劉宇涵，于佳楠，馬金鳳，何 玲，陶 碩，范文博，丁玉萍，2

（1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154002；2.中-烏農(nóng)林技術(shù)開(kāi)發(fā)與應(yīng)用國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯 154007）

發(fā)酵香腸最早出現(xiàn)在地中海地區(qū)，隨著經(jīng)濟(jì)、技術(shù)和工業(yè)的進(jìn)步，人們生活水平的提高和健康意識(shí)的提高，發(fā)酵香腸產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和發(fā)展備受關(guān)注[1]。最初的自然發(fā)酵，是富集在環(huán)境中的天然微生物，產(chǎn)品品質(zhì)很難保證[2-3]。如今，多采用現(xiàn)代生物技術(shù)和控制發(fā)酵條件，人工添加發(fā)酵劑與自然發(fā)酵相比，現(xiàn)代發(fā)酵香腸在營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味、穩(wěn)定性等方面都得到了提高。傳統(tǒng)香腸通常添加亞硝酸鹽，亞硝酸鹽除了可作為肉的保護(hù)劑、改善肉的顏色以外，還能改善肉類風(fēng)味，對(duì)肉毒桿菌也有特殊的抑制作用，起到防腐劑的效果，是國(guó)家列入允許使用的食品添加劑之一[4-8]。但已有研究表明，亞硝酸鹽與肉制品中的胺在一定條件下會(huì)生成亞硝胺，有潛在的致癌作用，影響人體健康，所以國(guó)家對(duì)亞硝酸鹽的使用量有嚴(yán)格規(guī)定，亞硝酸鹽殘留問(wèn)題一直被世界衛(wèi)生組織所關(guān)注[9-12]。

近年來(lái)，市場(chǎng)上食用菌生產(chǎn)量高、品種多樣、價(jià)格便宜、口感獨(dú)特，如杏鮑菇具有愉悅的杏仁香味和鮑魚(yú)口感，質(zhì)地脆嫩、肉質(zhì)肥厚、口感鮮嫩、味道清香[13-14]。香腸中加入食用菌，不僅口感可以得到改善，而且對(duì)人體健康有益。現(xiàn)代研究表明，食用菌中所含的多糖、維P、氨基酸和麥角固醇等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能增強(qiáng)機(jī)體的抗病能力，提高機(jī)體抑制腫瘤的能力，具有鎮(zhèn)靜血壓、降低膽固醇、預(yù)防動(dòng)脈硬化等功能[15-22]。目前，可查到的相關(guān)文獻(xiàn)，多數(shù)為益生菌降低亞硝酸鹽的研究。例如，Li Pei Jun等人[23]向生肉糜中加入木糖葡萄球菌和戊糖片球菌，發(fā)現(xiàn)它們有將高鐵肌紅蛋白轉(zhuǎn)換為亞硝基肌紅蛋白的能力，從而可以減少亞硝酸鹽的含量。崔玨等人[24]從酸菜中篩選降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)且適用于肉制品發(fā)酵的乳酸菌-鼠李糖乳桿菌，以篩選的菌株為發(fā)酵劑制作單菌株發(fā)酵香腸，通過(guò)檢測(cè)證明，鼠李糖乳桿菌能有效降低發(fā)酵香腸中的NaNO2含量。在香腸中添加食用菌的研究也有報(bào)導(dǎo)，段善海等人[25]研究在香腸中添加一定量的雞腿菇，可使香腸具有獨(dú)特的風(fēng)味和良好的營(yíng)養(yǎng)保健作用。探究食用菌對(duì)益生菌降解亞硝酸鹽的影響尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。研究是在混合益生菌發(fā)酵香腸中添加食用菌，以益生菌對(duì)亞硝酸鹽的降解率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法，探究平菇、杏鮑菇、金針菇、香菇4種食用菌單一添加或混合添加對(duì)香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽的影響，旨在為添加食用菌的益生菌發(fā)酵香腸的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

金針菇、平菇、杏鮑菇、香菇、食鹽、黃豆、奶粉，購(gòu)自佳木斯超市；食品級(jí)亞硝酸鹽，購(gòu)自食品添加劑商店。

1.1.2 菌種

益生菌菌種（嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌），佳木斯大學(xué)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

模擬培養(yǎng)基（1 kg）：奶粉20 g，蔗糖30 g，亞硝酸鹽150 mg，食鹽15 g，折光度5%豆?jié){定量至1 kg，于115℃下滅菌15 min。

活化培養(yǎng)基（1 L）：奶粉20 g，蔗糖30 g，用折光度5%豆?jié){定容至1 L，于121℃下滅菌15 min。

1.1.4 化學(xué)試劑

鹽酸納乙二胺（分析純），天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠提供；亞鐵氰化鉀（分析純），哈爾濱市新達(dá)化工廠提供；硼砂（分析純），天津市瑞金特化學(xué)品有限公司提供；亞硝酸鹽（分析純），北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；對(duì)氨基苯磺酸（分析純），哈爾濱化工化學(xué)試劑廠提供；乙酸鋅（分析純），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司提供；冰乙酸（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；鹽酸（分析純），新海乳溶廠提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、YXQ-LS-75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；UV754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；JYD-D02V/D57型組織破碎機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品；SpectrumLab22PC型超聲波清洗器，上海棱光技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HH-Z2型恒溫水浴鍋，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；PHS-2C型數(shù)顯酸度計(jì)，杭州雷磁分析儀器廠；標(biāo)準(zhǔn)型凈化工作臺(tái)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；AB104-S型電子天平，METTLER TOLEDO Made in Switzerland產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 混合益生菌菌種的活化

將保存的益生菌菌種按1∶1∶1∶1比例接入活化培養(yǎng)基中，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，取出備用。

1.3.2 食用菌處理

食用菌清洗后，用組織破碎機(jī)破碎，按比例添加至模擬培養(yǎng)基中。

1.3.3 接種

按6%的接種量接入活化后的混合益生菌菌種。

1.3.4 發(fā)酵

將接種后的模擬培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后取出，測(cè)定亞硝酸鹽含量，計(jì)算降解率。

1.3.5 亞硝酸鹽殘留量測(cè)定

參照GB 5009.33—2016中分光光度法測(cè)定樣品中亞硝酸鹽含量。

亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.6 亞硝酸鹽含量的降解率

式中：P——亞硝酸鹽的降解率，%；

X1——試樣中亞硝酸鈉的含量，mg/kg；

100.93 ——加入150 mg/kg食品級(jí)亞硝酸鹽的模擬培養(yǎng)基未發(fā)酵前測(cè)得亞硝酸鹽的含量，mg/kg。

1.3.7 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)平菇、杏鮑菇、香菇、金針菇4種食用菌的添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)，4種食用菌添加量的梯度設(shè)置均為0，20，40，60，80 g/kg。按6%的接種量接入活化后混合益生菌菌種，于37℃下培養(yǎng)24 h，取出測(cè)亞硝酸鹽含量及pH值。各組做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.3.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了探究4種食用菌同時(shí)添加對(duì)降低亞硝酸鹽的影響，以平菇、杏鮑菇、香菇、金針菇為考查因素，利用四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)/g·kg-1

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 平菇對(duì)降低亞硝酸鹽的影響平菇單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 平菇單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，添加平菇的亞硝酸鹽降解率均比未添加平菇的高。用量從2 g/kg至80 g/kg亞硝酸鹽降解率呈正態(tài)分布。未添加平菇的亞硝酸鹽降解率為83.27%；用量為60 g/kg降解率最高為96.36%，比未添加平菇降解率高6.94%，同時(shí)平菇用量為60 g/kg時(shí)，pH值為3.26是5組中最低的，添加平菇組的pH值均比未添加平菇組的低。

2.1.2 杏鮑菇對(duì)降低亞硝酸鹽的影響

杏鮑菇單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，添加杏鮑菇的亞硝酸鹽降解率均比未添加杏鮑菇的高。用量從20 g/kg至80 g/kg壓硝酸鹽降解率呈正態(tài)分布，最高值比最低值高3.47%，差異不顯著；未添加杏鮑菇的亞硝酸鹽降解率為83.27%；用量為40 g/kg降解率最高為93.88%，比未添加杏鮑菇降解率高10.61%。亞硝酸鹽降解率最高組pH值最低，之后隨著杏鮑菇量的增加，pH值有所升高。

圖3 杏鮑菇單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 香菇對(duì)降低亞硝酸鹽的影響

香菇單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 香菇單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖4可知，香菇用量從20 g/kg至80 g/kg亞硝酸鹽降解率呈正態(tài)分布，均比未添加香菇的高；未添加香菇的亞硝酸鹽降解率為83.27%；香菇用量40 g/kg時(shí)降解率最高為93.72%，比未添加香菇降解率高10.45%。同時(shí)添加香菇的pH值均比未添加香菇的低，用量為40 g/kg組，pH值最低3.17。

2.1.4 金針菇對(duì)降低亞硝酸鹽的影響

金針菇單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 金針菇單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖5可知，添加金針菇組亞硝酸鹽降解率均高于未添加金針菇組。用量從20 g/kg至80 g/kg亞硝酸鹽降解率呈正態(tài)分布；未添加金針菇的亞硝酸鹽降解率為83.27%；用量為60 g/kg降解率最高為95.69%，比未添加金針菇降解率高12.42%。同時(shí)金針菇用量為60 g/kg時(shí)，pH值為3.15是5組中最低的，添加金針菇的pH值均比未添加金針菇的低。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

按6%的接種量接入活化后的混合益生菌菌種，于37℃條件下培養(yǎng)24 h，取出測(cè)亞硝酸鹽，計(jì)算降解率。

正交試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析

由表 2 可知，RC＞RB＞RA＞RD，4 種食用菌對(duì)香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽的影響均具有促進(jìn)作用，影響從大到小依次為金針菇＞杏鮑菇＞平菇＞香菇。A因素列：K2＞K1＞K3，B 因素列：K3＞K2＞K1，C 因素列：K2＞K3＞K1，D 因素列：K2＞K3＞K1。由此可以得出正交試驗(yàn)優(yōu)化的組合為A2B3C2D2，即平菇20 g/kg，杏鮑菇30 g/kg，金針菇用量20 g/kg，香菇用量20 g/kg。最好組為2號(hào)組合A1B2C2D2（Z1）和4號(hào)組合A2B1C2D3（Z2），降解率相同，均為98.12%。

2.2.2 對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)正交試驗(yàn)得出較好的3個(gè)組合，即Y（A2B3C2D2），Z1（A1B2C2D2），Z2（A2B1C2D3），做對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算降解率。

混合食用菌對(duì)香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽影響見(jiàn)圖5。

圖5 混合食用菌對(duì)香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽影響

由圖5可知，比較3組的降解率最高組Z1為98.36%；其次為Y組為98.04%，比Z1組低0.32%；最低的是Z2組為97.87%，比最高組低0.49%。因此，正交試驗(yàn)優(yōu)化的最佳組合為Z1組，即4種食用菌的用量分別為平菇10 g/kg，杏鮑菇20 g/kg，金針菇20 g/kg，香菇20 g/kg。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)得出，4種食用菌單獨(dú)添加時(shí)各用量為平菇60 g/kg，杏鮑菇40 g/kg，香菇40 g/kg，金針菇60 g/kg，此時(shí)食用菌對(duì)香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽影響最好，降解率高。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，添加食用菌組亞硝酸鹽降解率均比未添加食用菌組高；添加食用菌組的pH值均比未添加食用菌組低。降解率最高組，pH值最低，說(shuō)明添加食用菌能促進(jìn)香腸發(fā)酵益生菌的代謝，產(chǎn)酸量多，并促進(jìn)亞硝酸鹽的分解，提高降解率。

利用正交試驗(yàn)對(duì)4種食用菌進(jìn)行組合試驗(yàn)得出，4種食用菌組合用量分別為平菇10 g/kg，杏鮑菇20 g/kg，金針菇20 g/kg，香菇20 g/kg時(shí)，香腸發(fā)酵菌降解亞硝酸鹽的效果最好，降解率為98.36%。通過(guò)比較單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果，添加總量相近時(shí)，4種食用菌混合添加比單獨(dú)添加一種食用菌促進(jìn)益生菌降低亞硝酸鹽降解效果好。使用的混合益生菌是由嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌所組成，均屬于乳酸菌，而乳酸菌本身合成核酸和氨基酸的能力較弱，生長(zhǎng)和代謝需要特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。