王 穎， 趙 奎， 秦建忠

蘇州大學附屬第二醫(yī)院 普外科， 江蘇 蘇州 215000

Value of combined measurement of hepatitis B virus covalently closed circular DNA, HBsAg, and hepatitis B virus pregenomic RNA in predicting the treatment outcome of HBeAg-positive chronic hepatitis B patients treated with entecavir

WANGYing,ZHAOKui,QINJianzhong.

(DepartmentofGeneralSurgery,TheSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,Jiangsu215000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate value of combined measurement of serum hepatitis B virus (HBV) covalently closed circular DNA (cccDNA), HBsAg, and HBV pregenomic RNA (pgRNA) in predicting the treatment outcome of HBeAg-positive chronic hepatitis B (CHB) patients treated with entecavir (ETV).MethodsA total of 87 HBeAg-positive CHB patients who were diagnosed and treated in The Second Affiliated Hospital of Suzhou University from May 2015 to May 2017 were enrolled. All patients were treated with ETV for 48 weeks, and the serum levels of HBV cccDNA, HBsAg, and HBV pgRNA were measured at baseline and at weeks 12, 24, and 48 of treatment. Thet-test was used for comparison of normally distributed continuous data between groups, and the Mann-WhitneyUtest was used for comparison of non-normally distributed continuous data between groups. The chi-square test was used for comparison of categorical data between groups, and the Mann-WhitneyUtest was used for comparison of ranked data between groups. A Pearson correlation analysis was performed to determine the correlation of liver HBV cccDNA with serum HBsAg and HBV pgRNA. A multivariate logistic regression analysis was used to investigate the predictive factors for complete response, and the receiver operating characteristic (ROC) curve was used to evaluate the value of serum HBV cccDNA, HBsAg, and HBV pgRNA measured alone or in combination in predicting complete response.ResultsOf all 87 HBeAg-positive CHB patients after 48 weeks of ETV treatment, 38 achieved complete response and 49 did not achieve complete response. Compared with the non-complete response group, the complete response group had significant reductions in the levels of HBV cccDNA at baseline and at weeks 24 and 48 of treatment (Z=-2.452, -2.518, and -2.266, allP<0.001), HBsAg at baseline and at weeks 12, 24, and 48 of treatment (Z=-2.431, -2.750, -2.386, and -2.536, allP<0.001), and HBV pgRNA at weeks 12, 24, and 48 of treatment (Z=-2.674, -2.503, and -2.528, allP<0.001). Compared with the non-complete response group, the complete response group had significantly greater reductions in HBV cccDNA at week 24 of treatment, HBsAg at week 12 of treatment, and HBV pgRNA at week 12 of treatment (Z=-2.352, -2.566, and -2.389,P=0.006, 0.001, and 0.004). Serum HBsAg and HBV pgRNA were positively correlated with HBV cccDNA in liver tissue (r=0.553 and 0.757, bothP<0.001). The levels of HBV cccDNA at week 24 of treatment (odds ratio [OR]=6.248, 95% confidence interval [CI]: 1.574-14.262,P<0.05), HBsAg at week 12 of treatment (OR=5.452, 95% CI: 2.048-16.888,P<0.05), and HBV pgRNA at week 12 of treatment (OR=5.670, 95% CI: 1.201-16.183,P<0.05) were predictive factors for complete response. As for the area under the ROC curve (AUC), HBV cccDNA, HBsAg, or HBV pgRNA measured alone had a significantly lower AUC than the combined measurement of the three indices (0.845/0.741/0.773 vs 0.913, allP<0.001), and the patients with a value of <9.7 could achieve complete response at week 48 of treatment.ConclusionCombined measurement of serum HBV cccDNA, HBsAg, and HBV pgRNA has a good value in predicting the treatment outcome of HBeAg-positive CHB patients treated with ETV.

Keywords：hepatitis B, chronic; DNA, circular; HBV pgRNA; entecavir

慢性乙型肝炎(CHB)是由HBV持續(xù)感染所引起的慢性肝臟炎癥性疾病，可導致肝硬化乃至肝癌的發(fā)生，具有較高的致死率，近年來CHB的發(fā)病率呈現(xiàn)出高速增長之勢，現(xiàn)已成為世界性的衛(wèi)生難題。目前臨床主要采取干擾素類(IFN)和核苷酸類藥物(NAs)抗病毒治療，在NAs中，恩替韋卡(ETV)以抑制HBV DNA作用強、耐藥基因屏障高以及不良反應少等優(yōu)勢，被推薦為一線首選用藥[1]。但近年來ETV也暴露出了治療早期應答率低、療程長等問題[2]，因此如何對其療效精準預測成為學術界研究的重點課題。最新研究[3]提出以HBV共價閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNA)消失或靜默為基礎，以HBV RNA持續(xù)陰性和低HBsAg水平為標準的“準臨床治愈”，可作為抗病毒治療的新階段終點，對指導CHB患者安全用藥、停藥及療效預測等方面可能有重要意義。本文將通過前瞻性研究，重點探討血清HBV cccDNA、HBsAg、HBV前基因組RNA(HBV pgRNA)聯(lián)合檢測對ETV治療HBeAg陽性CHB患者療效的預測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年5月-2017年5月在本院確診為HBeAg陽性CHB患者。診斷標準參考我國《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[4]。納入標準：(1)HBsAg、HBeAg均呈陽性，其中HBsAg陽性維持6個月以上；(2)血清HBV DNA定量檢測>2×104IU/ml；(3)血清ALT水平超過正常值上限2～10倍。排除標準：(1)處于妊娠期或哺乳期女性；(2)合并自身免疫性、藥物性及酒精性肝病或脂肪性肝炎、肝癌者；(3)合并其他病毒免疫缺陷感染疾病以及心肝腎等器官功能嚴重受損者；(4)入組前半年內(nèi)接受過抗病毒、抗肝炎及免疫調(diào)節(jié)等治療者；(5)ETV嚴重過敏史者。所有患者均自愿參加并簽署知情同意書，本研究經(jīng)蘇州大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會審核批準(批號：JD-LK-2017-052-01)。

1.2 試驗方案 患者均采取口服ETV(生產(chǎn)廠家：正大天晴藥業(yè)有限股份公司，國藥準字：H20100019，規(guī)格：0.5 mg/片), 0.5 mg/d，療程48周。治療期間每隔12周對患者血清HBV cccDNA、HBV pgRNA、HBsAg的動態(tài)變化水平進行檢測。并于治療后檢測血清HBV DNA、ALT及HBeAg的水平，據(jù)此評定患者療效。

1.3 檢測方法 (1)HBV cccDNA檢測：肝組織中采取DNA聚合酶消化加滾環(huán)擴增加跨缺口實時熒光定量PCR法，血清中采取PCR熒光探針法，QIA amp DNA提取試劑盒購自德國凱杰公司，DNA聚合酶購自美國Epicentre公司，滾環(huán)擴增試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司，Eco-48型PCR試劑盒由科爾默帕(上海)儀器有限公司提供。(2)HBV DNA檢測：采用熒光定量PCR法，檢測所用ABI 7900 Real-time熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。(3)HBeAg與HBsAg檢測：采用電化學發(fā)光免疫分析法，檢測所用abbott i2000全自動免疫發(fā)光分析儀購自美國雅培公司。(4)HBV paRNA檢測：采用Taqman探針法,檢測所用Real-time PCR Easy TM-Taqman試劑購自上海祈明生物科技有限公司。(5)ALT檢測：采用ELISA法，檢測所用全自動分析儀購自西門子公司。

1.4 療效指標 病毒學應答：HBV DNA載量較基線下降≥2 log10IU/ml或<500 IU/ml的檢測下限；生化學應答：ALT水平降至40 U/L的正常水平；血清學應答：HBeAg陰轉，并未伴隨抗-HBe的出現(xiàn)；完全應答：HBV DNA載量大幅降低(≥2 log10IU/ml)或低于檢測下限(<500 IU/ml)，ALT水平恢復正常(≤40 U/L)，HBeAg陰轉，抗-HBe陽性。

2 結果

2.1 一般資料 研究納入患者共計87例，其中男50例，女37例，年齡22～62歲，平均(36.82±8.21)歲，治療及隨訪期間未出現(xiàn)脫落病例。48周療程結束后獲得完全應答患者38例(獲得組)，未獲得49例(未獲得組)，2組患者性別、年齡以及基線血清HBV DNA、ALT的水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05),完全應答獲得組患者血清HBeAg水平明顯低于未獲得組(P<0.05)(表1)。

表1 2組患者臨床資料比較

2.2 血清HBV cccDNA、HBsAg與HBV pgRNA的動態(tài)變化水平分析 完全應答獲得組患者基線、治療24周、48周時的HBV cccDNA水平明顯低于未獲得組(Z值分別為-2.452、-2.518、-2.266，P值均<0.001)，2組患者治療12周時的HBV cccDNA水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；并且完全應答獲得組在治療24周時的HBV cccDNA下降水平明顯大于未獲得組(Z=-2.352，P=0.006)，兩組患者在治療12、48周時的HBV cccDNA下降水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(圖1a)。

完全應答獲得組患者基線，治療12、24及48周時的HBsAg水平明顯低于未獲得組(Z值分別為-2.431、-2.750、2.386、2.536，P值均<0.001)；并且獲得組在治療12周時的HBsAg下降水平明顯高于未獲得組(Z=-2.566，P=0.001)，2組患者在治療24、48周時的下降水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(圖1b)。

完全應答獲得組患者治療12、24、48周時的HBV pgRNA水平明顯低于未獲得組(Z值分別為-2.674、-2.503、-2.528,P值均<0.001)，2組患者基線HBV pgRNA水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，并且完全應答組患者在治療12周的HBV pgRNA下降水平明顯高于未獲得組(Z=-2.389，P=0.004)，2組患者在治療24、48周時的下降水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(圖1c)。

圖1 完全應答獲得組與未獲得組患者血清HBsAg、HBV pgRNA與HBV cccDNA的動態(tài)變化

2.3 肝組織HBV cccDNA與血清HBsAg、HBV pgRNA間的關系 Pearson相關分析結果顯示，肝組織HBV cccDNA與血清HBsAg、HBV pgRNA均呈正相關(r值分別為0.553、0.757，P值均<0.001)(圖2)。

2.4 患者治療48周時實現(xiàn)完全應答的預測因素分析 收集影響完全應答的潛在因素，進行賦值，采取多因素logistic回歸分析。結果顯示，治療12周HBsAg、治療12周HBV pgRNA、治療24周HBV cccDNA水平可作為預測患者治療48周時實現(xiàn)完全應答的獨立影響因素(表2，3)。

圖2肝組織HBVcccDNA與血清HBsAg、HBVpgRNA的相關性

2.5 HBV cccDNA、HBsAg、HBV pgRNA對48周時完全應答的預測價值分析 將多元logistics回歸分析篩選出的治療12周HBsAg、12周HBV pgRNA與24周HBV cccDNA處理為一個綜合指標，設為Combined，表達式為-2.458+0.942HBsAg+1.013HBV pgRNA+1.546HBV cccDNA。比較ROC曲線下面積(AUC)。結果顯示，Combined的AUC值(0.913)明顯高于HBV cccDNA(0.845)、HBV pgRNA(0.773)、HBsAg(0.741)(Z值分別為-2.411、-2.673、-2.712，P值均<0.001)，其診斷敏感度、特異度分別為94.7、87.4，cut-off值<9.7表示患者治療48周時可獲得完全應答(表4、圖3)。

表2 多因素logistic回歸分析賦值表

表3 患者治療48周時實現(xiàn)完全應答的多因素logistic回歸分析

圖3HBVcccDNA、HBsAg、HBVpgRNA診斷48周時完全應答的ROC曲線

3 討論

薈萃分析[5]顯示，經(jīng)ETV治療48周或96周后患者可獲得較高的HBV DNA清除率與ALT正?；剩谓M織學指標(炎癥活動度、纖維化程度)也有較為明顯改善。因此既往對其療效預測，臨床常通過對血清HBV DNA定量，ALT、抗-HBe、HBeAg的監(jiān)測以及肝活檢進行[6]。但上述指標尚不能準確反應機體對HBV的免疫控制程度，預測價值有限。本研究在檢測HBeAg陽性CHB患者的血清HBV DNA、ALT、HBeAg的基礎上，探尋更具靈敏度、特異度的預測ETV療效的指標及組合。

HBV cccDNA對HBV復制及感染狀態(tài)的建立具有十分重要的意義，但現(xiàn)有的NAs或IFN藥物均無法對其進行徹底清除，尤其是肝內(nèi)cccDNA，只要其仍持續(xù)存在，在轉錄沉默狀態(tài)激活后就極有可能使HBV再度復制活躍，導致感染慢性化[7]，是CHB患者停藥后高病毒反彈率和復發(fā)率的首要原因。因此眾多指南提出將肝組織內(nèi)檢測不到HBV cccDNA作為抗病毒治療的最佳終點[8]，但尚缺乏公認的定量檢測技術，仍需要找到其他替代指標反映肝內(nèi)HBV cccDNA的清除水平。

表4 HBV cccDNA、HBsAg、HBV pgRNA單獨及聯(lián)合檢測診斷48周時完全應答的ROC曲線分析

近年來臨床已初步開展采用與肝內(nèi)HBV cccDNA再激活復制感染過程中相關的血清學標志物預測抗病毒療效及其維持效果的研究。有學者[9]發(fā)現(xiàn)，當肝組織處于炎癥活動階段以及肝細胞發(fā)生變性、壞死時，肝內(nèi)cccDNA可釋放入血,進一步分析發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)與血清中的HBV cccDNA水平具有較大的相關性。最新研究[10-11]指出，血清HBV cccDNA與ALT升高呈明顯的負相關，且較ALT變化有所提前，也與HBV DNA有很好的相關性，是HBV持續(xù)感染的根源之一，鑒于其生物學特性，對抗病毒療效可能有較大的預測價值。HBsAg是以cccDNA為模板生成的HBV外殼蛋白，研究[12]發(fā)現(xiàn)在NAs治療下，血清HBsAg能較好地體現(xiàn)肝內(nèi)HBV cccDNA的下降水平和轉錄活性。目前大量研究[13-14]表明，血清HBsAg清除/轉換常伴隨持久HBV DNA清除的發(fā)生，其治療前后的定量水平及變化是HBeAg、HBsAg消失的強效預測因子。一項關于NAs初治HBeAg陽性患者停藥后的研究[15]也顯示，HBeAg清除后，低基線水平HBsAg(<2500 IU/ml)并且較基線快速下降(>3 log10IU/ml)的患者停藥后可獲得持久完全應答，終末期肝病的發(fā)生率及復發(fā)率大幅降低。HBV pgRNA是只能由cccDNA直接轉錄生成的HBV復制中間產(chǎn)物，常以衣殼化病毒顆粒形式存在于血清，在NAs停藥時，可反映肝內(nèi)HBV cccDNA的殘留及轉錄[16-17]。并且HBV pgRNA也是一種新型HBV血清學標志物，Carey等[18]研究表明，在抗病毒治療過程中HBV pgRNA下降能夠較敏感地反應病毒復制情況，可用于預測HBeAg陽性患者的血清學應答，對篩選出NAs治療最受益的患者以及預測病情嚴重性急性進展具有很大的潛在價值。

本研究結果顯示，采用ETV治療48周后，獲得完全應答患者38例，未獲得49例，治療應答率(43.68%)在國內(nèi)抗病毒藥物中較高，與其能強效地抑制HBV復制以及不易發(fā)生耐藥突變有關[19]。但關于ETV的療效預測還急待改進，本文采取血清HBV cccDNA、HBsAg、HBV pgRNA聯(lián)合檢測進行研究，結果顯示完全應答獲得組基線與治療12、24、48周時的HBsAg水平以及除12周外的HBV cccDNA水平和除基線外的HBV pgRNA水平均明顯低于未獲得組，且總體看來完全應答獲得組患者各指標在治療24周前的水平較未獲得組下降更為明顯，提示治療早期血清HBV cccDNA、HBsAg、HBV pgRNA水平快速下降的患者更有可能實現(xiàn)完全應答，對臨床進行停藥或更換其他抗病毒藥治療等個體化處理具有較大的指導意義。進一步logistics回歸分析顯示，治療12周HBsAg、治療12周HBV pgRNA與治療24周HBV cccDNA的水平可作為48周時患者獲得完全應答的預測指標。在此基礎上行ROC曲線分析結果顯示，血清HBV cccDNA、HBsAg、HBV pgRNA聯(lián)合檢測的AUC值明顯高于各單項指標檢測，筆者分析認為,由于肝內(nèi)HBV cccDNA的形成極為復雜，同時在HBV復制周期中，以其為模版涉及到多種前基因組RNA及不同長度mRNA的轉錄，進而翻譯生成病毒的大部分組成蛋白，因此臨床尚未找到一種可完全替代其預測抗病毒療效價值的指標。而本研究所選取的血清HBV cccDNA、HBsAg、HBV pgRNA均與肝內(nèi)HBV cccDNA具有良好的相關性，三者聯(lián)合檢測可以更為全面地體現(xiàn)肝內(nèi)HBV cccDNA在ETV治療過程中的清除水平及轉錄再激活狀態(tài)，另外三者對預測病毒學應答、血清學應答及生化學應答有各自突出的優(yōu)勢，故聯(lián)合檢測可更為準確地反映出患者獲得完全應答的情況。

綜上所述，血清HBV cccDNA、HBsAg、HBV pgRNA聯(lián)合檢測對預測HBeAg陽性CHB患者的ETV療效具有較大價值。但考慮到本研究納入樣本過少，同時也未開展長時間的隨訪監(jiān)測，相關結論還有待進一步擴大研究論證。