傅 奇，肖玉娟，毛玉婷，林慧霞，周小偉

（1.廈門華廈學(xué)院環(huán)境與公共健康學(xué)院，福建廈門 361024；2.江西省山江湖開發(fā)治理委員會辦公室，江西南昌 330046；3.韶關(guān)學(xué)院英東食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005）

0 引言

猴頭菇又名猴頭菌、刺猬菌[1]，蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等含量豐富，且含有人體必需的8 種氨基酸，干猴頭菇所含有的蛋白質(zhì)含量為香菇的2 倍[2]。作為猴頭菇的主要活性成分，猴頭菇多糖具有極高的營養(yǎng)價值，具有保肝護肝、增強機體免疫力、抗腫瘤、降血糖和降血脂等[3-4]生理功能。猴頭菇多糖主要是由葡萄糖、甘露糖和半乳糖等重要成分構(gòu)成的葡聚糖，是β-1,3 鍵連接的主鏈和β-1,6 鍵連接的支鏈構(gòu)成的基本結(jié)構(gòu)[5]。

迄今為止，水提法、超聲波技術(shù)和酶法技術(shù)[6-10]已廣泛應(yīng)用于植物多糖的提取中。同時，多種提取方法的協(xié)同作用對于提高多糖的提取率也大有裨益。如超聲微波協(xié)同提取富硒蛹蟲草硒多糖[11]，超聲-酶法[12-14]提取百合多糖、玉米多糖、杏鮑菇多糖等。近年來，研究人員主要通過熱水浸提法、酶法、微波提取法、超聲波提取法、微波協(xié)同復(fù)合酶法等提取猴頭菇多糖[15]。但傳統(tǒng)熱水浸提法耗時長且提取率較低，而超聲波由于其強烈的空化和攪拌作用等可以有效加速植物中的多糖溶于溶劑中[16]，從而縮短提取時間，同時該提取方法溫度低，能夠防止多糖的結(jié)構(gòu)被長時間的高溫作用毀壞，得以大大提高多糖的提取率。同時，酶制劑由于安全、高效，被廣泛應(yīng)用于食用菌的功能活性物質(zhì)提取。

試驗對比超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取猴頭菇多糖得率和超聲波法提取猴頭菇多糖得率情況，并通過正交試驗優(yōu)化出超聲波協(xié)同復(fù)合酶法提取猴頭菇多糖的最優(yōu)工藝條件，以期提高多糖的提取率，增大猴頭菇的利用率，提高猴頭菇產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

干猴頭菇，五馬寨菌業(yè)有限公司提供；纖維素酶（15 000 U/g）、果膠酶（15 000 U/g），均為食品級；檸檬酸、檸檬酸鈉、葡萄糖、苯酚、濃硫酸等，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6 新世紀(jì)型可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；CS-2000 型高速多功能粉碎機，永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；HH-S16s型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動化儀器廠產(chǎn)品；SK8210LHC 型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；ZD-2 型自動電位滴定儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；DHG-9076 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，江蘇金壇市大地自動化儀器廠產(chǎn)品；SHD-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，保定高新區(qū)陽光科教儀器廠產(chǎn)品；BS210S 型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司產(chǎn)品；YP1201N 型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 工藝流程

干猴頭菇→粉碎→過30 目篩→稱重→溶解→復(fù)合酶酶解→超聲波處理→滅酶→抽濾→除蛋白→醇沉→冷凍干燥→猴頭菇粗多糖→測定。

2.2 多糖含量的測定——苯酚硫酸法[17]

稱取適量粗多糖溶于水，配成供試液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算多糖含量，并計算猴頭菇多糖提取率。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

0.50 g 葡萄糖在80 ℃下干燥至恒質(zhì)量，稱取0.01 g 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶解，在100 mL 容量瓶中定容，振蕩搖勻，配成質(zhì)量濃度0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取5 g 苯酚，添加適量蒸餾水并攪拌，待其完全溶解后，定容至100 mL。

分別移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，依次添加1 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的苯酚溶液，振蕩，再緩慢加入5 mL 的濃硫酸，邊添加邊振蕩。蒸餾水作為空白對照。20 min 后，于波長490 nm 處測定樣液。

2.2.2 多糖含量計算[18]

多糖含量根據(jù)式（1）計算

式中：C——樣品溶液葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——供試液體積，mL；

m——供測粗多糖質(zhì)量，mg。

2.2.3 多糖提取率計算[18]

多糖提取率按式（2）計算

式中：m——醇沉后得到的粗多糖總質(zhì)量，g；

m1——稱取的猴頭菇樣品干質(zhì)量，g。

2.3 猴頭菇粗多糖的提取方法

2.3.1 超聲波提取法

稱量5 g 猴頭菇粉，根據(jù)料液比添加適量的蒸餾水，攪拌溶解，并選用超聲功率、超聲時間、料液比作為試驗因素，各取5 個水平進(jìn)行單因素試驗，超聲功率200，250，300，350，400 W；超聲時間5，10，15，20，25 min；料液比 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30。以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)總結(jié)各因素的最佳條件，并通過三因素三水平正交試驗進(jìn)一步研究因素間的相互影響，根據(jù)正交試驗得到超聲波提取猴頭菇多糖的最優(yōu)組合。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

2.3.2 超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取法

（1）單因素試驗。稱量5 g 猴頭菇粉，根據(jù)料液比添加適量的蒸餾水，攪拌溶解，在復(fù)合酶比例為1∶1，酶解時間30 min，pH 值4，酶解溫度50 ℃的條件下完成復(fù)合酶酶解，選取超聲時間、超聲功率、料液比、復(fù)合酶添加量作為因素，各選取5 個水平進(jìn)行單因素試驗，確定各因素最優(yōu)水平。

①超聲時間對多糖提取率的影響。在超聲功率250 W，料液比1∶25，復(fù)合酶添加量2%的基礎(chǔ)上，采用10，15，20，25，30 min 的超聲時間進(jìn)行試驗，研究猴頭菇多糖的提取率因不同的超聲時間產(chǎn)生的變化。②超聲功率對多糖提取率的影響。在超聲時間25 min，料液比1∶25，復(fù)合酶添加量2%的基礎(chǔ)上，采用200，250，300，350，400 W 的超聲功率進(jìn)行試驗，研究猴頭菇多糖的提取率因不同的超聲功率產(chǎn)生的變化。③料液比對多糖提取率的影響。在超聲時間25 min，超聲功率250 W，復(fù)合酶添加量2%的基礎(chǔ)上，采用1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35 的料液比進(jìn)行試驗，研究猴頭菇多糖的提取率因不同的料液比產(chǎn)生的變化。④復(fù)合酶添加量對多糖提取率的影響。在超聲時間25 min，超聲功率250 W，料液比1∶25 的基礎(chǔ)上，采用1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的復(fù)合酶添加量進(jìn)行試驗，研究猴頭菇多糖的提取率因不同的復(fù)合酶添加量產(chǎn)生的變化。

（2）正交試驗。依據(jù)單因素試驗的分析結(jié)果，分別選取超聲時間、超聲功率、料液比、復(fù)合酶添加量4 個因素，按照四因素三水平表完成正交試驗，因素之間的交互作用將不被予以考慮。并通過正交試驗總結(jié)出最高的多糖提取率組合。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設(shè)計

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，回歸方程 Y=8.802 9X+0.009 5，R2=0.998 8，線性關(guān)系良好。

3.2 超聲波提取法

3.2.1 單因素試驗結(jié)果

（1）超聲時間的影響。

不同超聲時間對猴頭菇多糖提取率的影響見圖2。

由圖2 可知，多糖提取率在時間逐漸增加的情況下先升高后降低，當(dāng)超聲時間為5～15 min 時，多糖提取率顯著升高；在超聲處理15 min 后，多糖提取率緩慢降低，這是由于超聲波具有高的加速度，使有效成分快速被提取出來，多糖的提取率升高，當(dāng)達(dá)到一定時間后，猴頭菇提取液體系滲透壓達(dá)到平衡，多糖得率也就趨于平穩(wěn)。超聲時間太長會破壞局部多糖的結(jié)構(gòu)，使多糖含量減少，提取率降低，同時也造成能源浪費。通過分析可知，最佳超聲時間為15 min，并選擇超聲時間10，15，20 min 進(jìn)行正交試驗。

圖2 不同超聲時間對猴頭菇多糖提取率的影響

（2）超聲功率的影響。

不同超聲功率對猴頭菇多糖提取率的影響見圖3。

圖3 不同超聲功率對猴頭菇多糖提取率的影響

由圖3 可知，多糖提取率隨著超聲功率的增大先迅速提高后平緩降低，多糖提取率在超聲功率為200～300 W 逐漸提高；當(dāng)功率超過300 W 時，多糖提取率緩慢降低，這可能是因為超聲功率逐漸提高，對細(xì)胞壁的破損程度逐漸增大，使多糖快速溶出，提取率升高，但超聲功率太大可能造成反應(yīng)容器內(nèi)部部分溫度急速升高，破壞猴頭菇多糖的結(jié)構(gòu)，使多糖提取率下降。通過以上分析可知，超聲功率選擇300 W 為宜，并選取超聲功率250，300，350 W進(jìn)行正交試驗。

（3）料液比的影響。

不同料液比對猴頭菇多糖提取率的影響見圖4。

由圖4 可知，多糖提取率因溶劑量逐漸增加先升高后降低，多糖提取率在料液比1∶10～1∶15 迅速提高；但在料液比1∶15 之后逐漸降低。這是由于多糖溶解已達(dá)到基本飽和，但繼續(xù)添加溶劑會使多糖濃度降低，同時也造成能源浪費。通過以上分析可知，料液比選1∶15 為宜，并選擇料液比1∶10，1∶15，1∶20 進(jìn)行正交試驗。

3.2.2 正交試驗結(jié)果

圖4 不同料液比對猴頭菇多糖提取率的影響

采用L9（34）的正交水平表完成正交試驗。

L9（34）正交試驗結(jié)果與分析見表3。

表3 L9（34）正交試驗結(jié)果與分析

由表4 可知，各個因素水平都影響猴頭菇多糖的提取率，通過比較極差R 值可知，影響多糖提取率的主要次序為料液比>超聲功率>超聲時間，同時表明猴頭菇多糖提取率受料液比的影響最大，并得出超聲波提取猴頭菇多糖的最優(yōu)方案組合為A2B2C3，即超聲時間15 min，料液比1∶20，超聲功率300 W，多糖提取率達(dá)到了最高為16.96%。

3.3 超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取多糖

3.3.1 單因素試驗結(jié)果

（1）超聲時間的影響。

不同超聲時間對猴頭菇多糖提取率的影響見圖5。

圖5 不同超聲時間對猴頭菇多糖提取率的影響

由圖5 可知，多糖提取率在時間逐漸延長的情況下，先升高后降低。當(dāng)超聲處理為10～20 min 時，多糖提取率顯著升高；在超聲處理20 min 后，多糖提取率緩慢上升；當(dāng)超聲時間大于25 min 時，多糖提取率逐漸降低，推測可能因為超聲波不僅具有高的加速度，還存在劇烈的空化效應(yīng)、攪拌影響等，使有效成分快速流入溶液，多糖的提取率升高，但超聲時間太長會破壞局部多糖的結(jié)構(gòu)，使多糖含量減少，提取率降低。通過分析可知，最佳超聲時間為25 min，并選擇超聲波提取時間20，25，30 min進(jìn)行正交試驗。

（2）超聲功率的影響。

不同超聲功率對猴頭菇多糖提取率的影響見圖6。

圖6 不同超聲功率對猴頭菇多糖提取率的影響

由圖6 可知，多糖提取率因為超聲功率逐漸增大先緩慢升高后降低，多糖提取率在超聲功率為200～350 W 逐漸提高，當(dāng)超聲功率大于350 W 時多糖提取率顯著降低，這可能是因為超聲功率逐漸增大，對細(xì)胞壁的破損程度逐漸提高，使多糖快速溶出，有利于多糖提取率的提高，也可能是超聲功率產(chǎn)生的空化效應(yīng)在一定程度上增強了復(fù)合酶的活力，促進(jìn)酶法提取過程的進(jìn)行，提高了多糖提取率，但超聲功率太大可能造成反應(yīng)容器內(nèi)部部分溫度急速升高，在短時間內(nèi)破壞猴頭菇多糖的結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞膜和細(xì)胞壁通透性，使多糖提取率下降[19]。通過以上分析可知，超聲功率選350 W 為宜，并選擇超聲功率300，350，400 W 進(jìn)行正交試驗。

（3）料液比的影響。

不同料液比對猴頭菇多糖提取率的影響見圖7。

由圖7 可知，在溶劑量逐漸增大的條件下，多糖提取率先升高后降低，多糖提取率在料液比1∶15～1∶30 逐漸增大，但在料液比1∶30 之后多糖提取率降低。由此說明，料液比為1∶30 時可以充分提取多糖，此時多糖得率較高，但過高的料液比會對提取液的濃縮產(chǎn)生影響，從而使多糖得率降低，同時也造成能源浪費。通過以上分析可知，料液比選1∶30 為宜，并且選擇料液比 1∶25，1∶30，1∶35 進(jìn)行正交試驗。

圖7 不同料液比對猴頭菇多糖提取率的影響

（4）復(fù)合酶添加量的影響。

不同復(fù)合酶添加量對猴頭菇多糖提取率的影響見圖8。

圖8 不同復(fù)合酶添加量對猴頭菇多糖提取率的影響

由圖8 可知，多糖提取率在復(fù)合酶添加量逐漸增加的情況下先提高后降低，多糖提取率在復(fù)合酶添加量1%～2%時逐漸增大，但在酶添加量2%之后多糖提取率逐步降低，在一定條件下，酶添加量越高，酶解效果越強，但復(fù)合酶的添加量不能過高，高酶量作用太過強烈會破壞多糖結(jié)構(gòu)，使多糖提取率降低，通過以上分析可知，復(fù)合酶添加量應(yīng)選以猴頭菇粉的2%為宜，并且選擇復(fù)合酶添加量1.5%，2.0%，2.5%進(jìn)行正交試驗。

3.3.2 正交試驗結(jié)果分析

采用L9（34）的正交水平表完成正交試驗。

L9（34）正交試驗結(jié)果與分析見表4。

由表4 可知，各因素水平對猴頭菇多糖的提取率存在相應(yīng)的影響，通過比較極差R' 值可知，影響猴頭菇多糖提取率的主要次序為超聲功率>料液比>超聲時間>復(fù)合酶添加量，說明影響多糖提取率最大的因素是超聲功率，從而得出超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取猴頭菇多糖的最優(yōu)方案組合為A'2B'2C'1D'3，即超聲時間25 min，料液比1∶30，超聲功率300 W，復(fù)合酶添加量2.5%，在此條件下多糖提取率達(dá)到了最高為19.44%。

4 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗，得出在猴頭菇粗多糖的提取中，超聲波協(xié)同復(fù)合酶提取方法的最優(yōu)工藝條件為超聲時間25 min，料液比1∶30，超聲功率300 W，復(fù)合酶添加量2.5%，此條件下猴頭菇多糖提取率達(dá)到最高值19.44%。

表4 L9（34）正交試驗結(jié)果與分析