高偉健，朱一超，鄭幽，張波，王征旭，孫強

1.解放軍醫(yī)學院，北京 100853；2.軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京 100071；3.空軍軍醫(yī)大學，陜西 西安 100038；4.解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學中心 生物治療中心，北京 100700

CDH1基因的功能是編碼上皮鈣黏蛋白（epithelial cadherin，E-鈣黏蛋白）。E-鈣黏蛋白是相對分子質量為120×103的跨膜蛋白，由5個串聯(lián)重復序列的胞外區(qū)、胞內區(qū)和跨膜區(qū)組成[1-2]。其胞外區(qū)與相鄰細胞上的鈣黏蛋白結合并形成細胞間黏附，而胞內區(qū)與連環(huán)蛋白結合并激活Wnt信號通路[3]。E-鈣黏蛋白的缺乏造成細胞間黏附系統(tǒng)的功能障礙，細胞與細胞黏附喪失，β連環(huán)蛋白釋放和Wnt信號傳導增加，最終導致腫瘤侵襲性增強[4]。研究顯示，E-鈣黏蛋白的缺失與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后不良相關，如胃癌、頭頸部鱗癌和乳腺癌等[5-7]。Sun等[8]研究發(fā)現，在缺乏內源性表達E-鈣黏蛋白的人乳腺癌細胞中，外源性E-鈣黏蛋白的表達會誘導cell-in-cell結構形成。Wang等[9]研究顯示，與E-鈣黏蛋白免疫組化染色陰性的乳腺癌患者相比，陽性患者的PD-1-腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）更多。而與PD-1+TILs相比，PD-1-TILs能夠產生更多的白細胞介素2和γ干擾素，因此具有更強的免疫活性[10]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術從細菌抵御外來噬菌體和質粒入侵的免疫防御機制演變而來[11]。與鋅指核酸內切酶（zincfinger endonuclease，ZFN）和類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）等經典的基因打靶技術相比，CRISPR/Cas9具有操作簡單、精確高效和制備周期短等優(yōu)點[12]。為了進一步研究E-鈣黏蛋白表達與腫瘤免疫治療之間的關系，我們在本實驗中采用CRISPR/Cas9技術構建CDH1基因敲除的MCF-7細胞系，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

MCF-7細胞、lentiCRISPR v2質粒由軍事醫(yī)學研究院生物工程研究所保存并提供；感受態(tài)大腸桿菌Trans10購自全式金公司；BsmBⅠ限制性內切酶、氯化鈣、2×HBS、嘌呤霉素、Phalloidin染料購自Thermo Fisher公司；T4DNA連接酶購自NEB公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內毒素質粒小提中量試劑盒、基因組DNA提取試劑盒和PCR試劑盒購自天根生化公司；胎牛血清購自PAN-Biotech公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、化學發(fā)光檢測盒、0.25%-EDTA胰酶購自邁晨科技公司；Alexa Fluor 488標記的山羊抗鼠二抗購自Invitrogen公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片劑購自北京中杉金橋公司；鼠源E-鈣黏蛋白抗體購自BD Biosciences公司；鼠源GAPDH抗體購自ABclonal公司；辣根過氧化物酶標抗鼠IgG購自CST公司；單鏈向導RNA（sgRNA）寡核苷酸的DNA序列合成及基因測序由中美泰和生物技術公司完成。

1.2 設計識別靶位點的sgRNA序列

根據NCBI查詢的CDH1基因序列，應用在線sgRNA設計工具（http://chopchop.cbu.uib.no/），根據CRISPR-Cas9靶點設計原則，設計出符合實驗要求的sgRNA序列，進行篩選及脫靶效應評估，比對排除其余同源序列后，得到sgRNA干擾序列。在序列正義鏈與反義鏈的5'端添加BsmBⅠ酶切位點（CACCG/AAAC）。sgRNA正向序列為5'-CA CCGAAGATTGCACCGGTCGACAA-3'，反向序列為5'-AAACTTGTCGACCGGTGCAATCTTC-3'。設計的單鏈sgRNA由公司合成，并經梯度降溫PCR退火形成雙鏈sgRNA。

1.3 重組質粒的構建及鑒定

將lentiCRISPR v2空質粒載體用限制性內切酶BsmBⅠ酶切后通過瓊脂糖凝膠電泳回收，用T4DNA連接酶將退火磷酸化后的sgRNA產物與酶切回收產物連接得到連接產物，將連接產物轉化大腸桿菌Trans10感受態(tài)細胞，均勻涂在氨芐霉素抗性平板上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，隔天挑取生長良好的5個單克隆菌落，在500 μL含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中搖3～4 h，將500 μL菌液裝入無菌的1.5 mL EP管中，送至中美泰和生物技術公司測序，提取序列正確的重組質粒，獲得純化的重組表達載體lentiCRISPRv2-CDH1-KO。

1.4 病毒包裝、感染

取HEK293T細胞按1.0×106/孔的密度接種于6孔板內，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜；當細胞匯合度為80%～90%時，取500 ng lentiCRISPRv2-CDH1-KO質粒、500 ng VSVG包裝質粒、500 ng Pax2包裝質粒、19 μL 1 mol/L氯化鈣共同稀釋在 129 μL ddH2O中，與 152 μL 2×HBS混合轉入HEK293T細胞，孵育6 h后換成DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h；收集含病毒上清，用0.45 μm孔徑的濾器過濾，收集濾液；將人乳腺癌細胞系MCF-7按3.0×105/孔的密度鋪于6孔板中，每孔加入0.5 mL DMEM培養(yǎng)基、1 mL病毒上清、1.5 μL聚凝胺，48 h后用嘌呤霉素（1 g/L）篩選3～4 d，獲得穩(wěn)定表達lentiCRISPRv2-CDH1-KO的MCF-7細胞株。

1.5 CDH1缺失的MCF-7細胞基因組的提取及CDH1基因測序

將獲得的穩(wěn)定表達lentiCRISPRv2-CDH1-KO的MCF-7細胞與對照MCF-7細胞以5.0×105/孔的密度鋪于6孔板中，當細胞密度達到80%后進行消化，收集細胞，用基因組DNA提取試劑盒提取基因組。擴增CDH1基因進行測序，檢測CDH1基因是否敲除成功，PCR上游引物序列5'-GAGAA AGAAATCAGAGCACAAGGAAG-3'，下游引物序列為5'-GTGTTCAGGCCTTTACCACTCTTCTAC-3'。測序驗證后挑選單克隆細胞繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞密度達到70%時，收集部分細胞提取蛋白。

1.6 Western印跡鑒定穩(wěn)定轉染細胞系中E-鈣黏蛋白的表達

分別選取對照MCF-7細胞與表達lentiCRISPRv2-CDH1-KO 的 MCF-7細胞以 5.0×105/孔的密度鋪于6孔板中，12 h后吸走培養(yǎng)基，PBS清洗后用RIPA裂解細胞，提取細胞的總蛋白并用BCA法進行蛋白定量，每個樣各取50 μg總蛋白，與上樣緩沖液混合后煮沸5 min變性，完成蛋白樣本的制備。將樣本進行SDS-PAGE，電泳結束后將蛋白轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉。一抗、二抗孵育，加入曝光底物進行曝光。以GAPDH為內參，Western印跡檢測E-鈣黏蛋白的表達水平。

1.7 免疫熒光染色檢測穩(wěn)定轉染細胞系中E-鈣黏蛋白的表達分布

分別將lentiCRISPRv2-CDH1-KO、對照組MCF-7細胞各2.0×105/孔接種在含蓋玻片的12孔板內，37℃恒溫孵育箱培養(yǎng)12 h；棄上清培養(yǎng)基，PBS清洗后加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定15 min；移除多聚甲醛，用1 mL PBS清洗3次；用1 mL 0.15%的Triton X-100室溫透膜3 min，加入PBS清洗3次；加入5%的牛血清白蛋白室溫封閉1 h，封閉結束后加入鼠抗人E-鈣黏蛋白抗體（1∶200），4℃孵育過夜；次日用PBS洗滌3次；加入Alexa Fluor 488標記的山羊抗鼠二抗（稀釋比為 1∶200），Phalloidin（1∶200）室溫染色 1 h，PBS清洗3次，每次5 min；加入封片劑，避光30 min。

1.8 統(tǒng)計分析

用SPSS 22軟件進行統(tǒng)計學分析，t檢驗比較樣本均數之間的差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lentiCRISPRv2-CDH1-KO載體的鑒定

重組質粒基因測序結果顯示在酶切位點之間插入的片段位置、方向及序列與預期一致（圖1），靶向CDH1基因的sgRNA序列成功插入lenti-CRISPR v2載體，證明lentiCRISPRv2-CDH1-KO重組質粒構建成功。

2.2 CDH1敲除的人乳腺癌MCF-7細胞的DNA測序鑒定

將嘌呤霉素篩選后的多克隆細胞提取基因組DNA，通過測序檢測CDH1基因敲除是否成功。PCR產物測序顯示在PAM序列附近的靶基因位置出現突變（表1）。

2.3 Western印跡檢測CDH1敲除的MCF-7細胞中E-鈣黏蛋白的表達

以未感染的MCF-7細胞系作為對照，Western印跡顯示表達lentiCRISPRv2-CDH1-KO載體的細胞系中的E-鈣黏蛋白水平明顯降低，表達水平幾乎為0，說明CDH1基因敲除成功（圖2）。

2.4 免疫熒光染色觀察CDH1敲除MCF-7細胞中E-鈣黏蛋白的表達分布

圖1 lentiCRISPRv2-CDH1-KO重組質粒測序結果

利用免疫熒光染色觀察對照MCF-7細胞與表達lentiCRISPRv2-CDH1-KO的MCF-7細胞中E-鈣黏蛋白的表達分布。結果顯示，表達lenti-CRISPRv2-CDH1-KO的MCF-7細胞胞膜及胞質中均不能明顯觀察到E-鈣黏蛋白的表達（圖3）。

3 討論

E-鈣黏蛋白的編碼基因CDH1是一種抑癌基因，該基因的突變與多種類型的癌癥有關，其功能喪失可以導致癌癥進展[13]。研究表明，E-鈣黏蛋白可以促進細胞間黏附，并抑制腫瘤細胞的浸潤和轉移[14]。E-鈣黏蛋白低表達是上皮間質轉化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）的一種標志，而EMT與PD-L1和其他免疫檢查點的高表達有關[15-16]。Bradley等[17]發(fā)現E-鈣黏蛋白的轉錄和表達水平與接受免疫檢查點抑制劑治療的腫瘤患者的生存期密切相關。研究人員根據患者接受抗PD-1治療前黑色素瘤樣本中E-鈣黏蛋白mRNA水平的中位數值將患者分為低轉錄組和高轉錄組，治療后2組比較，E-鈣黏蛋白高轉錄組患者的總生存期明顯更長（P=0.0029）。Hugo等[18]報道，在經PD-1阻斷劑治療的黑色素瘤患者中，非響應組E-鈣黏蛋白的轉錄水平較低。E-鈣黏蛋白有可能作為腫瘤患者進行免疫治療的篩選指標。

圖2 Western印跡驗證敲除CDH1的人乳腺癌細胞

圖3 免疫熒光染色觀察CDH1敲除的乳腺癌MCF-7細胞中E-鈣黏蛋白的表達分布

自2012年首次證明CRISPR/Cas9可以在體外進行DNA切割試驗以來，該技術在基因編輯研究中獲得了迅速的發(fā)展[19]，已被廣泛用于基因編輯、轉錄調控、核酸成像和診斷等方面，其多樣性、高效和模塊化正推動著生物技術革命進程[19-20]。在抗腫瘤免疫治療研究中，可以通過CRISPR/Cas9技術靶向敲除腫瘤免疫檢查點分子或者進行高效的多基因修飾，顯著降低了抗腫瘤免疫治療的技術難度和可操作性[21]。

綜上所述，我們采用CRISPR/Cas9技術構建了CDH1基因敲除的穩(wěn)定細胞系，為深入研究E-鈣黏蛋白在腫瘤免疫治療中的作用及相應機制奠定了實驗基礎。