董喬娟，于文娟，許 玲，姜明慧，于盼盼，楊慶振，白秀彬，趙紀(jì)文

（山東扳倒井股份有限公司，山東高青 256300）

傳統(tǒng)大曲生產(chǎn)與白酒釀造為開(kāi)放性的固態(tài)發(fā)酵方式，從而形成了“多微共酵”的發(fā)酵體系，是影響白酒風(fēng)格和品質(zhì)的重要基礎(chǔ)。對(duì)于白酒釀造微生物的研究，多集中于功能微生物的分離、篩選、鑒定及應(yīng)用。在白酒釀造中大量寶貴的微生物資源，對(duì)后期應(yīng)用生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)，穩(wěn)定并提高白酒的風(fēng)格和品質(zhì)提供基礎(chǔ)與保障[1-2]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 供試材料

扳倒井高溫大曲、扳倒井發(fā)酵酒醅、扳倒井窖泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

細(xì)菌分離培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂；酵母菌、霉菌分離培養(yǎng)基：孟加拉紅培養(yǎng)基；細(xì)菌保藏培養(yǎng)基：同細(xì)菌分離培養(yǎng)基；酵母菌保藏培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基；霉菌保存培養(yǎng)基：察氏培養(yǎng)基；細(xì)菌種子培養(yǎng)基：葡萄糖1%，牛肉膏1%，氯化鈉0.5%；酵母菌種子培養(yǎng)基：玉米糖化液；麩皮固體培養(yǎng)基；細(xì)菌液體培養(yǎng)基：同細(xì)菌種子培養(yǎng)基；酵母菌液體培養(yǎng)基：麥芽浸粉肉湯；霉菌液體培養(yǎng)基：蛋白胨1%，葡萄糖1%，磷酸氫二鉀0.1%，七水硫酸鎂0.05%。

1.1.3 儀器設(shè)備

HIRAYAMA HVE-50 立式自動(dòng)滅菌器、ESCO CLASSII BSC AC2-6S1 生物安全柜、Bio-Cinerator紅外接種環(huán)滅菌器、QL-901 振蕩器、江蘇太倉(cāng)DHZ-CA大容量振蕩器、上海一恒GPH-9160"隔水式恒溫培養(yǎng)箱、上?；芫GDHG-9145A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、上海博迅HHS-21-8 數(shù)顯恒溫水浴鍋、普析通用T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、OLYMPUSCX41 光學(xué)顯微鏡、德國(guó)Eppendorf 5424R 型高速冷凍離心機(jī)、德國(guó)Biometra Tone 96 型臺(tái)式PCR擴(kuò)增儀、君意東方JY330C 瓊脂糖凝膠電泳儀、君意東方JY04S-3C凝膠成像分析系統(tǒng)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種的分離、純化

微生物的分離培養(yǎng)采用稀釋平板涂布法。準(zhǔn)確稱取25 g 樣品，置入裝有225 mL 無(wú)菌生理鹽水和玻璃珠的三角瓶中，振蕩10 min，放入30 ℃培養(yǎng)箱中靜置30 min。

用移液槍吸取1 mL 震蕩均勻的菌懸液，置入裝有9 mL 無(wú)菌水的試管中，振蕩均勻，進(jìn)行系列稀釋，依次稀釋到10-6。選取10-3、10-4、10-5、10-64 個(gè)稀釋梯度分別在營(yíng)養(yǎng)瓊脂和孟加拉紅平板上進(jìn)行涂布，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板于37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h；孟加拉紅平板于28 ℃下倒置培養(yǎng)2～3 d。

培養(yǎng)結(jié)束后，挑取平板上生長(zhǎng)出的單菌落，繼續(xù)進(jìn)行多次劃線等純培養(yǎng)操作，直至平板上菌落形態(tài)單一為止。編號(hào)，接種于斜面試管中保藏[3]。

1.2.2 菌株的形態(tài)特征觀察

宏觀形態(tài)觀察：將細(xì)菌接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察菌落特征；將酵母菌接種到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察菌落特征；將霉菌接種到察氏培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，觀察菌落特征。

微觀形態(tài)觀察：將細(xì)菌接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，35 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，用接種環(huán)挑取少許菌落，制成水浸片，置于10×100 倍油鏡下進(jìn)行觀察；將酵母菌接種到麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，用接種環(huán)挑取少許菌落，制成水浸片，置于10×40 倍顯微鏡下進(jìn)行觀察；將霉菌接種到察氏培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，取1 滴棉蘭染色液置于載玻片中央，用透明膠帶在菌落邊緣粘取少量菌體，覆于染色液上，置于10×40 倍顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

DNA 的提取使用天根基因組DNA 提取試劑盒。細(xì)菌采用16S rDNA 分子生物學(xué)鑒定，引物設(shè)計(jì)為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；酵母菌采用ITS 分子生物學(xué)鑒定，引物設(shè)計(jì)為ITS5:5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3' 和ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；霉 菌 采用BT 分子生物學(xué)鑒定，引物設(shè)計(jì)為Bt2a：5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'和Bt2b：5'-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'。利用PCR 擴(kuò)增技術(shù)分別對(duì)16S rDNA、ITS 和BT 進(jìn)行擴(kuò)增后送樣測(cè)序，測(cè)序工作由上海生工完成。

1.2.4 菌株的凍干管制備及入庫(kù)保藏

以脫脂牛奶為保護(hù)劑，將篩選得到的高酶活菌株和抗逆菌株進(jìn)行凍干管制備，保存至扳倒井微生物菌種資源庫(kù)，相關(guān)菌種信息錄入扳倒井微生物菌種信息管理系統(tǒng)。

1.2.5 高酶活菌株的篩選

取新鮮活化細(xì)菌，接種于細(xì)菌種子培養(yǎng)基中，以37 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)過(guò)夜，制備成菌懸液。將懸液接種于麩皮固態(tài)培養(yǎng)基，接種量為5%,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。40 ℃烘干備用。

取新鮮活化酵母菌，接種于酵母菌種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 r/min 搖床培養(yǎng)過(guò)夜，制備成菌懸液。將懸液接種于麩皮固態(tài)培養(yǎng)基，接種量為10%,于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h，40 ℃烘干備用。

霉菌直接挑取菌體接種于麩皮固態(tài)培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)5～7 d，40 ℃烘干備用。

淀粉酶活力測(cè)定方法：稱取10 g 麩曲置于250 mL 燒杯中，加入180 mL 蒸餾水和20 mL 的pH5.5 磷酸緩沖液，攪拌均勻，35 ℃水浴鍋中浸提1 h，濾紙過(guò)濾。取9 mL 1.0%淀粉緩沖液（50 ℃，預(yù)熱5 min）→加1 mL酶液（立即計(jì)時(shí)，50 ℃恒溫水浴準(zhǔn)確反應(yīng)30 min）→迅速吸取0.5 mL 反應(yīng)液于裝有1.5 mL DNS 溶液中（采用25 mL 具塞比色管）→煮沸15 min，冷卻，加10.5 mL 蒸餾水（搖勻）在550 nm波長(zhǎng)比色。

蛋白酶活力測(cè)定方法：按照SB/T 10317—1999方法進(jìn)行測(cè)定。

脂肪酶活力測(cè)定方法：按照GB/T 23535—2009方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 耐高溫菌株的篩選

將活化后的細(xì)菌，劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，分別置于35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

將活化后的酵母菌，劃線接種于麥芽汁瓊脂平板上，分別置于30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察酵母菌生長(zhǎng)情況。

將活化后的霉菌，三點(diǎn)接種法接種于察氏培養(yǎng)基平板上，分別置于30 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃靜置培養(yǎng)5～7 d，觀察霉菌生長(zhǎng)情況。

1.2.7 耐酸菌株的篩選

分別用pH3.0、pH4.0 和pH5.0 緩沖液代替細(xì)菌、酵母菌和霉菌液體種子培養(yǎng)基中的蒸餾水，制成pH3、pH4、pH5、pH 自然的細(xì)菌、酵母菌、霉菌液體培養(yǎng)基。

將細(xì)菌分別接種于pH3、pH4、pH5、pH 自然的細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，以35℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h；將酵母菌分別接種于pH3、pH4、pH5、pH 自然的酵母菌液體培養(yǎng)基中，以28 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h；將霉菌分別接種于pH3、pH4、pH5、pH 自然的霉菌液體培養(yǎng)基中，以28 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)7 d。

生長(zhǎng)量測(cè)定：細(xì)菌、酵母菌不同pH 值下生長(zhǎng)量測(cè)定采用比濁法，以各自對(duì)應(yīng)pH 值的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，在波長(zhǎng)600 nm 下用比色管測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度值OD600；霉菌不同pH 值下生長(zhǎng)量測(cè)定采用稱干重法：將培養(yǎng)液用濾紙過(guò)濾，少量水洗滌，烘箱80 ℃下烘干，稱菌絲干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 扳倒井釀酒微生物的分離篩選及鑒定結(jié)果

通過(guò)分離和多次分純對(duì)比，結(jié)合菌落外觀和鏡檢觀察，從扳倒井大曲、酒醅及窖泥中初步分離得到61 株細(xì)菌、19 株酵母菌和32 株霉菌，其中83 株分離自大曲、14株分離自酒醅、15株分離自窖泥。

細(xì)菌主要為地衣芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、普通高溫放線菌、枯草芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、黃海芽孢桿菌、淤泥大洋芽孢桿菌、韓國(guó)芽孢八疊球菌、沙福芽孢桿菌、泛菌屬、短桿菌屬等；酵母菌主要為扣囊復(fù)膜孢酵母、異常威克漢姆酵母、伯頓絲孢畢赤酵母、庫(kù)德畢赤酵母、戴爾凱氏有孢圓酵母、奇異釀酒酵母；霉菌主要為謝瓦散囊菌、黑曲霉、米根霉、繩狀青霉、產(chǎn)黃青霉、金灰青霉、煙曲霉、溜曲霉、聚多曲霉、宛氏擬青霉、泡盛曲霉、雪白絲衣霉等。

2.2 高酶活菌株的篩選

將初篩得到的112 株菌種接種至麩皮固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結(jié)束后40 ℃烘干，分別測(cè)定其蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活力，篩選出酶活力較高的菌株，結(jié)果見(jiàn)表1—表4。

2.3 耐高溫菌株的篩選

將初篩得到的112 株菌種接種至平板上，分別置于不同溫度下靜置培養(yǎng)，篩選出耐高溫（55 ℃）菌株15株，結(jié)果見(jiàn)表5。

2.4 耐酸菌株的篩選

將112 株菌種分別接種至不同pH 值的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結(jié)束后測(cè)定其生長(zhǎng)量，篩選出1 株耐酸（pH3）細(xì)菌琥珀葡萄球菌（保藏編號(hào)BDJ20103），其余19株酵母菌和32株霉菌均耐pH3.0。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用梯度稀釋法和劃線純化法，對(duì)扳倒井大曲、酒醅及窖泥中的微生物進(jìn)行全面的分離純化，共得到112 株菌種，包括61 株細(xì)菌、19 株酵母菌和32株霉菌，其中83株分離自大曲、14株分離自酒醅、15株分離自窖泥。

表1 高產(chǎn)中性蛋白酶菌株篩選結(jié)果

表2 高產(chǎn)脂肪酶菌株篩選結(jié)果

通過(guò)形態(tài)觀察和16S rDNA、ITS 及BT 序列測(cè)定，對(duì)112 株菌種進(jìn)行鑒定。并對(duì)其進(jìn)行凍干管制作，保藏至扳倒井微生物菌種資源庫(kù)。

對(duì)112 株菌種麩皮培養(yǎng)物的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力進(jìn)行測(cè)定，篩選出高產(chǎn)淀粉酶菌株21株、高產(chǎn)中性蛋白酶菌株16 株、高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株6株、高產(chǎn)脂肪酶菌株20株。

對(duì)112 株菌種在不同溫度下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定，篩選出耐55 ℃的菌株15株。

表4 高產(chǎn)酸性蛋白酶菌株篩選結(jié)果

表5 耐高溫(55 ℃)菌株篩選結(jié)果

對(duì)112 株菌種在不同pH 值液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況進(jìn)行測(cè)定，篩選出耐pH3 的細(xì)菌1 株、酵母菌19株、霉菌32株。

在后續(xù)試驗(yàn)中，將進(jìn)行耐稀氧、耐酒精等抗逆性能的篩選；并進(jìn)一步對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行單菌株和復(fù)合菌株的小型發(fā)酵試驗(yàn)，以篩選出適合大曲生產(chǎn)和白酒釀造的優(yōu)良功能微生物菌株和復(fù)合菌劑。