閆姝君，劉陽依，和曉曉，鄭 名，曹瀟丹，徐建華，陳縉泉

華東師范大學(xué)精密光譜科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，上海 200062

引 言

金屬離子會對BR/BRE的熒光特性產(chǎn)生影響，不同于Zn2+的熒光增強作用，Cu2+對BRE有明顯的熒光猝滅。研究表明，高膽紅素血癥和膽結(jié)石等疾病與BR和Cu2+有關(guān)[3-5]，研究膽紅素及其類似物與Cu2+的相互作用對這些疾病的防治有重要意義。線性四吡咯分子為適應(yīng)與中心離子的配合，一般從原來的鏈式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成類似卟啉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，一個Cu2+與一個BR/BRE分子的四個中心吡咯氮配位，形成金屬中心的方形平面結(jié)構(gòu)(圖1)。BRE本身熒光量子產(chǎn)率較低，原因是吡咯環(huán)的振動使大部分激發(fā)態(tài)分子以無輻射方式弛豫回基態(tài)[6]。BRE與Cu2+配位后可能發(fā)生能級耦合產(chǎn)生新的非輻射退激發(fā)通路導(dǎo)致熒光減弱，但是有關(guān)Cu2+對BRE熒光的猝滅機制，還需進一步的研究。

圖1 BR，BRE及其與Cu2+配合物的分子結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic structures of BR，BRE and Cu2+ complex

激發(fā)態(tài)分子的退激發(fā)過程一般發(fā)生在超快時間尺度內(nèi)，傳統(tǒng)穩(wěn)態(tài)光譜技術(shù)無法觀測。本文采用可見和近紅外波段飛秒瞬態(tài)吸收光譜技術(shù)研究了BRE與Cu2+配合物的激發(fā)態(tài)光譜特性，不僅對其可見光波段的光譜進行了分析，還結(jié)合紅外區(qū)域的光譜發(fā)現(xiàn)了Cu2+對BRE的熒光猝滅機制，首次提出并證實了熒光猝滅的原因是配體到金屬的電荷轉(zhuǎn)移(ligand-to-metal charge transfer,LMCT)。與BRE本身相比，這個電荷轉(zhuǎn)移態(tài)為BRE-Cu2+配合物增加了一條非輻射退激發(fā)通路，使其熒光量子產(chǎn)率減小為BRE的～5%。通過擬合配合物激發(fā)態(tài)光譜的動力學(xué)曲線得到兩個壽命，分別為11 ps和186 ps。其中11 ps為LMCT態(tài)的建立過程，186 ps為分子由此中間態(tài)弛豫回基態(tài)的時間。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

BRE，百靈威科技有限公司；無水醋酸銅，99.99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMSO，光譜級，>99.9%，上海麥克林生化科技有限公司；熒光素，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

紫外-可見分光光度計(TU1901,Beijing Purkinje General Instrument Co.Ltd)用于測紫外可見吸收光譜，可探測波長范圍為190～900 nm，波長準確度為±0.3 nm。穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜數(shù)據(jù)的采集使用的是Horiba公司生產(chǎn)的FluoroMax-4型熒光光譜儀，由于不同的波長下光源的功率和探測器的探測效率都有所不同，所以我們選用S1c/R1c信號作為樣品的熒光發(fā)射光譜。飛秒瞬態(tài)吸收系統(tǒng)的激光器是Coherent公司生產(chǎn)的Astrella，輸出波長為800 nm，重復(fù)頻率1 kHz，單脈沖能量>7 mJ，脈沖寬度100 fs；OPA是Coherent公司生產(chǎn)的OperA Solo，可產(chǎn)生240～2 600 nm內(nèi)任意波長的光作為激發(fā)樣品的泵浦光；光譜儀是Ultrafast System公司生產(chǎn)的Helios-EOS fire，由激光器產(chǎn)生的800 nm光束經(jīng)過延遲線后打在氟化鈣/藍寶石晶體上，產(chǎn)生用于檢測的白光脈沖，延遲線可達到的最長時間窗口為8 ns。

1.2 方法

膽紅素是難溶于水的脂溶性物質(zhì)，常用溶劑有二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)；由于羧基的存在，BR也可溶解于堿性溶液中[7]。BRE比BR有更強的親脂性，考慮到金屬離子可能與堿性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，一般選用DMSO作為溶劑。配制BRE，BRE-Cu2+溶液(其中BRE和Cu2+的濃度比為1∶4，過量的Cu2+是為了使BRE與Cu2+充分結(jié)合)，溶劑為DMSO。用于測紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜的BRE溶液濃度為10 μmol·L-1，BRE-Cu2+溶液中BRE濃度固定為10 μmol·L-1，改變Cu2+的濃度配制不同配比的BRE-Cu2+溶液，Cu2+濃度分別為10，40，100，200和400 μmol·L-1；用于測瞬態(tài)吸收光譜的BRE溶液濃度為50 μmol·L-1，BRE-Cu2+溶液中BRE和Cu2+濃度分別為50 μmol·L-1和200 μmol·L-1，配好的樣品注意避光保存。

紫外-可見分光光度計測量光譜范圍設(shè)置為300～900 nm，避免短波長的光損壞樣品；穩(wěn)態(tài)熒光光譜的激發(fā)波長430 nm，狹縫寬度為3/3 mm；飛秒瞬態(tài)吸收光譜系統(tǒng)中選擇波長450 nm的脈沖作泵浦光，功率約為0.15 mW，探測光波長范圍有340～740和750～850 nm兩個波段，測量的時間窗口為500 ps(BRE)和3 ns(BRE-Cu2+)。

2 結(jié)果與討論

BRE和Cu2+混合后，生成了穩(wěn)定的配合物，如圖2為BRE和不同濃度配比的BRE-Cu2+在DMSO中的紫外可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。BRE與Cu2+濃度比為1∶1時光譜發(fā)生明顯改變，1∶4時已充分結(jié)合完全。BRE吸收峰和發(fā)射峰分別位于453和525 nm左右，可以看出，與Cu2+配位后，吸收峰藍移約23 nm，且在815 nm附近出現(xiàn)了一個新的吸收帶。從穩(wěn)態(tài)熒光光譜可以看出，BRE-Cu2+的熒光發(fā)生了明顯猝滅。我們以熒光素作為標準物，用相對法測定了BRE和BRE-Cu2+在DMSO中的熒光量子產(chǎn)率，發(fā)現(xiàn)BRE與Cu2+配合之后熒光量子產(chǎn)率降低為原來的5%。

為了探究Cu2+使BRE熒光猝滅的機理，我們用飛秒分辨的激光泵浦-探測技術(shù)對BRE-Cu2+進行分析。BRE和BRE-Cu2+配合物的瞬態(tài)吸收光譜如圖3所示。BRE在380～490 nm范圍內(nèi)顯現(xiàn)出明顯的基態(tài)漂白(ground state bleaching,GSB)[8]信號。對于峰值位于350 nm附近和490～740 nm的寬譜正信號，是分子被泵浦到激發(fā)態(tài)后的激發(fā)態(tài)吸收(excited state absorption,ESA)。對于350和510 nm附近的ESA信號來說，在光譜的初期(儀器響應(yīng)函數(shù)IRF≈120 fs)就達到信號的最大值，這說明二者均是BRE分子在接受光激發(fā)后所達到的初始激發(fā)態(tài)。而對于在550～650 nm左右、0～5 ps內(nèi)逐漸上升的ESA信號，我們認為這是BRE分子退激發(fā)過程中經(jīng)歷的中間態(tài)，可能是因為BRE分子的扭轉(zhuǎn)形成的。

圖2 BRE(濃度為10 μmol·L-1)與BRE-Cu2+配合物(BRE濃度為10 μmol·L-1；Cu2+濃度分別為10，40，100，200，400 μmol·L-1)的紫外可見吸收光譜(a)和熒光發(fā)射光譜(b)Fig.2 UV-Vis absorption (a) and fluorescence emission spectra (b) of BRE (concentration:10 μmol·L-1) and BRE-Cu2+ complex (concentration of BRE:10 μmol·L-1;concentration of Cu2+:10,40,100,200,400 μmol·L-1)

表1 BRE與BRE-Cu2+的吸收、發(fā)射峰和熒光量子產(chǎn)率Table 1 Absorption，emission peak wavelength and fluorescence quantum yield of BRE and BRE-Cu2+ complex

當(dāng)BRE分子與Cu2+形成配合物后，其瞬態(tài)吸收光譜信號發(fā)生明顯變化。峰值為430 nm左右的負信號是典型的GSB信號，與紫外可見吸收光譜的吸收峰波長一致。峰值在480 nm附近且隨時間推移逐漸藍移(在200 ps時，峰值處波長約為475 nm)的是ESA信號，伴隨著短壽命的激發(fā)態(tài)弛豫過程。從整體上看，500～600 nm之間BRE-Cu2+比BRE少了一個ESA峰。選取515和550 nm處的動力學(xué)曲線進行對比，如圖4(a)，可以看出，BRE在515和550 nm附近有明顯的中間態(tài)建立過程，而且兩處上升沿趨勢不同。而BRE-Cu2+則是直接到達激發(fā)態(tài)。光物理過程的明顯區(qū)別說明BRE與Cu2+配位之后發(fā)生了能級耦合，我們猜想BRE的熒光猝滅可能是由于配體到金屬的電荷轉(zhuǎn)移(ligand-to-metal charge transfer,LMCT)導(dǎo)致輻射躍遷速率變低。

圖3 BRE和BRE-Cu2+的瞬態(tài)吸收光譜Fig.3 Transient absorption spectra of BRE and BRE-Cu2+ complex

圖4 BRE和BRE-Cu2+在515和550 nm處的動力學(xué)曲線Fig.4 Kinetics of BRE and BRE-Cu2+ complex at 515 nm,550 nm

為了驗證上述理論，我們探測了紅外區(qū)域的瞬態(tài)吸收光譜，如圖5所示。由圖2的紫外可見吸收光譜知BRE-Cu2+在815 nm附近產(chǎn)生了新的吸收帶，而圖5顯示樣品在805～840 nm處有正的ESA信號，而不是負的GSB信號，信號強度在十幾皮秒時達到了最大，然后隨時間減弱，說明此處的能態(tài)是樣品分子被激發(fā)后的一定時間內(nèi)生成的LMCT態(tài)，而不是分子本身的初始激發(fā)態(tài)。我們對數(shù)據(jù)進行全局擬合，得到兩個壽命11和186 ps，如圖6為839 nm處的動力學(xué)曲線，可以看出，這個中間態(tài)有一個建立的過程，因此我們認為11 ps的壽命就是LMCT態(tài)，即被激發(fā)的分子存在一個11 ps的配體到金屬的電荷轉(zhuǎn)移過程，然后以186 ps弛豫回基態(tài)。因此，Cu2+與BRE的配位導(dǎo)致BRE熒光猝滅的原因是發(fā)生了配體到金屬的電荷轉(zhuǎn)移，增加了一個激發(fā)態(tài)的非輻射弛豫通路，從而減小了輻射躍遷速率。此外，銅離子對膽紅素、膽綠素等線性四吡咯分子的熒光也有猝滅作用，我們可以推測在這些結(jié)構(gòu)類似的分子中，也存在吡咯環(huán)到銅離子，即配體到金屬的電荷轉(zhuǎn)移，這個激發(fā)態(tài)的電荷轉(zhuǎn)移過程使配體分子發(fā)生熒光猝滅。

圖5 BRE-Cu2+的紅外區(qū)域的瞬態(tài)吸收光譜Fig.5 Transient absorption spectra of BRE-Cu2+ complex in infrared region

圖6 BRE-Cu2+在839 nm處的動力學(xué)曲線Fig.6 Kinetic of BRE-Cu2+ complex at 839 nm

3 結(jié) 論

以膽紅素二甲酯與銅離子的配合物為研究對象，用紫外可見分光光度法、穩(wěn)態(tài)熒光發(fā)射光譜和飛秒瞬態(tài)吸收光譜等技術(shù)對其進行了分析。Cu2+對BRE有明顯的熒光猝滅作用，使BRE-Cu2+的熒光量子產(chǎn)率降低為BRE的5%。配合物分子在吸收光子到達激發(fā)態(tài)后會伴隨著振動弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換、系間竄越、熒光發(fā)射以及電荷轉(zhuǎn)移、質(zhì)子轉(zhuǎn)移等過程，它們通常發(fā)生在超快時間尺度內(nèi)。瞬態(tài)吸收光譜技術(shù)是研究在液相中分子超快動力學(xué)的一種理想方法。BRE和BRE-Cu2+的瞬態(tài)吸收光譜表明，BRE與Cu2+發(fā)生了能級耦合，激發(fā)態(tài)的BRE-Cu2+出現(xiàn)了與BRE不同的光物理過程，熒光猝滅可能是由于配體到金屬的電荷轉(zhuǎn)移。然后我們在紅外探測的瞬態(tài)吸收光譜中看到了LMCT態(tài)的信號，這個中間態(tài)有11 ps的建立過程，然后激發(fā)態(tài)分子以186 ps弛豫回基態(tài)。