葉 茂，孫明明，黃 丹，張忠云，趙遠(yuǎn)超，胡 鋒，蔣 新*

(1 中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點實驗室(南京土壤研究所)，南京 210008；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院土壤生態(tài)實驗室，南京 210095)

隨著全球化、信息化、智能化等人類文明進程模式的快速升級與更迭，大量尚未被安全化處置的人類家庭生活、醫(yī)療、化工、農(nóng)業(yè)等生產(chǎn)運行過程中產(chǎn)生的毒害廢棄物，會經(jīng)過各種直接或間接途徑進入土壤生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中[1-3]，致使土壤成為滋生、殘留和傳播人畜共患致病細(xì)菌重要的源和匯[4-5]，給人體健康、生態(tài)環(huán)境安全和社會經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展帶來了極大的風(fēng)險和隱患[6-7]，是亟需解決的新型生物污染土壤問題[8-9]，開展針對性的治理研究十分必要。由于細(xì)菌噬菌體(bacteriophage 或 phage)具有較為專一的寄生、捕食和裂解宿主細(xì)菌的特性[10-11]，采用噬菌體療法(phage therapy)靶向追蹤削減土壤生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中多種致病細(xì)菌的方式是一種具有廣泛應(yīng)用潛力的綠色生物管控技術(shù)[12]，目前已得到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視，正成為致病細(xì)菌生物污染土壤防治領(lǐng)域內(nèi)新的研究熱點。

1 噬菌體療法簡介

1.1 噬菌體的分類

細(xì)菌噬菌體(簡稱噬菌體)是一類較為專性“捕食”活細(xì)菌的生物體，分類上屬于病毒的一種[13-14]。其生化結(jié)構(gòu)主要由蛋白質(zhì)衣殼(60%)和核酸(40%)組成，無完整成熟的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[15]。如圖1 所示，噬菌體內(nèi)核酸遺傳物質(zhì)存在于正多面體的蛋白頭殼之中，通過頸圈的銜接將頭殼與尾鞘、尾管相連，并在尾管底部形成基盤、尾絲與尾釘，用于噬菌體在環(huán)境中捕獵和侵染宿主細(xì)菌[16-18]。在透射電鏡下觀察，噬菌體長度通常在20 ～ 200 nm，同時噬菌體也是地球上物種豐度最高的微小生物體，在土壤、水、空氣乃至人/動物體表或腸道內(nèi)都廣泛分布了大量種類繁多的噬菌體[19-20]。據(jù)估算其總數(shù)量約在1031數(shù)量級，總質(zhì)量約 109t，每秒噬菌體侵染宿主細(xì)菌的數(shù)目約在1023～ 1025CFU[21-23]。根據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)特點，可將其劃分為有尾噬菌體、無尾噬菌體和絲狀噬菌體3 種類型[24]。目前已知噬菌體的核酸類型主要為雙鏈dsDNA(長度約由5×103～ 5×106堿基對組成)，少部分遺傳物質(zhì)以單鏈ssDNA、雙鏈dsRNA 或單鏈ssRNA存在[25]。此外，根據(jù)噬菌體在侵染宿主過程中是否將自身DNA 整合到細(xì)菌基因組上的差異，又可將噬菌體劃分為烈性噬菌體(lytic phage)和溫和噬菌體(temperate phage)[26]。其中烈性噬菌體會在環(huán)境遷移過程中識別宿主細(xì)菌細(xì)胞膜表面特異性結(jié)合位點并進行配對吸附，隨后噬菌體尾鞘收縮，核酸通過空心的尾部將自身DNA 注入宿主細(xì)菌體內(nèi)，執(zhí)行侵入過程，接著細(xì)菌染色體將會被水解酶迅速斷裂水解，此時噬菌體DNA 將利用宿主體內(nèi)的核酸堿基對和能量物質(zhì)，快速完成自身核酸復(fù)制和蛋白質(zhì)合成，進而在細(xì)菌體內(nèi)裝配和增殖大量子代噬菌體，并釋放細(xì)胞壁溶壁酶，致使宿主細(xì)菌破裂死亡，最終完成裂解釋放的過程[27]。溫和噬菌體在執(zhí)行完上述DNA 的侵入過程后，并不會迅速增殖或裂解宿主細(xì)菌，而是將自身DNA 通過整合酶系統(tǒng)融合到宿主細(xì)菌的染色體上，或以質(zhì)粒的形式存在于宿主體內(nèi)，并伴隨著宿主的復(fù)制和增殖，穩(wěn)定遺傳[28]。通常只有在受到外界環(huán)境介質(zhì)中干擾因子(如：紫外線、高溫、電離輻射、抗生素、重金屬、絲裂霉素C、養(yǎng)分脅迫、氧化還原條件驟變)的影響下，才會再次轉(zhuǎn)入烈性噬菌體的增殖循環(huán)過程[29]。

圖1 常見烈性噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 The structural sketch of bacteriophage

1.2 噬菌體療法

由于世界范圍內(nèi)存在抗生素的濫用及其他共存污染物(如：重金屬、農(nóng)藥、消毒劑、氧化劑、過量氮/磷元素等)的同步篩選作用(co-selection)[11-14,17]，土壤環(huán)境已成為抗生素抗性細(xì)菌(antibiotic resistance bacteria，ARB)和抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)重要的“源”和“匯”[30-32]。由于ARGs 具有快速傳播和擴散的能力，土壤生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中致病細(xì)菌獲得并表達抗性的頻率顯著增加[33-35]；當(dāng)前由于新型抗生素藥物的研發(fā)周期遠(yuǎn)落后于環(huán)境中抗性致病細(xì)菌自然突變和進化的速率，甚至土壤環(huán)境中已檢測出多重抗藥性(multidrug resistant, MDR)的超級耐藥細(xì)菌，這使得抗性致病細(xì)菌在土壤-微生物-植物(作物)-動物-人類等多元食物網(wǎng)中的傳播擴散風(fēng)險日益嚴(yán)重[36-38]。因而，噬菌體療法獲得了醫(yī)學(xué)和生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域內(nèi)科學(xué)家的極高重視。噬菌體療法是指通過篩選、純化和富集特定宿主致病細(xì)菌的專屬性烈性噬菌體，向致病細(xì)菌污染的生態(tài)環(huán)境介質(zhì)(土壤、水體或植物)中添加特定噬菌體菌液，定向侵染并滅活致病細(xì)菌的治療方式[10-12]。由于噬菌體具有相對特異性侵染某一種(species)或同一屬內(nèi)(genus)幾種高度同源性宿主細(xì)菌的特點，因而噬菌體療法具備天然的靶向性和追蹤性，不會對目標(biāo)致病細(xì)菌以外的其他健康細(xì)菌群落產(chǎn)生直接或迅速的滅活作用，這也是相較于傳統(tǒng)廣譜性抗生素療法的優(yōu)點之一[13-15,39-40]。此外，噬菌體療法往往采用最佳感染復(fù)數(shù)值來滅活目標(biāo)致病細(xì)菌，而在最佳感染復(fù)數(shù)條件下活體噬菌體的初始接種量通常是目標(biāo)致病細(xì)菌數(shù)量的0.01% ～ 10%，并且由于單個噬菌體主要在宿主細(xì)菌體內(nèi)完成增殖、裂解和指數(shù)倍釋放子代噬菌體的生理過程，因而噬菌體療法的初始接種量一般較低[23-28]。同時由于噬菌體療法還兼具一定的自限性，即當(dāng)目標(biāo)致病細(xì)菌被噬菌體滅活至在整個細(xì)菌群落中不顯著表達致病能力或不占據(jù)主導(dǎo)生態(tài)位時，噬菌體的數(shù)量也將隨之銳減，僅保留部分低豐度活性的噬菌體，用于維持對目標(biāo)致病細(xì)菌的持續(xù)滅活壓力和維持噬菌體的生物多樣性[17-24]。

2 噬菌體療法在土壤環(huán)境系統(tǒng)中靶向滅活致病細(xì)菌的應(yīng)用

2.1 功能噬菌體的分離、篩選、鑒定和生物學(xué)特性表征

針對特定的致病細(xì)菌分離和篩選專屬高效烈性噬菌體，是噬菌體療法在生物污染土壤環(huán)境系統(tǒng)中應(yīng)用的前提條件。針對目標(biāo)致病細(xì)菌，從土壤中分離篩選專屬性噬菌體的方法主要是先富集培養(yǎng)并提取土壤中總微生物溶液，隨后經(jīng)過細(xì)菌濾器的過濾分離，采用雙層瓊脂平板法進行粗篩，以平板上出現(xiàn)噬菌斑(plaque)為依據(jù)，挑選直徑較大、菌斑清晰、中間透明、邊緣均勻的單斑，進行重復(fù)多次純化和富集，獲得純度較高的噬菌體溶液[13-16]，最后對獲得的噬菌體進行表型和基因型的定性定量鑒定表征。通常使用磷鎢酸負(fù)染法，在透射電鏡下觀察噬菌體形態(tài)，并依據(jù)2016 年國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses)第十次報告中噬菌體分類與命名標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合形態(tài)特征初步定性劃分至“科”級別[41]。接著對噬菌體核酸進行提取，使用多種核酸限制性內(nèi)切酶，判斷噬菌體核酸是單鏈或雙鏈DNA 或RNA 類型，并估算噬菌體基因組大小[23-25]。再進一步通過鳥槍法對噬菌體DNA 進行文庫構(gòu)建，并通過高通量全基因組測序技術(shù)獲得噬菌體堿基序列，隨后在美國國立衛(wèi)生研究院網(wǎng)站上利用開放閱讀框(open reading frame, ORF)查詢軟件對ORF 中潛在基因長度、密度和功能進行分析和預(yù)測，完成系統(tǒng)發(fā)育樹的鑒定和描繪，進而更為準(zhǔn)確地鑒定噬菌體基因型分類特征[14-19]。

此外，噬菌體裂解目標(biāo)宿主致病細(xì)菌的生物學(xué)特性也是其能否合適于噬菌體療法應(yīng)用的重要參考。外界環(huán)境因子(pH、離子濃度、溫度和光照條件等)可能會對噬菌體裂解宿主細(xì)菌的活性產(chǎn)生影響，并且噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)值(即：在純培養(yǎng)條件下，可獲得最多子代噬菌體，而確定的噬菌體與宿主細(xì)菌最佳接種數(shù)量比例)需要進行優(yōu)化探明[42-43]，同時測定噬菌體一步生長曲線，明確噬菌體潛伏期、裂解期和穩(wěn)定期的時長及宿主細(xì)菌抗逆噬菌體的突變頻率，再以目標(biāo)致病細(xì)菌的滅活數(shù)量級來綜合表征噬菌體的裂菌效果[44]。通常選取對環(huán)境因子耐受性強、滅活宿主細(xì)菌能力高、不含有毒力因子，且宿主細(xì)菌抗逆突變頻率低的噬菌體作為實際應(yīng)用中的備選生物材料[45]。

2.2 噬菌體療法在土壤-植物體系中滅活致病細(xì)菌的應(yīng)用

噬菌體療法最初主要應(yīng)用在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中人類感染相關(guān)致病細(xì)菌而進行的疾病治療。近來年在土壤-植物(作物/蔬菜/果樹)體系中引入“農(nóng)業(yè)噬菌體療法”(agricultural phage therapy)的概念來滅活致病細(xì)菌的研究也得到了長足發(fā)展。使用農(nóng)業(yè)噬菌體療法在土壤-植物體系中靶向滅活青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)的研究已有較多報道[46-48]。Askora 等[43]從農(nóng)田土壤中分離純化得到4 株專性針對青枯雷爾氏菌的噬菌體(φRSL，φRSA，φRSM 和φRSS)，隨后將噬菌體原液在植物根系周邊土壤中直接進行灌根處理或在距離土壤表面1 cm 內(nèi)的植物主莖中注入噬菌體原液，發(fā)現(xiàn)處理后西紅柿和煙草生長過程中青枯菌發(fā)病概率和病害程度顯著降低，有效消減了青枯菌殘留豐度；Fujiwara 等[47]將西紅柿種子在分離篩選出的高效噬菌體φRSL1 原液中進行浸泡預(yù)處理后發(fā)現(xiàn)，在西紅柿生長期的4 個月內(nèi)，土壤根區(qū)中噬菌體φRSL1 可顯著抑制根區(qū)土壤中青枯雷爾氏菌向西紅柿根系的侵染過程，并且在西紅柿莖葉中也檢測到穩(wěn)定豐度和活性的噬菌體φRSL1，說明噬菌體療法在土壤-植物體系病害細(xì)菌防治過程中具有一定的自主靶向遷移性，接種至土壤中的噬菌體不僅可以有效抑制植物根系周邊致病細(xì)菌爆發(fā)的風(fēng)險，而且還可以進入植物組織內(nèi)部長期維持追蹤滅活植物內(nèi)生致病細(xì)菌的能力。Frampton 等[49]從獼猴桃果園土壤中分離篩選出275 株有尾噬菌目(Caudovirales)噬菌體，并通過進一步基因組鑒定，確定其主要隸屬于肌尾噬菌科(Myoviridae)、短尾噬菌科(Podoviridae)和長尾噬菌科(Siphoviridae)噬菌體，發(fā)現(xiàn)這些噬菌體大多具有專性滅活獼猴桃果樹中植物病害菌丁香假單胞菌(Pseudomonas syringaepv. actinidiae)的能力。Meczker等[50]從已受到解淀粉歐文菌(Erwinia amylovora)毒害作用的蘋果園土壤中，分離篩選出多種長尾科(Siphoviridae)家族的噬菌體，并進行了全基因測序和親緣分析，指出在果樹病害爆發(fā)的土壤中就近篩選目標(biāo)噬菌體，可以為靶向滅活植物病害細(xì)菌提供巨大的“武器”資源庫。Chae 等[51]從淹水水稻土中分離篩選出 34 株噬菌體，其中 29 株屬于肌尾噬菌科(Myoviridae)家族，并研發(fā)出使用脫脂奶粉負(fù)載噬菌體噴施在水稻表面的方式，既可以有效殺滅水稻中細(xì)菌性葉疫病菌(Xanthomonas oryzaepv. oryzae)，又可以減少自然條件下日光紫外線對噬菌體療法效果的負(fù)面作用。

在農(nóng)業(yè)噬菌體療法的規(guī)模化運用上，西方國家大多制定了較為嚴(yán)苛的法律條文，但在一些特殊法案的規(guī)定下，噬菌體療法公司近年來也得到了顯著發(fā)展。在美國部分州市地方政府的授權(quán)下，鹽湖城市、圣地亞哥市、巴提摩爾市、帕羅奧圖市都已探索性成立并專營產(chǎn)業(yè)化的“噬菌體療法”生物公司(AmpliPhi 公司、Intralytix 公司、Omnilytics 公司、Gangagen 公司等)，他們根據(jù)在土壤上種植西紅柿、辣椒、葡萄等過程中出現(xiàn)的典型病害細(xì)菌，研發(fā)了“從農(nóng)場土壤到科技公司，再回歸到農(nóng)場作物”的及時診斷、量身研發(fā)、針對性治療的運營模式，在使用噬菌體療法防治土壤-作物體系中病害細(xì)菌問題的解決方案上積累了許多成功的經(jīng)驗。此外，針對某些人類治病細(xì)菌在作物生長過程中也會從土壤介質(zhì)不斷遷移定殖在作物組織內(nèi)的風(fēng)險，此類科技公司也研發(fā)了可以定向滅活作物組織中大腸桿菌(E. coli)、沙門氏細(xì)菌(Salmonella)、志賀氏桿菌(Shigella)、李斯特菌(Lysteria)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、腸球菌(Enterococcus)、鏈球菌(Streptococcus)等人類致病細(xì)菌的噬菌體療法田間技術(shù)與產(chǎn)品。此外，由于醫(yī)療理念和學(xué)科發(fā)展的不同，相較于西方國家，俄羅斯和格魯吉亞關(guān)于農(nóng)業(yè)噬菌體療法的應(yīng)用研究和公司運營及發(fā)展現(xiàn)狀則更為活躍。如俄羅斯Immunopreparat Research Productive Association 公司、格魯吉亞Biochimpharm 公司和Phage Therapy Center 等都是世界著名的農(nóng)業(yè)噬菌體療法中心。

然而，在我國噬菌體療法大多仍處于實驗室或田間的基礎(chǔ)研究階段，尚未有專營的公司進行市場化或規(guī)?；膽?yīng)用實例。農(nóng)業(yè)噬菌體療法在我國土壤-植物領(lǐng)域內(nèi)的研究和應(yīng)用早在20 世紀(jì)80 年代就已有科學(xué)家進行相關(guān)探索和嘗試。許志綱等[52]從水田中成功分離獲得24 株針對水稻細(xì)菌性葉疫病菌的噬菌體，堵鶴鳴等[53]從桑樹病田土壤中分離篩選出29 株針對桑葉疫病菌(Pseudomonas mori)的噬菌體，他們對分離出的噬菌體都進行了初步的生物學(xué)特性鑒定和表征。近年來蘇靖芳等[28]、馬超等[54]、劉俊麗[55]、高苗[56]也主要圍繞土壤-植物(馬鈴薯、西紅柿、煙草、果樹、煙草)體系中青枯雷爾氏菌、獼猴桃潰瘍病菌開展了一系列噬菌體療法的生物防控研究工作。上述研究為開發(fā)我國土壤中噬菌體療法的資源庫存奠定了重要基礎(chǔ)。

2.3 噬菌體療法在土壤-動物體系中滅活致病細(xì)菌的應(yīng)用

早在科學(xué)家Felix d’ Herelle 首次發(fā)現(xiàn)噬菌體后，科學(xué)界就一直嘗試將其用于動物細(xì)菌性感染的治療，但由于當(dāng)時對噬菌體的特征及本質(zhì)缺乏了解，早期的動物噬菌體療法研究結(jié)果混亂，重復(fù)性也較差，并未受到其他醫(yī)學(xué)同行的認(rèn)可。直到20 世紀(jì)80 年代，隨著細(xì)菌抗生素耐藥性的日趨嚴(yán)重，噬菌體療法才重新受到重視，美國FDA 也在2006 批準(zhǔn)使用噬菌體控制肉類產(chǎn)品中的李斯特菌[57]。我國對于噬菌體療法在動物細(xì)菌性疾病防治的研究主要從21 世紀(jì)初開始，針對于不同動物細(xì)菌感染已有較多成功的報道，如利用噬菌體控制動物沙門氏菌、彎曲桿菌(Campylobacter)、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等[58]。同時，使用噬菌體療法在土壤-動物體系中靶向滅活致病細(xì)菌的研究也有較多成功報道。張利軍[59]從土壤中分離得到烈性噬菌體φ03Z-1，在30 代傳代培養(yǎng)之后仍對生物武器類碳疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)和短小芽孢桿菌(Microbacillus)有很好的裂解效應(yīng)，同時發(fā)現(xiàn)φ03Z-1 對于土壤樣本中的類炭疽芽胞殺滅率可達到60.3% ～ 92.1%。李存香[60]從我國云南省鼠疫疫源地土壤中分離出肌尾科鼠疫噬菌體φYL060，對其宿主鼠疫疫苗株EV76 具有很好的裂解效果。針對牛類細(xì)菌感染的噬菌體療法研究主要集中在金黃色葡萄球菌感染導(dǎo)致的牛乳腺病以及分枝桿菌感染引起的牛結(jié)核病等。蘇勝兵[61]從12 頭感染牛和6 頭健康牛的唾液和鼻黏液及50 份土壤樣本中分離純化得到18 株噬菌體，其中一株噬菌體CJAUS9能夠以模式菌株恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)mc2155 為宿主菌，具有治療土壤及牛體內(nèi)結(jié)核致病細(xì)菌的潛在效應(yīng)。

2.4 噬菌體療法在土壤-地下水體系中滅活致病細(xì)菌的應(yīng)用

土壤-地下水系統(tǒng)是指包括從地表土壤頂部延伸至地下水位的非飽和區(qū)(vadose zone)及包氣帶下邊緣地下水的飽和區(qū)(phreatic zone)。它是一個非均質(zhì)組成、非均相滲透性的體系，非飽和區(qū)具有土壤層理化性質(zhì)，上連大氣，下接飽和區(qū)，有較好的連通性，因而致病細(xì)菌可以在土壤-地下水系統(tǒng)中遷移擴散并滋生定殖。Forslund 等[62-63]發(fā)現(xiàn)，使用含有沙門氏細(xì)菌(Salmonella Senftenberg)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、大腸桿菌(Escherichia coliO157：H7)的地下水進行農(nóng)田回溉時，土豆食品安全會受到致病細(xì)菌的污染，但如果在滴灌水系統(tǒng)中添加特異性噬菌體不僅可以有效監(jiān)測3 類宿主細(xì)菌在農(nóng)田土壤-地下水中的遷移及賦存狀態(tài)，評估污染狀況，還可以在土壤中靶向滅活致病細(xì)菌，大幅減少致病細(xì)菌向地下水的遷移擴散風(fēng)險。

3 噬菌體療法對土壤生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)的影響

噬菌體是嚴(yán)格的細(xì)菌內(nèi)寄生生物體，其復(fù)制循環(huán)對于土壤宿主種群、群落相互作用、元素循環(huán)、抗生素抗性基因傳播擴散等都有重要影響。但目前對于噬菌體對生態(tài)系統(tǒng)功能的影響主要集中在海洋生態(tài)系統(tǒng)中，對于土壤環(huán)境的研究還較為缺乏。

3.1 噬菌體療法對土壤微生物群落及養(yǎng)分循環(huán)的影響

土壤噬菌體群落動態(tài)非?；钴S，且對宿主菌的變化動態(tài)反應(yīng)迅速。由于具備這些特性，噬菌體對于土壤微生物種群具有潛在的由上而下的控制，從而進一步影響由微生物調(diào)控的土壤養(yǎng)分循環(huán)過程[57]。水體環(huán)境中10% ～ 50% 的細(xì)菌死亡是由噬菌體裂解引發(fā)的，且裂解后的產(chǎn)物會被活細(xì)菌利用來刺激自身生長，因而噬菌體數(shù)量的增加通常伴隨著細(xì)菌的生長速率提高。土壤環(huán)境中由噬菌體裂解釋放驅(qū)動的碳循環(huán)，主要遵循圖1 中“細(xì)菌-噬菌體-溶解性有機碳循環(huán)”規(guī)律，即所謂的噬菌體回路。如圖2 所示，可分解碳循環(huán)過程能夠?qū)⑷芙庑杂袡C碳持留在水體表面，否則可能會導(dǎo)致溶解性有機碳轉(zhuǎn)化成為大氣CO2。類似循環(huán)也會發(fā)生在土壤環(huán)境中，大氣CO2由植物光合作用固定后變成新鮮的有機碳輸入到土壤中，隨后這些有機碳被土壤微生物礦化，通過細(xì)胞呼吸作用轉(zhuǎn)化為生物量碳或部分轉(zhuǎn)化為惰性更強的礦物結(jié)合態(tài)。通過裂解作用，土壤噬菌體可以增加易分解碳的含量并降低其他礦質(zhì)結(jié)合態(tài)有機質(zhì)組分的比例。

除了碳循環(huán)之外，土壤環(huán)境中噬菌體對其他營養(yǎng)元素的循環(huán)過程可能也有重要影響，如氮元素(蛋白質(zhì)及核酸)、硫元素(蛋白質(zhì))、磷元素(多磷酸鹽、細(xì)胞膜、核酸)[57,64]。其中根瘤菌噬菌體對于豆科-根瘤菌共生的影響可能會間接影響到土壤氮元素的流通量。研究發(fā)現(xiàn)[65-66]，根瘤菌噬菌體添加到農(nóng)田土壤中后會顯著降解噬菌體敏感根瘤菌的結(jié)瘤效果，且不同噬菌體根瘤菌-宿主菌相互作用對不同土壤中根瘤菌種群的影響并不一致，如固氮根瘤菌的定殖、結(jié)瘤的成敗、共生效果及固氮率。因而為了建立更加精確的全球元素循環(huán)概念模型，很有必要探明烈性噬菌體對于土壤中養(yǎng)分轉(zhuǎn)化速率的貢獻。

除了烈性噬菌體，土壤中還存在大量的溶原性細(xì)菌，即溫和噬菌體將DNA 整合到宿主菌基因組中與宿主菌共存的現(xiàn)象。已有數(shù)據(jù)表明至少40% 的土壤細(xì)菌體內(nèi)含有前噬菌體(prophages)，因而溫和噬菌體與宿主菌共生的現(xiàn)象在土壤環(huán)境中廣泛存在[67-68]。通過寄生在宿主菌細(xì)胞內(nèi)，溫和噬菌體可以調(diào)節(jié)宿主菌的代謝，例如溫和噬菌體能夠編碼轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)蛋白，使噬菌體裂解基因表達沉默，這一蛋白能夠與宿主染色體上的同源基因結(jié)合，使宿主細(xì)菌的代謝功能下調(diào)從而降低能量消耗[69]。當(dāng)土壤中養(yǎng)分供應(yīng)不足時，這一過程會直接影響到宿主的生存。此外，其他一些前噬菌體編碼基因能夠保護宿主菌免受其他噬菌體的侵染，或通過改變宿主表型(溶原性轉(zhuǎn)變)來改變宿主的適應(yīng)能力[70]。

圖2 土壤中碳轉(zhuǎn)化的top-down(噬菌體捕食)及bottom-up(物理基質(zhì)有效性)控制途徑概念模型Fig. 2 Conceptual models of control pathways of top-down (phage predation) and bottom-up (physical substrate availability) in soilcarbon transformat ion

3.2 噬菌體療法對土壤環(huán)境中抗性基因擴散傳播的影響

由于抗生素在醫(yī)療和畜禽養(yǎng)殖業(yè)的廣泛使用，大量殘留抗生素進入土壤環(huán)境中，造成土壤中抗生素抗性細(xì)菌(ARB)和抗性基因(ARGs)的產(chǎn)生，會加速ARGs 的傳播和擴散，并可通過食物鏈傳遞作用，對人體健康和生態(tài)環(huán)境安全帶來巨大威脅。接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)化是導(dǎo)致土壤環(huán)境中ARGs 水平轉(zhuǎn)移及擴散的主要機制，其中的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用是由噬菌體所介導(dǎo)產(chǎn)生的。越來越多的研究者開始關(guān)注噬菌體在土壤環(huán)境ARGs 傳播擴散中所起的重要作用[71-72]。

產(chǎn)志賀毒素的大腸桿菌(Shiga toxin-producingEscherichia, STEC)O157：H7 是一種重要的食源性致病菌，國際上已有多起食用O157：H7 感染食物所導(dǎo)致的中毒事件報道[72]。已有研究發(fā)現(xiàn)從畜禽養(yǎng)殖場中分離的STEC 菌株中能夠監(jiān)測到多種如鏈霉素、磺胺類、四環(huán)素類、氨芐青霉素類的ARGs 等[73-74]。已有實驗室研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中ARGs 能夠在噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用下進行快速水平轉(zhuǎn)移。例如Shousha等[75]研究了從零售雞肉中分離的243 株大腸桿菌噬菌體，發(fā)現(xiàn)其中24.7% 的噬菌體，能夠?qū)⒅辽? 種ARGs 轉(zhuǎn)導(dǎo)至大腸桿菌ATCC13706 細(xì)胞內(nèi)。雖然現(xiàn)有研究尚未觀察到ARGs 在噬菌體介導(dǎo)作用下在STEC 之間發(fā)生水平轉(zhuǎn)移，但已有結(jié)果明確證實了Stx噬菌體能夠?qū)⒖股孛舾写竽c桿菌轉(zhuǎn)化為抗性菌體[72]。因此，可以合理推測出噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用能夠促使ARGs 在不同產(chǎn)Stx 大腸桿菌血清型中進行水平轉(zhuǎn)移。

此外，前人研究發(fā)現(xiàn)噬菌體類型通常能夠與ARGs 類型對應(yīng)起來[76-79]。例如Ziebell 等[76]對加拿大的187 株STEC O157：H7 特征進行研究，發(fā)現(xiàn)其中45 株具有對鏈霉素、磺胺、四環(huán)素的抗性；而在這45 株抗性菌株中，43 株O157：H7 的噬菌體屬于以下3 種噬菌體類型：PT23、PT45、PT67，初步證明了噬菌體在ARGs 擴散傳播中發(fā)揮了潛在強化的作用。K?hler 等[77]在實驗室研究中發(fā)現(xiàn)，豬養(yǎng)殖業(yè)的抗菌素卡巴多司(0.5 ～ 8 mg/kg)能夠使大腸桿菌C600 誘導(dǎo)產(chǎn)生溶原性Stx-噬菌體933W，由于溶原性Stx-噬菌體933W 能夠通過轉(zhuǎn)導(dǎo)作用對四環(huán)素抗性基因產(chǎn)生水平傳播，因此卡巴多司的使用引起了廣泛的關(guān)注。上述溶原性噬菌體一旦釋放到環(huán)境后，很有可能將其攜帶的ARGs 轉(zhuǎn)移至?；蜇i腸道的致病菌中，如O157：H7 或沙門氏菌，從而進一步污染環(huán)境中的農(nóng)作物，并最終威脅到人體健康。

在過去20 年間，全球范圍鼠傷寒沙門氏菌多重抗藥性的檢出率逐漸上升，由1994 年的27% 上到2010 年的58%[78]。與此同時，以鼠傷寒沙門氏菌DT104 為宿主的噬菌體，其多重抗性比例也呈現(xiàn)出指數(shù)增長。研究人員發(fā)現(xiàn)噬菌體PDT17 和ES18 均能通過轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將ARGs 由抗性DT104 轉(zhuǎn)導(dǎo)進入抗生素敏感DT104 菌株中[79]。Bearson 等[80]同樣發(fā)現(xiàn)卡巴多司能夠誘導(dǎo)沙門氏菌產(chǎn)生噬菌體，使其由抗生素敏感菌株轉(zhuǎn)變?yōu)榭剐跃?。此外，Zhang 等[81]研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌P24 噬菌體能夠作為載體將多重抗藥基因從海德堡沙門氏菌(S. heidelberg)(S25)轉(zhuǎn)導(dǎo)進入鼠傷寒沙門氏菌(S. typhimurium)中。上述研究證實了噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用在抗性基因擴散傳播過程中具有一定作用，考慮到噬菌體在土壤中的高豐度，可作為ARGs 重要的儲存庫所，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用對于ARGs 擴散傳播作用依然不可忽視。因此，今后在運用噬菌體療法的同時應(yīng)考慮如何降低對ARGs 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的擴散風(fēng)險。

3.3 影響噬菌體療法在土壤生態(tài)環(huán)境中應(yīng)用效果的因素

3.3.1 土壤溫度 根據(jù)最適生長/致死溫度，土壤細(xì)菌通常分為嗜冷菌、嗜熱菌和中溫菌。與此對應(yīng)，土壤中噬菌體的存活/失活也同樣與溫度密切相關(guān)，但并非一定與其宿主細(xì)菌生存溫度一一對應(yīng)。根據(jù)前人研究結(jié)果，溫度是土壤中噬菌體能否存活的決定性因素，例如土壤中嗜熱脂肪芽胞桿菌(Geobacillus stearothermophilus)噬菌體在45°C 時豐度最高，而在55°C 時其繁殖顯著降低[82]。此外，Tan 和Reanney[83]在土培試驗中發(fā)現(xiàn)與30℃、37℃、55℃相比，環(huán)狀芽胞桿菌(Bacillus circulans)噬菌體在45℃條件下生長狀況最好。而Moce-Llivina 等[84]研究發(fā)現(xiàn)脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis) RYC 2056 噬菌體比其宿主對于溫度的抵抗能力更高，甚至能在60 ～ 80℃條件下存活。

3.3.2 土壤pH 土壤pH 不僅影響宿主細(xì)菌的生長，還會影響噬菌體的存活狀況。Sykes 等[85]從不同pH土壤中分離出 5 種嗜中性鏈霉菌(Streptomyces neutrophilus)和 3 種嗜酸性鏈霉菌(Streptomycetes acidophilic)為宿主菌的噬菌體，發(fā)現(xiàn)當(dāng)土壤pH＜6.0時，盡管嗜酸性鏈霉菌仍然存在，卻無法分離出以其作為宿主的噬菌體。Sykes 和Williams[86]研究還發(fā)現(xiàn)一株自由態(tài)放線菌噬菌體在pH 4.9 時會失去對其宿主菌的侵染能力，認(rèn)為土壤環(huán)境酸度升高會顯著影響噬菌體-宿主相互作用過程的吸附、穿透和潛伏期長度。此外，土壤pH 對于噬菌體的存活還有間接的影響效果。土壤固體顆粒對于噬菌體的常見吸附作用會導(dǎo)致其存活期變長，這是由于作為疏水性膠狀物質(zhì)的噬菌體在土壤固體顆粒上的吸附行為，是由土壤表面電位性質(zhì)及體系pH 決定的。

3.3.3 土壤質(zhì)地 通常認(rèn)為黏土礦物能夠保護噬菌體免受土壤生物及生物因素的干擾而失去活性，從而即使在缺乏宿主菌的情況下仍能存活較長時間。Straub 等[87]將噬菌體φMS2 及PRD-1 連同活性污泥一起施入亞利桑那的沙漠土壤中發(fā)現(xiàn)，在黏壤中兩種噬菌體的存活時間顯著大于砂壤。Babich 和Stotzky[88]在自然條件、滅菌及過濾處理下，對湖水中金黃色葡萄球菌RN450 噬菌體φ11M15 的滅活效果進行研究，發(fā)現(xiàn)凹凸棒和蛭石存在時，噬菌體的滅活效果遠(yuǎn)低于蒙脫石及高嶺石存在時的效果，說明黏土礦物的類型及含量對于噬菌體的存活具有顯著的響應(yīng)。此外，Roper 等[89]研究還發(fā)現(xiàn)蒙脫石的粒徑大小對于噬菌體的侵染能力也有顯著影響，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)蒙脫石粒徑＞0.6 μm 時才能使得噬菌體完全失去裂解大腸桿菌的能力。由上述前人研究可知，黏土礦物的類型及粒徑大小均對噬菌體在土壤中的存活、侵染及裂解宿主的能力有顯著影響。

3.3.4 有機質(zhì)含量(營養(yǎng)狀況) Delisle 和Levin[90]研究了培養(yǎng)基成分對腐敗假單胞菌(Pseudomonas putrefaciosa)噬菌體噬菌斑形成的影響，發(fā)現(xiàn)在TSB培養(yǎng)基中添加草酸鹽能夠抑制噬菌體的形成，說明營養(yǎng)成分，如土壤類型會顯著影響噬菌體對宿主菌的侵染能力及宿主菌的敏感性。宿主細(xì)胞對噬菌體侵染的抵抗原因之一是改變其細(xì)胞表面性質(zhì)，例如，在磷酸鹽缺乏條件下枯草芽孢桿菌(B. subtilis)W23 的細(xì)胞壁會缺失磷壁酸，從而無法完成噬菌體SP50 侵染的第一步—— 噬菌體的識別吸附[91]。Wellington 和Williams[92]研究發(fā)現(xiàn)鏈霉菌的多價噬菌體也能夠侵染G1 放線菌，卻不能侵染GII、GIII、GIV、GIV 組內(nèi)的任何菌株。由于土壤環(huán)境中的底物通常較為貧瘠，土著細(xì)菌可能處于對于噬菌體的侵染并不敏感的狀態(tài)。例如，土壤中通常很難檢測出球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)的噬菌體，但在添加營養(yǎng)元素后可以大量檢出，甚至不需要添加宿主細(xì)菌，說明土壤中噬菌體可能處于未被激活的狀態(tài)。

3.3.5 土壤含水量 土壤含水量對于噬菌體的活性具有非常顯著的影響。Straub 等[87]研究污泥施用對沙漠農(nóng)田土壤中大腸桿菌噬菌體MS2 及鼠傷寒沙門氏菌噬菌體PRD-1 活性的影響，發(fā)現(xiàn)土壤含水量降低至小于50 g/kg 時兩種噬菌體的侵染能力相比于含水量未降低土壤顯著降低，且水分揮發(fā)會使兩種噬菌體活性完全喪失。Williamson 等[93]使用熒光顯微鏡對美國特拉華州6 種土壤中的病毒顆粒進行檢測，發(fā)現(xiàn)其豐度與土壤含水量存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。

3.3.6 其他因素 其他土壤因素如污染狀況、通氣狀況、離子強度等也被證明會顯著影響土壤中噬菌體的活性及侵染效果[94]。Babich 和Stotzky[88]研究發(fā)現(xiàn)，Zn2+與NaCl 的存在通常會顯著影響土壤中大腸桿菌噬菌體T1、T7、P1、φ1 的活性。與此相反，HgCl–3/HgCl2–4復(fù)合體對金黃色葡萄球菌噬菌體φ11M15 及大腸桿菌噬菌體P1 的毒性卻顯著小于相同離子濃度的Hg2+[95]。厭氧條件會使產(chǎn)鈉弧菌(Vibrio natriegens)噬菌體φnt-1 和φnt-6 的潛伏期顯著變長[96]。

4 展望

由于噬菌體療法可以在土壤生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中靶向追蹤滅活特定種類的宿主細(xì)菌，因而具有較為廣泛的應(yīng)用前景，同時也很有必要從全局角度了解噬菌體療法對土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)功能的綜合影響。噬菌體作為土壤豐度最高的生物體，噬菌體療法在土壤生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)中應(yīng)用研究的熱點將集中于以下幾方面：①研發(fā)和篩選更加環(huán)境友好、成本低廉和廣宿主型的噬菌體作為治療制劑，或進行多種專一型噬菌體混合“雞尾酒”療法的研制，從而保證噬菌體在土壤中對宿主致病細(xì)菌高效滅活的持久效率；②探明噬菌體療法對于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能及養(yǎng)分循環(huán)的影響，保障噬菌體療法應(yīng)用過程中對土壤生態(tài)系統(tǒng)的安全性，維持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與多樣性；③建立噬菌體療法在土壤環(huán)境中應(yīng)用的風(fēng)險評估模型及評價方式，建立高效無害化土壤環(huán)境噬菌體療法的運行監(jiān)管機制。