鄭紀(jì)偉，教忠意，王保松，何旭東*

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院， 江蘇 南京 211153； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺柳樹資源圃， 江蘇 南京 211153)

全世界柳樹有500余種，2/3為灌木柳，集中分布在北半球溫帶地區(qū)。我國有柳樹275個種，122個變種，33個變型，各地區(qū)均有分布[1]。在我國，柳樹是重要的園林綠化、優(yōu)質(zhì)的速生用材和高效的生物修復(fù)樹種；在歐洲和北美，灌木柳被廣泛用于生物能源[2]。柳樹為雌雄異株植物，種內(nèi)種間均易雜交，且柳樹是多倍體種群，倍性復(fù)雜，導(dǎo)致柳樹品種的鑒定十分困難[3]。近年來，隨著育種工作的不斷發(fā)展，選育的柳樹新品種日益增多。截止2019年，獲得國家植物新品種保護權(quán)的柳樹新品種已有41個(國家林業(yè)局植物新品種保護辦公室，2020)，主要包括江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院選育的‘蘇柳’系列和山東省林業(yè)科學(xué)研究院選育的‘魯柳’系列等。因此，鑒于新品種權(quán)保護的需要，建立一種柳樹高效、快速、準(zhǔn)確和可靠的分子標(biāo)記鑒定體系，不但有助于保護品種所有權(quán)，更有助于柳樹新品種的商業(yè)發(fā)展。

SSR(simple sequence repeat)標(biāo)記具有共顯性、高度變異、通用性高、重復(fù)性好等優(yōu)點[4]，被作為構(gòu)建指紋圖譜較為理想的分子標(biāo)記[5]，且被國際植物保護聯(lián)盟(UPOV)認(rèn)定為植物新品種保護最廣泛的標(biāo)記體系[6]，國內(nèi)也把DNA水平的鑒定作為品種質(zhì)量監(jiān)控的重要措施。傳統(tǒng)SSR檢測方法與熒光引物和毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合的檢測技術(shù)，具有準(zhǔn)確、高效等優(yōu)點。近年來，已成功應(yīng)用于楊樹(Populussp.)[7]、桂花(Osmanthusfragrans)[8]、刺槐(RobiniapseudoacaciaL.)[9]、含笑(Micheliasp.)[10]和白蠟(Fraxinuschinensis)[11]等木本植物的品種指紋圖譜構(gòu)建和核心種質(zhì)鑒定研究。柳樹中，SSR標(biāo)記多用于遺傳多樣性研究[12-15]，然品種親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建等方面較少[16-17]，而利用熒光SSR標(biāo)記構(gòu)建柳樹指紋圖譜更是未見報道。因此，本研究首次以此技術(shù)構(gòu)建了9個柳樹新品種的指紋圖譜，希望為柳樹新品種的分子鑒定和變異分析提供高效、準(zhǔn)確、可靠的技術(shù)體系，并為其新品種授權(quán)和保護提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與DNA提取

試驗材料為江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院2018年獲得國家植物新品種權(quán)的9個柳樹新品種(見表1)。于江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院柳樹資源圃采集無病害幼嫩葉片，利用基因組提取試劑盒[天根生物生化科技(北京)有限公司，DP305]提取總DNA。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，Nanodrop one檢測樣品的質(zhì)量和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物篩選

從課題組前期研究中篩選11對多態(tài)性較高的EST-SSR標(biāo)記(見表2)[18]，用于構(gòu)建9個柳樹新品種的指紋圖譜。引物正向5′端用熒光基團標(biāo)記，由上海凌恩生物科技有限公司合成。

表1 9個柳樹新品種

表2 11對引物信息

PCR擴增體系和反應(yīng)程序參照鄭紀(jì)偉碩士畢業(yè)論文[19]。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。

1.3 基因分型體系建立

基因分型采用25 μL反應(yīng)體系(見表3)。DNAC(模板)用量為10—15 ng。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，10個循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)。最后72 ℃延伸5—8 min。10 μL變性反應(yīng)體系，包括HiDi 9 μL和LIZ500混合物1 μL。98 ℃變性5 min，迅速置于冰上冷卻后，置于ABI 3730測序儀上進行毛細(xì)管電泳檢測。

表3 PCR反應(yīng)體系

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用MSA軟件計算11個SSR位點的觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)；利用NTSYS-pc 2.1軟件采用UPGMA 法對9個柳樹新品種進行聚類[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性檢測

以9個柳樹的總DNA為模板檢驗11對EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性情況。11對標(biāo)記共擴增出等位片段56條，每個位點等位基因數(shù)3—8個不等，平均為5.1個。其中，引物SALeSSR0020擴增的等位基因數(shù)最多，為8個；引物SALeSSR0020和SALeSSR0961最少，為3個。11個SSR標(biāo)記的觀測雜合度(Ho)變化范圍為0.333 3到1.000 0，平均為0.687 5；期望雜合度(He)變化范圍為0.477 1到0.882 4，平均為0.626 3。多態(tài)信息含量(PIC)變化范圍為0.421 2到0.813 4，平均為0.605 9。引物SALeSSR0920的PIC最高，為0.813 4，引物SALeSSR0246最低，為0.421 2(見表4)。SALeSSR0733標(biāo)記在部分柳樹品種中的基因分型結(jié)果(見圖1)。

表4 11對SSR標(biāo)記在9個柳樹新品種中的多態(tài)性檢測

2.2 指紋圖譜構(gòu)建

通過對每個位點等位片段進一步分析，從11對SSR引物中挑選出3對核心引物用于構(gòu)建9個柳樹品種的指紋圖譜(見表5)。引物SALeSSR0733可區(qū)分7個柳樹品種，引物SALeSSR0086和SALeSSR0920均可區(qū)分6個柳樹品種；引物SALeSSR0086與引物SALeSSR0733和SALeSSR0920中任意1個結(jié)合均可完全區(qū)分9個柳樹品種。因此，利用這3對核心引物不僅可以區(qū)分柳樹9個品種，且可以利用引物間的不同組合進行相互驗證。

注：橫坐標(biāo)代表等位基因的長度(bp)；縱坐標(biāo)代表熒光強度(RFU)圖1 SALeSSR0733標(biāo)記在部分柳樹品種中的基因分型

表5 9個柳樹新品種的指紋圖譜

2.3 聚類分析

將11對引物擴增出的條帶作為原始矩陣，利用NTSYS-pc軟件計算9個柳樹品種的遺傳相似系數(shù)，遺傳相似系數(shù)在0.605 9和0.910 7之間。在相似系數(shù)為0.636 4時，9個柳樹品種可分為3個類群。第Ⅰ類群包括蘇柳1701、蘇柳1702、蘇柳1704、蘇柳1703和蘇柳1705在內(nèi)的5個品種，5個品種又分為2個亞類群，第1個亞類群包括蘇柳1701、蘇柳1702、蘇柳1704，蘇柳1701和蘇柳1702遺傳相似系數(shù)最大，為0.910 7，說明2個品種親緣關(guān)系非常近；第2個亞類群包含蘇柳1703和蘇柳1705。第Ⅱ類群包含蘇柳‘迎春’和蘇柳‘紫嫣’。第Ⅲ類群包括蘇柳‘喜洋洋’和蘇柳‘瑞雪’，與其他 7個品種之間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(見圖2)。

圖2 9個柳樹新品種親緣關(guān)系聚類圖

3 討論

與RAPD，AFLP，ISSR等分子標(biāo)記相比，SSR為共顯性標(biāo)記，在整個基因組中廣泛、隨機和均勻分布，在單個位點的多態(tài)性更高，能高效準(zhǔn)確檢測大量的等位基因，是遺傳學(xué)研究中最受歡迎的分子標(biāo)記之一，是鑒定植物品種的理想分子標(biāo)記[20-21]。本研究中的11對SSR標(biāo)記來源于EST，與基因組SSR(gSSR)標(biāo)記相比，源于基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性與基因功能直接聯(lián)系，通用性更高[22]。同時，熒光SSR標(biāo)記與毛細(xì)管電泳相結(jié)合的檢測技術(shù)能有效檢測差別為1bp的片段變異，比傳統(tǒng)檢測方法更準(zhǔn)確、高效和穩(wěn)定。

研究物種的遺傳多樣性和種質(zhì)間親緣關(guān)系對解決育種和種質(zhì)資源管理問題意義重大[14]。采用傳統(tǒng)的SSR檢測方法對柳樹的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析已有報道，但基于熒光SSR標(biāo)記的毛細(xì)管電泳分型技術(shù)在柳樹中應(yīng)用較少，僅見歐洲紅皮柳(S.purpurea)[13]和北沙柳(S.psammophila)[15]中進行了遺傳多樣性分析，對于柳樹種或品種之間的鑒定研究未見報道。本研究中，11對標(biāo)記共獲得56個等位片段，不同位點擴增的等位片段數(shù)3到8個不等，多態(tài)信息含量平均值為0.605 9，高于歐洲紅皮柳的0.49[13]，與北沙柳的0.61[15]結(jié)果一致，表明SSR標(biāo)記檢測的有效性高。本研究中的9個柳樹新品種通過3對核心引物的兩兩組合可有效鑒定，可見SSR對品種鑒定的可靠性較高。

聚類結(jié)果顯示，9個柳樹品種分為3個類群，第Ⅰ類群中，蘇柳1701和蘇柳1702為同一雜交親本(二色柳×棉花柳)子代，遺傳相似系數(shù)最高，親緣關(guān)系最近，而蘇柳1704的母本同為二色柳，與蘇柳1701和蘇柳1702親緣關(guān)系較近；蘇柳1703和蘇柳1705聚在一起，可能是由于這2個品種的雜交親本中母本均為簸箕柳。在第Ⅱ類群中，蘇柳‘迎春’和蘇柳‘紫嫣’聚在一起，分析原因，可能是由于蘇柳‘迎春’為黃花柳種內(nèi)雜交子代，而蘇柳‘紫嫣’ (簸箕柳(♀)×黃花柳(♂))的父本同為黃花柳，且表型性狀偏向父本黃花柳，從而聚在一起。雖然蘇柳‘喜洋洋’和蘇柳‘瑞雪’雜交親本中母本與蘇柳1701、蘇柳1702、蘇柳1704同為二色柳的相同個體，但不與其聚在一起，且親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這可能與雜交子代的偏向性有關(guān)。從本研究結(jié)果來看，柳樹雜交子代更多偏向于母本。

隨著育種技術(shù)的不斷進步，柳樹新品種數(shù)量與日俱增，從而使品種鑒定、產(chǎn)權(quán)保護和資源管理等工作顯得尤為重要。本研究首次基于熒光SSR標(biāo)記構(gòu)建了9個柳樹新品種的指紋圖譜，每個品種構(gòu)建了唯一的分子身份證，極大地提高了品種鑒定效率。因此，此技術(shù)的應(yīng)用對柳樹品種鑒定和品種權(quán)保護意義重大。