段文娟，李月，耿巖玲，王曉

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省分析測(cè)試中心 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

標(biāo)準(zhǔn)樣品是由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)批準(zhǔn)的實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)，是標(biāo)準(zhǔn)的另一種存在形式，是標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)發(fā)展到一定階段的產(chǎn)物，其與文字標(biāo)準(zhǔn)合在一起構(gòu)成完整的標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)[1]。GB/T 15000.3—2008和ISO指南35—2006規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)樣品為一種或多種規(guī)定特性足夠均勻和穩(wěn)定的材料，已被確定其符合測(cè)量過(guò)程的預(yù)備用途，用途可包括測(cè)量系統(tǒng)校準(zhǔn)、測(cè)量程序評(píng)估、給其他材料賦值和質(zhì)量控制[2]。隨著標(biāo)準(zhǔn)樣品在確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠，與國(guó)際等效，在方法驗(yàn)證、實(shí)驗(yàn)室評(píng)估和儀器校準(zhǔn)等方面的廣泛應(yīng)用，其地位和作用日益顯著。

圖1 麥芽糖醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of maltitol

麥芽糖醇的化學(xué)名稱為4-O-α-D-吡喃葡萄糖基山梨醇，分子式為C12H24O11(圖1)，是麥芽糖加氫還原后精制而成的一種雙糖醇[3]，甜度為蔗糖的0.8～0.9倍，甜味溫和，是一種新型的功能性甜味劑。麥芽糖醇在動(dòng)物體內(nèi)很難被消化代謝，熱值僅為蔗糖的十分之一，耐酸性和耐熱性優(yōu)于蔗糖、木糖醇和山梨糖醇[4]。研究表明麥芽糖醇可顯著提高鈣的吸收和保留率[5]、預(yù)防齲齒[6]、不刺激胰島素分泌、維持血糖穩(wěn)定[7]，是一種理想的甜味劑。麥芽糖醇是一種安全、無(wú)毒害的食品添加劑，其安全性得到國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局、聯(lián)合國(guó)食品和農(nóng)業(yè)組織、世界衛(wèi)生組織認(rèn)可，可添加于各類動(dòng)物性食品中，且對(duì)添加限量不做規(guī)定[8]。近年來(lái)，麥芽糖醇已廣泛用于食品、化工、保健品及化妝品行業(yè)。我國(guó)也出臺(tái)了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，建立了相關(guān)產(chǎn)品中麥芽糖醇含量測(cè)定方法，以確保產(chǎn)品質(zhì)量。但我國(guó)目前沒(méi)有麥芽糖醇國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品，為了滿足產(chǎn)品分析檢測(cè)和質(zhì)量控制的需求，本研究以市售麥芽糖醇為原料，按照GB/T 15000標(biāo)準(zhǔn)樣品研制的系列工作導(dǎo)則的要求，經(jīng)過(guò)分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、純度分析、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性檢驗(yàn)和定值，研制出純度大于99%、不確定度小于1%的麥芽糖醇國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品，為麥芽糖醇的深入研究以及相關(guān)產(chǎn)品的分析檢測(cè)和質(zhì)量控制提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)385-ELSD蒸發(fā)光散射檢測(cè)器及色譜工作站；島津LC-6AD制備液相色譜儀(日本SHIMADZU公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R-3(瑞士BUCHI公司)；Agilent 6520 Q-TOF液相質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；TG-40 DTA-40M型熱重分析儀(日本SHIMADZU公司)；UV-2550型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本SHIMADZU公司)；WRS-1B型數(shù)字熔點(diǎn)儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Vertex 70紅外光譜儀(德國(guó)BRUKER公司)；BRUKER 400 MHz核磁共振波譜儀(德國(guó)BRUKER公司)；冷凍干燥儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Direct-Q8超純水機(jī)(法國(guó)Merck Millipore公司)。

1.2 材料與試劑

麥芽糖醇對(duì)照品(市購(gòu))，乙醇、甲醇為分析純(天津廣成化學(xué)試劑有限公司)，高效液相色譜用甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)默克公司)，水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

在獨(dú)立和潔凈的操作間，采用2 mL棕色樣品瓶將麥芽糖醇粉末分裝，每瓶10 mg，共分裝120瓶，以1～120號(hào)計(jì)，分裝好的樣品在4 ℃冰箱保存。

2.2 純度分析

2.2.1 分析條件

2.2.2 樣品溶液制備

精密稱取木糖醇樣品2.0 mg，加1.0 mL超純水超聲溶解，過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，得到2 mg/mL的樣品溶液。麥芽糖醇的高效液相色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 麥芽糖醇的HPLC圖譜 Fig.2 HPLC chromatogram of maltitol

2.2.3 薄層鑒別

(a) V(正丁醇) V(乙醇) V(水)=1 (b) V(異丙醇) V(水) V(氨水)=1 圖3 麥芽糖醇的薄層彩色圖譜Fig. 3 TLC chromatogram of maltitol

2.2.4 熱重分析

精密稱取樣品5 mg，放置于熱重用的坩堝中，分析條件：初始溫度為35 ℃，最終溫度為800 ℃，以10 ℃/min的速率升溫，氣體N2，流速100 mL/min。分析結(jié)果顯示，溫度在35.0～262.0 ℃內(nèi)，熱重(TG)曲線無(wú)明顯變化，說(shuō)明被測(cè)試的樣品中基本不含吸附水或者揮發(fā)性物質(zhì)，且樣品的熱穩(wěn)定性好。當(dāng)溫度增加超過(guò)262.0 ℃時(shí)，樣品開(kāi)始分解。麥芽糖醇的熱重分析圖譜見(jiàn)圖4。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

采用紫外光譜(UV)、紅外光譜(IR)、高分辨質(zhì)譜(HR-ESI-MS)、核磁共振(NMR)對(duì)樣品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明與文獻(xiàn)[11]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致。

2.3.1 紫外光譜檢測(cè)

麥芽糖醇(超純水)在190～600 nm的波長(zhǎng)內(nèi)，除末端吸收外，在其他波長(zhǎng)范圍內(nèi)無(wú)紫外吸收，結(jié)果如圖5所示。

圖5 麥芽糖醇的紫外光譜圖 Fig.5 UV spectrum of maltitol

2.3.2 紅外光譜分析

稱量樣品10 mg與KBr混合均勻并壓片，掃描波數(shù)在400～4000 cm-1范圍測(cè)定紅外光譜，解析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 麥芽糖醇的紅外光譜數(shù)據(jù)Table1 IR data of maltitol

2.3.3 高分辨質(zhì)譜分析

高分辨質(zhì)譜分析條件：電噴霧離子源，載氣為氮?dú)?，載氣流速為10 L/min，載氣溫度為300 ℃，毛細(xì)管電壓為4.0 kV，掃描范圍m/z為100～1000。

實(shí)測(cè)值是m/z=367.124 0 [M-H]-，計(jì)算值是m/z=343.123 9 [M-H]-；實(shí)測(cè)值是m/z=367.121 6 [M+Na]+，計(jì)算值是m/z=367.122 6 [M+Na]+；推測(cè)分子式為C12H24O11。

2.3.4 核磁共振波譜分析

麥芽糖醇樣品溶于D2O中，分別測(cè)定1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)，與文獻(xiàn)[11-12]報(bào)道對(duì)比，基本一致，核磁數(shù)據(jù)歸屬見(jiàn)表2。

表2 麥芽糖醇的核磁共振氫譜和碳譜數(shù)據(jù)(氘代溶劑D2O)Table 2 NMR and carbon spectral data of maltitol (deuterated solvent D2O)

2.4 均勻性

表3 麥芽糖醇均勻性測(cè)量數(shù)據(jù)Table 3 Homogeneity test data of maltitol

表4 麥芽糖醇均勻性檢驗(yàn)的方差分析Table 4 Variance analysis for the homogeneity test of maltitol

2.5 穩(wěn)定性

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則GB/T 15000.3—2008標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法中第8章穩(wěn)定性研究的要求，將麥芽糖醇樣品儲(chǔ)存在棕色干燥器中常溫避光保存，以兩年為期，開(kāi)展實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，對(duì)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。每6個(gè)月對(duì)放置在棕色干燥器中的樣品取樣檢驗(yàn)，采用2.3.1項(xiàng)下建立的HPLC純度分析方法進(jìn)行測(cè)定，每份試樣平行測(cè)試5次，峰面積歸一化法進(jìn)行純度計(jì)算，采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并計(jì)算樣品穩(wěn)定性引入的不確定度[2]。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 麥芽糖醇樣品穩(wěn)定性檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Stability test data of maltitol

采用單變量線性模型-線性最小二乘法計(jì)算得到截距b0和斜率b1以及相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差s(b1)。斜率b1的計(jì)算公式如下所示：

(1)

截距b0的計(jì)算公式如下所示：

(2)

直線上每點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算公式如下所示：

(3)

其平方根s=0.018，與斜率相關(guān)的不確定度的計(jì)算公式如下所示：

(4)

自由度為n-2=3和置信水平p=0.95(95%的顯著水平)條件下，t檢驗(yàn)的臨界值等于3.182，即t0.95,n-2=3.182。由于式(5)

|b1|

(5)

故斜率并不顯著，因此，此樣品在24個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。

有效期為24個(gè)月的長(zhǎng)期穩(wěn)定性引入的不確定度貢獻(xiàn)為：

ults=s(b1)×t=0.01%×24=0.24%。

(6)

2.6 定值

本樣品按照標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則GB/T 15000.3—2008[2]的要求，由多家實(shí)驗(yàn)室采用同一種方法協(xié)作定值，參與實(shí)驗(yàn)室的數(shù)目為8個(gè)。隨機(jī)抽取24瓶樣品，每個(gè)定值實(shí)驗(yàn)室送3瓶，定值實(shí)驗(yàn)室將樣品配成一定濃度的溶液，每瓶樣品用高效液相色譜儀平行測(cè)定2次，采用峰面積歸一化法進(jìn)行定值[2, 13]。對(duì)測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，分析結(jié)果見(jiàn)表6～8。

表6 8家實(shí)驗(yàn)室定值數(shù)據(jù)Table 6 Certification data of 8 laboratories

表7 HPLC純度定值結(jié)果的方差分析表Table 7 Variance analysis results ofcertification data by HPLC

表8 HPLC純度定值結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析表Table 8 Statistic analysis of certification data by HPLC

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的計(jì)算公式為：

3 討論

本研究根據(jù)GB/T 15000.3—2008標(biāo)準(zhǔn)樣品系列導(dǎo)則[2]的要求，對(duì)純化的麥芽糖醇樣品進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性和定值研究。麥芽糖醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的總不確定度由標(biāo)準(zhǔn)樣品定值分析引入的不確定度、均勻性實(shí)驗(yàn)引入的不確定度和長(zhǎng)期穩(wěn)定性引入的不確定度3部分組成。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，麥芽糖醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果為：標(biāo)準(zhǔn)值為99.64%，置信水平為95%的擴(kuò)展不確定度為0.50% (p=0.95,k=2)，該標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制程序符合國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品研制的相關(guān)要求。該標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制為麥芽糖醇相關(guān)產(chǎn)品的測(cè)量校準(zhǔn)、質(zhì)量控制、方法確認(rèn)等工作提供了物質(zhì)基礎(chǔ)，確保了測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性、溯源性以及國(guó)際等效。同時(shí)，本研究為低聚糖類國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制提供了研究范例。