn)”項(xiàng)下還考察了不同柱溫（25、30、35、40 ℃）對(duì)色譜峰分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫的變化對(duì)色譜峰保留時(shí)間、峰寬和分離度無明顯影響，考慮到試驗(yàn)操作的簡便性，最終選擇與試驗(yàn)環(huán)境溫度較為接近的30 ℃為柱溫。

本研究結(jié)果顯示，3種藥用石斛中均含有果糖、D-無水葡萄糖、蔗糖，但3種糖類成分的含量存在差異。3種藥用石斛中單、雙糖類成分總含量以霍山石斛最高，其次為銅皮石斛，鐵皮石斛最低;蔗糖、D-無水葡萄糖的含量以霍山石斛最高，果糖的含量以銅皮石斛最高。其原因可能與藥材的地域多樣性有關(guān)，即不同產(chǎn)地及栽培環(huán)境均可導(dǎo)致藥用石斛藥材中糖類成分含量存在差異[23]。而本研究中，由于3種藥用石斛的栽培環(huán)境不同，可能對(duì)植物體內(nèi)糖類成分的積累和代謝造成不同程度的影響;加之不同品種間的遺傳因素，可能也會(huì)影響糖類成分代謝的關(guān)鍵酶活性，從而改變糖類成分的積累或降解過程，導(dǎo)致糖類成分含量存在明顯差異[24]。此外，由于3種藥用石斛采集時(shí)的生長年限不同，造成了糖類成分在植物體內(nèi)積累程度不同，從而導(dǎo)致糖類成分含量有所差異[25]。糖類成分的含量能反映石斛藥材的信息，通過分析霍山石斛、鐵皮石斛、銅皮石斛中3種糖類成分含量存在的差異，可進(jìn)一步區(qū)分3種藥用石斛。

綜上所述，本研究所建HPLC-CAD法靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡單，可用于測定3種藥用石斛中3種糖類成分的含量;3種石斛中糖類成分的含量存在差異。

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（收稿日期：2019-12-10 修回日期：2020-03-31）

（編輯：陳 宏）