劉國民

摘? 要：本文旨在進一步探討豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV-2）的垂直傳播以及母豬接種PCV-2滅活疫苗對新生仔豬抵抗PCV-2感染的作用。試驗以從兩家豬場中隨機選擇的繁殖母豬及其所產(chǎn)仔豬為研究對象，將所選母豬隨機分入未接種疫苗的對照組和接種疫苗的試驗組。母豬斷奶后接種商用PCV-2滅活疫苗，18 d后對兩家豬場各一半的試驗?zāi)肛i接種疫苗。母豬分娩時，研究人員從兩家豬場分別采集70頭母豬的初乳，并在哺乳前（豬場1）或哺乳后（豬場2）從每窩中隨機選擇5頭仔豬采集血液樣本。檢測發(fā)現(xiàn)98.5%的初乳樣本含PCV-2抗體（135/137），且PCV-2抗體在免疫母豬的初乳中的分布率顯著更廣（P=0.003 9）。在仔豬中，43.9%的仔豬血清（301/685）呈PCV-2陽性，11.7%（80/686）呈PCV-2 DNA陽性。對所有PCV-2 DNA陽性樣本進一步分析后發(fā)現(xiàn)，28份樣本中的PCV-2為PCV-2a型，28份樣本中的為PCV-2b型，5份樣本中的PCV-2既有PCV-2a型又有PCV-2b型。PCV-2 DNA在仔豬群的流行性（0.7%～22.8%）低于早先的研究結(jié)果（44.8%～90%），說明很可能是由于母豬廣泛接種疫苗引起了PCV-2的生態(tài)學(xué)特性改變。在本研究的條件下，母豬接種PCV-2滅活疫苗可以降低所產(chǎn)仔豬因攝入初乳而引發(fā)的PCV-2病毒血癥的發(fā)病率。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型;病毒血癥;疫苗

中圖分類號：S851.33 文獻標(biāo)志碼：C 文章編號：1001-0769（2020）04-0020-06

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus type 2，PCV-2）是一種無包膜的單鏈環(huán)狀DNA病毒，與PCV-1同屬于環(huán)病毒科，對全球豬群有很高的致病性。PCV-2分為多個基因型，其中PCV-2b是豬群感染的PCV-2中的主要基因型。

PCV-2會導(dǎo)致豬群發(fā)生一系列臨床疾病，人們稱之為PCV相關(guān)病（PCV-associated Diseases，PCVAD）。在臨床上，PCVAD可能表現(xiàn)為仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征、呼吸道疾病、腸道疾病和母豬繁殖障礙，少數(shù)病豬還會發(fā)生豬皮炎腎病綜合征。PCV-2無處不在的特性歸功于它的傳播途徑多樣化，如它可通過口鼻、糞便、精液、胎盤以及初乳等途徑傳播。給生長豬接種PCV-2疫苗可以有效降低PCVAD的發(fā)病率和嚴重程度。

近來，人們將精力放在通過對繁殖母豬接種PCV-2疫苗來預(yù)防生長豬發(fā)生PCV-2上。業(yè)已證明，母豬感染PCV-2后可以產(chǎn)生病毒血癥，并且會感染子宮中的胎兒。有趣的是，在發(fā)生病毒血癥期間，母豬仍能產(chǎn)下大量的仔豬，且所產(chǎn)仔豬似乎很健康。最近，美國的科研人員對5個商用繁殖母豬群進行了一項田間調(diào)查，以研究PCV-2的垂直傳播情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCV-2 DNA在母豬群中的總體流行率為69.5%（89/128），在仔豬群中的流行率為44.8%（226/504）。另一個研究小組發(fā)現(xiàn)三家豬場的新生仔豬發(fā)生PCV-2病毒血癥的比例介于58%～90%。

本研究旨在確定先前母豬群和仔豬群暴發(fā)的高比例PCV-2病毒血癥是否也在2011年美國艾奧瓦州的繁殖豬場中發(fā)生，以及探討母豬接種PCV-2滅活疫苗是否會影響PCV-2的垂直傳播。

1? 材料與方法

1.1 豬場

豬場1是一家多點式從繁殖到斷奶的豬場，有將近2 400頭繁殖母豬。母豬采用人工授精的方式配種，精液由美國艾奧瓦州的一家種豬場提供。豬場2是一家獨立的繁殖場，有將近2 700頭繁殖母豬，母豬采用與豬場1相同的配種方式。兩家豬場的所有母豬都在分娩前接種大腸桿菌（Escherichia Coli）疫苗。所有繁殖母豬在斷奶時按照常規(guī)免疫方案接種可預(yù)防豬細小病毒病、細螺旋體病和豬丹毒的疫苗，豬場2的母豬還接種豬流感疫苗。盡管經(jīng)血清學(xué)檢測兩家豬場的繁殖母豬為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）陽性，但我們?nèi)哉J為這些母豬群在PRRSV的流行上處于穩(wěn)定狀態(tài)，它們能夠生產(chǎn)出PRRSV-RNA陰性的仔豬。引進的母豬或者豬場一直飼養(yǎng)的母豬未接種PCV-2滅活疫苗。

1.2 實驗設(shè)計、疫苗接種方案、樣本選擇方式和母豬的繁殖參數(shù)

每家豬場選擇約100頭同步發(fā)情的母豬，按胎次（1胎～10胎）隨機平均分入需接種疫苗的試驗組（組內(nèi)的母豬簡稱“免疫母豬”，50頭）和不需接種疫苗的對照組（組內(nèi)的母豬簡稱“未免疫母豬”，50頭）。每組的初乳樣本只從35頭母豬上采集，其余15頭為備用母豬，以確保在研究小組到達豬場時所選母豬中有35頭同時分娩，從而可以防止因母豬懷孕失敗或預(yù)產(chǎn)期不正確或分娩時未助產(chǎn)而出現(xiàn)分娩母豬數(shù)量不足的情況。一旦35窩仔豬的樣本采集到位，采樣工作立即停止，其余母豬不再采樣和收集數(shù)據(jù)。

母豬斷奶時，在試驗組母豬頸部右側(cè)肌肉接種2 mL Suvaxyn PCV疫苗（美國富道動物保健有限公司生產(chǎn)）;18 d后于相同部位進行一次加強免疫，劑量為1 mL。所有母豬都于斷奶后第一次發(fā)情時進行人工授精。

在母豬分娩時，從每組中隨機選擇35頭母豬，收集它們的初乳樣本，再從每窩仔豬中隨機選擇5頭臨床健康的仔豬采集血液樣本。根據(jù)仔豬血清中IgG的總光學(xué)密度（Optical Density，OD）的評估值，我們可以斷定豬場1和豬場2的仔豬血液樣本分別是在仔豬吮吸初乳之后和之前采集。

豬場1的試驗仔豬由場內(nèi)工人選擇，再負責(zé)將它們帶入不同的房間交給研究小組的成員采集血液樣本。血液樣本通過仔豬的臍帶或頸靜脈采集。為了避免仔豬之間發(fā)生交叉污染，同時避免在采集血液樣本和初乳樣本的過程中樣本受到環(huán)境的污染，每采集一頭仔豬的樣本后更換一副手套，軟管的打開、關(guān)閉和儲存由未捕捉過仔豬的工作人員執(zhí)行。豬場2的試驗仔豬的選擇和血液樣本采集由研究小組的成員進行。最終的樣本數(shù)見表1。所有的樣本都用血清學(xué)方法檢測是否含有PCV-2 IgG，并用實時定量PCR檢測是否存在PCV-2 DNA及確定其數(shù)量和亞型。

1.3 血清學(xué)檢測

所有血液樣本和初乳樣本都用之前介紹的基于ORF-2的ELISA檢測PCV-2抗體。一個樣本的樣本轉(zhuǎn)陽性（Sample-to-Positive，S/P）值不低于0.2即判定為陽性。豬場1的樣本還用SERELISA PCV-2 ab Mono Blocking ELISA試劑盒檢測。

所有的仔豬血液樣本還用豬體內(nèi)總IgG ELISA進行檢測。簡單來說，用溶于PBS的0.5 ?g/mL羊抗豬IgG （Fc）抗體包被微量滴定板，并在室溫下孵育過夜。在用含有0.05%吐溫20的PBS洗板3次后，用1%的牛血清蛋白在室溫下封閉2 h。該血清樣本用添加了牛血清蛋白的PBS按1∶100稀釋，滴在平板上后再在37 ℃下孵育45 h。洗板后，將按1∶40 000稀釋的過氧化物酶共軛山羊抗豬IgG加入孔中，37 ℃下孵育30 min。再次洗板后，將四甲聯(lián)苯胺氫過氧化顯色底物加入每個孔中，在室溫下放置15 min后，再在每個孔中加入50 μL的0.25 M硫酸終止反應(yīng)，隨后用分光光度計測定450 nm處的吸光度值。已哺乳的或哺乳前的仔豬血清作為分析對照。比較兩家豬場的仔豬血清的平均OD值。

1.4 PCV-2實時熒光定量PCR

在7500快速實時PCR系統(tǒng)中，用針對PCV-2 ORF1的引物和探針檢測PCV-2 DNA。在25 μL反應(yīng)體系中加入2.5 μL的DNA，反應(yīng)程序為：50 ℃ 20 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s（40個循環(huán)），60 ℃ 1 min（40個循環(huán)）。樣本的循環(huán)閾值（Cycle Threshold，CT）大于40判定為陰性。

1.5 PCV-2a/b多重PCR

利用可定向分析PCV-2 ORF2中模式序列的多重實時熒光定量PCR鑒別檢測PCV-2a和PCV-2b。25 μL反應(yīng)體系包括：12.5 μL的混合液（master mix），0.5 μL DNA，引物各0.4 μM，探針各0.2 μM。反應(yīng)程序為：50 ℃ 20 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s（40個循環(huán)），60 ℃ 1 min? （40個循環(huán)）。樣本的CT值大于40判定為陰性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用JMP V.9.0.0軟件和SAS V.9.2軟件分析，P值小于0.05即認為在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。ELISA的S/P比值用“豬場”、“胎次”和“豬場與母豬接種狀態(tài)的互作”建立的線性混合模型分析。接種狀態(tài)與按胎次和豬場分級的PCV-2流行率之間的聯(lián)系用CMH檢驗評估，各豬場的血清學(xué)結(jié)果用配對t檢驗分析。兩組間的發(fā)病率差異通過費歇爾確切檢驗（Fisher's exact test）計算。

2? 結(jié)果

2.1 窩生產(chǎn)性能

在豬場1所選的仔豬窩中，平均窩產(chǎn)活仔數(shù)（用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，下同）為“12.2頭±0.3頭”，窩平均死胎數(shù)為“1.2胎±0.2胎”，窩平均木乃伊胎數(shù)為“0.4胎±0.2胎”。豬場2的平均窩產(chǎn)活仔數(shù)為“11.8頭±0.4頭”，窩平均死胎數(shù)為“0.8胎±0.2胎”，窩平均木乃伊胎數(shù)為“0.2胎±0.1胎”。試驗組和對照組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異（表2）。

2.2 血清中的總lgG水平

豬場1的仔豬血清IgG的OD值與從哺乳后的仔豬上采集的樣本測得的結(jié)果相接近，而豬場2的仔豬血清IgG的OD值與從哺乳前的仔豬上采集的樣本測得的結(jié)果相接近。豬場1仔豬血清的IgG的OD值顯著高于豬場2仔豬的（P<0.000 1）。

2.3 抗PCV-2 lgG抗體的流行率與ELISA S/P平均值

所有免疫母豬和97%的未免疫母豬分泌的初乳都檢測到了PCV-2 IgG抗體，免疫母豬的平均S/P值顯著高于未免疫母豬的（P=0.003 9）。PCV抗體陽性的母豬在發(fā)病率上無統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。各豬場免疫母豬和未免疫母豬的檢測結(jié)果見表3。

對兩家豬場的免疫母豬和未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的血液樣本檢測后發(fā)現(xiàn)，PCV-2 IgG抗體陽性的樣本比例分別為44.5%和43.4%。豬場1的免疫母豬所產(chǎn)仔豬的血液IgG抗體水平顯著高于未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的。豬場1血清陽性的仔豬比例高達88.1%，豬場2的這一比例僅為1.1%。豬場1免疫母豬所產(chǎn)仔豬的PCV-2 IgG抗體水平顯著高于未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的。

2.4 PCV-2 DNA檢測率

表3列出了按接種方式和豬場匯總的母豬初乳中PCV-2 DNA的檢測結(jié)果：豬場1未免疫母豬初乳樣本的PCV-2 DNA檢測率為5.9%，未從豬場1免疫母豬的初乳樣本以及豬場2未免疫母豬的初乳中檢測到PCV-2 DNA。

綜合豬場1和豬場2的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14.9%的未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的血清樣本和8.4%的免疫母豬所產(chǎn)仔豬的血清樣本含有PCV-2 DNA，未免疫母豬所產(chǎn)仔豬血清樣本的PCV-2 DNA檢測率顯著高于免疫母豬所產(chǎn)仔豬的。在PCV-2陽性樣本中，28個樣本只檢測到了PCV-2a，28個樣本只檢測到了PCV-2b，5個樣本同時檢測到了PCV-2a和PCV-2b，另外19個樣本未能確定所檢測到的PCV-2的血清亞型。在豬場1，免疫母豬所產(chǎn)仔豬血清樣本的PCV-2 DNA檢測率顯著低于未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的? ? （P<0.001）（表3）。

表4列出了不同豬場母豬所產(chǎn)窩中PCV-2 DNA陽性仔豬的分布情況。在未免疫母豬所產(chǎn)窩中，至少有1～3頭仔豬呈PCV-2 DNA陽性的窩數(shù)顯著高于免疫母豬所產(chǎn)窩的（P=0.036）。在單家豬場中，如豬場1，如果仔豬由免疫母豬生產(chǎn)，無PCV-2 DNA陽性仔豬的窩比例極高（P<0.01）;相反，如果仔豬由免疫母豬生產(chǎn)，有2～3頭仔豬為PCV-2 DNA陽性的窩所占比例較低（P<0.05）。

3? 討論

本研究中，兩家豬場的新生仔豬血清樣本的PCV-2抗體陽性率為43.9%。在感染PCV-2后，大多數(shù)母豬會在妊娠第70天后出現(xiàn)高水平的PCV-2垂直傳播率。Lai等和Vandeputte等證明，新生仔豬從初乳獲得的抗體可在攝入初乳后2 h內(nèi)檢測到，并且抗體水平可在攝入初乳后9 h～24 h達到峰值。在豬場1，母豬接種PCV-2滅活疫苗會顯著影響所產(chǎn)仔豬的PCV-2 IgG的S/P值。

PCV-2 DNA陽性仔豬的分布率為11.7%。豬場1的仔豬血清樣本在哺乳后采集，檢測發(fā)現(xiàn)免疫母豬所產(chǎn)仔豬的病毒血癥發(fā)病率顯著低于未免疫母豬所產(chǎn)仔豬的，窩中仔豬的PCV-2 DNA陽性發(fā)生率也呈現(xiàn)出類似的情況。有趣的是本研究檢測到的PCV-2a陽性血清樣本數(shù)和PCV-2b陽性血清樣本數(shù)相接近，這與Shen等對499個來自哺乳前仔豬的血清樣本檢測后發(fā)現(xiàn)較多樣本呈PCV-2b陽性的結(jié)果相悖，可能是由于本研究對一部分母豬接種PCV-2滅活疫苗會干擾PCV-2亞型特異性病毒復(fù)制。業(yè)已證明母豬在妊娠早期和中期感染PCV-2后會導(dǎo)致個別母豬發(fā)生繁殖障礙。但是，PCV-2在繁殖母豬群中的流行對仔豬和生長豬的影響可能大于對母豬的影響。Opriessnig等指出，當(dāng)PCV-2的亞臨床感染仔豬與敏感仔豬和生長豬混群時，PCVAD高發(fā)病率通常出現(xiàn)在仔豬的母源抗體開始衰退后。

盡管豬場給生長豬接種PCV-2疫苗目前已經(jīng)很普遍，并且?guī)鞵CVAD的發(fā)病率下降，但是眾多跡象表明接種PCV-2疫苗并不能完全有效地預(yù)防豬感染PCV-2。Ci-Ozuna等在多篇研究論文中報道了發(fā)生在美國堪薩斯和內(nèi)布拉斯加州的與PCV-2相關(guān)的嚴重急性肺炎和肺水腫病例。2009年末，出現(xiàn)在加拿大的PCV-2重組病毒還引起了人們對PCV-2疫苗安全性的擔(dān)憂。業(yè)已證明給母豬接種PCV-2疫苗無法徹底預(yù)防PCV-2通過精液或?qū)嶒炐怨ザ疽鸬哪肛i子宮內(nèi)感染，本研究的結(jié)果證實了先前的發(fā)現(xiàn)，即母豬接種PCV-2滅活疫苗后很可能會通過防止子宮內(nèi)感染從而減少患病毒血癥的仔豬的數(shù)量，或通過初乳降低出生不久感染PCV-2的仔豬的數(shù)量。

在實驗條件下，給母豬接種商用PCV-2滅活疫苗可以提高其所分泌的初乳中抗PCV-2的IgG水平。同時，母豬接種PCV-2滅活疫苗可以顯著減少出現(xiàn)病毒血癥的仔豬數(shù)，并可降低有PCV-2病毒血癥仔豬的窩發(fā)生率。

原題名：Vaccination of sows reduces the prevalence of PCV-2 viraemia in their piglets under field conditions（英文）

原作者：K. C. ONeill、M. Hemann、L. G. Giménez-Lirola、 P. G. Halbur和T. Opriessnig