王培宇，孫培冬

(江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

人體在正常生理過(guò)程中，體內(nèi)自由基處于動(dòng)態(tài)平衡，但生活節(jié)奏的加快、不良的飲食睡眠習(xí)慣、環(huán)境污染等會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的自由基，打破這種平衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激?；钚匝?ROS)是自由基的重要組成部分，過(guò)量的ROS會(huì)威脅細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)的有序進(jìn)行，加速細(xì)胞老化甚至凋亡，進(jìn)而影響人體健康。皮膚細(xì)胞由于還受到紫外線照射，更容易陷入ROS過(guò)剩的狀態(tài)，造成氧化損傷。因此，抗氧化在近年來(lái)成為了人們研究的重要課題，天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)日益受到重視[1-2]。

生物活性多肽不僅具有良好的抗氧化性能，而且具有優(yōu)越的生物相容性、易吸收、健康安全等特點(diǎn)，成為全球天然抗氧化物研究熱點(diǎn)。南瓜籽含豐富的油脂和蛋白質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)豐富，尤其是其蛋白質(zhì)中含多種人體必需的氨基酸，是制備多肽的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)原料。張淑蓉等[3]使用木瓜蛋白酶制備南瓜籽蛋白多肽，其抗氧化活性可達(dá)到VC的20%以上。范三紅等[4]使用酸性蛋白酶制備南瓜籽多肽，采用超濾技術(shù)截留的相對(duì)分子質(zhì)量小于4 ku組分清除自由基能力優(yōu)于截留的相對(duì)分子質(zhì)量10 ku組分。目前，關(guān)于南瓜籽多肽報(bào)道[5-7]多集中于抗氧化活性，抗氧化指標(biāo)也停留在化學(xué)方法，未從細(xì)胞水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本文以不同的酶水解南瓜籽蛋白，得到5種南瓜籽多肽，經(jīng)抗氧化性和細(xì)胞增殖活性測(cè)定篩選，并建立人體皮膚細(xì)胞氧化損傷模型，探究南瓜籽多肽對(duì)人體皮膚細(xì)胞體外作用機(jī)制，為南瓜籽多肽的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

南瓜籽，原產(chǎn)地內(nèi)蒙古，巴彥淖爾市大嫂食品有限責(zé)任公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，Sigma公司；人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)、人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCat)，北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司；高糖培養(yǎng)液(DMEM)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗，Thermo-Fisher公司；胎牛血清，Gibco公司；活性氧檢測(cè)試劑盒、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，碧云天生物技術(shù)；二甲基亞砜(DMSO)、氫氧化鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，Lyoquest Plus-85冷凍干燥器，Waters 1525EF高效液相色譜儀，日本東曹TSKgel 2000SWXL凝膠色譜柱(300 mm×7.8 mm)，Tecan Infinite 200 Pro多功能酶標(biāo)儀，MCO-15AC細(xì)胞培養(yǎng)箱，SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，Olympus Ckx41倒置生物顯微鏡，CARY Eclipse熒光分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 南瓜籽多肽的制備

參照文獻(xiàn)[8-9]的方法制備南瓜籽蛋白和南瓜籽多肽。用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶-胰蛋白酶、堿性蛋白酶-風(fēng)味蛋白酶酶解南瓜籽蛋白。不同酶解產(chǎn)物制備條件見(jiàn)表1。在加入蛋白酶之前，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分散液溫度及pH至表1對(duì)應(yīng)值。單酶酶解時(shí)間為4 h；雙酶酶解過(guò)程中，第一種蛋白酶酶解2 h后滅活，再用第二種蛋白酶酶解2 h。酶解期間滴加0.5 mol/L NaOH溶液維持溶液pH不變。酶解結(jié)束，待混合液冷卻至室溫，加入1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)，離心收集上清液，冷凍干燥得多肽。由上述5種酶酶解所得南瓜籽多肽分別命名為JX、Y、F、JX-Y、JX-F。采用pH-Stat法[10]對(duì)水解度進(jìn)行測(cè)定并按式(1)計(jì)算各多肽產(chǎn)率。

多肽產(chǎn)率=多肽的質(zhì)量/蛋白的質(zhì)量×100%

(1)

1.2.2 多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定

將5種南瓜籽多肽溶解于超純水中。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量不同的多肽在葡聚糖凝膠柱中流出時(shí)間的差異，測(cè)定各多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布。

1.2.3 多肽抗氧化性能測(cè)定

1.2.4 多肽對(duì)細(xì)胞增殖的影響

采用MTT法考察5種南瓜籽多肽在0.2 mg/mL 時(shí)對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)及1.6 mg/mL時(shí)對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCat)的增殖活性。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSF和HaCat細(xì)胞，以20×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔100 μL(空白組除外)，培養(yǎng)箱中孵育24 h后，移除孔中培養(yǎng)液。以DMEM為溶劑分別配制0.2 mg/mL及1.6 mg/mL的樣品溶液，每孔加入100 μL樣品溶液孵育24 h，以100 μL DMEM代替樣品作為對(duì)照組。移除孔中溶液，使用PBS沖洗2次，每孔加入100 μL 0.5 mg/mL MTT溶液，并向不含細(xì)胞的孔中加入100 μL 0.5 mg/mL MTT溶液作為空白組，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h[12]。孵育結(jié)束后每孔中加入100 μL DMSO，充分振蕩5 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定其在490 nm處的吸光值(OD)，按式(2)計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力=(OD樣品-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)×100%

(2)

1.2.5 H2O2誘導(dǎo)皮膚細(xì)胞氧化損傷模型建立

H2O2可以使細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，打破細(xì)胞內(nèi)活性氧動(dòng)態(tài)平衡，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老甚至凋亡。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSF和HaCat細(xì)胞，以20×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔100 μL(空白組除外)，培養(yǎng)箱中孵育24 h后，移除孔中培養(yǎng)液。以DMEM為溶劑分別配制不同濃度的H2O2溶液，每孔加入100 μL H2O2溶液孵育1 h，以100 μL DMEM代替H2O2作為對(duì)照組。移除孔中溶液并使用PBS沖洗2次，每孔加入100 μL DMEM溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h[13-14]。按1.2.4方法測(cè)定吸光值，按式(2)計(jì)算細(xì)胞活力。選擇細(xì)胞活力約70%時(shí)為最佳損傷條件。

1.2.6 多肽對(duì)氧化損傷細(xì)胞的修復(fù)作用

使用1.2.5中建立的HSF、HaCat損傷模型評(píng)價(jià)JX-Y對(duì)氧化損傷細(xì)胞的修復(fù)作用。接種細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中孵育24 h后，移除孔中培養(yǎng)液，向含有HSF、HaCat細(xì)胞的孔中分別加入100 μL 1.4、2.8 mmol/L H2O2溶液，孵育1 h，以100 μL DMEM代替H2O2作為對(duì)照組。移除孔中溶液并使用PBS沖洗2次，每孔加入100 μL 以DMEM為溶劑配制的不同質(zhì)量濃度的JX-Y溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。按1.2.4方法測(cè)定吸光值，按式(2)計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)測(cè)定

使用活性氧檢測(cè)試劑盒測(cè)定HSF內(nèi)活性氧水平。使用1.2.5中建立的損傷模型，加入以DMEM為溶劑配制的0.2 mg/mL的JX-Y溶液，孵育24 h，以100 μL DMEM溶液代替JX-Y溶液作為模型組。移除孔中培養(yǎng)液，胰酶消化、離心收集細(xì)胞。細(xì)胞中加入以DMEM為溶劑配制的10 μmol/L熒光探針溶液，使細(xì)胞濃度達(dá)到20×103個(gè)/mL，孵育30 min。離心并使用PBS沖洗2次，除去未進(jìn)入細(xì)胞的熒光探針。使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm處的熒光強(qiáng)度[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜籽多肽的制備

水解度指蛋白被分解為多肽的程度，通常作為蛋白水解程度的指標(biāo)[17]。南瓜籽蛋白水解結(jié)果如圖1所示。

圖1 南瓜籽蛋白水解結(jié)果

從圖1a可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度逐漸趨于平穩(wěn)，4 h后JX、Y、F、JX-Y、JX-F的水解度分別為25.20%、12.02%、10.11%、27.23%、23.24%，其中JX-Y水解度最高。圖1b顯示，JX-Y產(chǎn)率最高，達(dá)39.20%。由此可見(jiàn)，使用堿性蛋白酶-胰蛋白酶可以得到更多的南瓜籽多肽。

2.2 南瓜籽多肽相對(duì)分子質(zhì)量分布

由于葡聚糖凝膠特殊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，相對(duì)分子質(zhì)量大的多肽先從凝膠柱中流出。根據(jù)多肽出峰情況進(jìn)行峰面積積分，得出不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)多肽含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5種酶解產(chǎn)物不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍的多肽含量

由表2可見(jiàn)，5種酶解反應(yīng)使南瓜籽蛋白鏈被不同程度、不同部位地切割，成功制得南瓜籽多肽，其中相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000 Da的多肽在JX-Y中占比最高，達(dá)92.72%。

2.3 南瓜籽多肽的抗氧化性能

圖2 5種南瓜籽多肽的抗氧化性能

2.4 南瓜籽多肽對(duì)細(xì)胞增殖的影響

HSF、HaCat是人體皮膚細(xì)胞的重要組成部分，其中HSF位于皮膚真皮層，HaCat位于表皮層。南瓜籽多肽對(duì)細(xì)胞增殖的影響如圖3所示。

圖3 南瓜籽多肽對(duì)細(xì)胞增殖的影響

由圖3可見(jiàn)，5種南瓜籽多肽中JX-Y促進(jìn)細(xì)胞增殖性能最優(yōu)，HSF、HaCat細(xì)胞活力分別達(dá)到116.15%、121.02%。

2.5 H2O2作用下HSF、HaCat細(xì)胞活力

H2O2作用下細(xì)胞活力如圖4所示。

圖4 H2O2作用下細(xì)胞活力

由圖4可見(jiàn)，氧化損傷細(xì)胞1 h時(shí)，細(xì)胞活力隨著H2O2濃度增加而降低，其中H2O2濃度分別為1.4、2.8 mmol/L時(shí)，HSF、HaCat細(xì)胞活力為72.21%、72.65%，接近70%。因此，分別以1.4、2.8 mmol/L H2O2作用HSF、HaCat細(xì)胞1 h建立氧化損傷模型。

2.6 南瓜籽多肽對(duì)氧化損傷細(xì)胞的修復(fù)作用

在5種南瓜籽多肽中，由于JX-Y抗氧化性能和促進(jìn)細(xì)胞增殖性能均優(yōu)于其他多肽，因此進(jìn)一步考察JX-Y對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HSF及HaCat氧化損傷修復(fù)作用，結(jié)果如圖5所示。

圖5 JX-Y對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷修復(fù)作用

從圖5可以看出，1.4 mmol/L H2O2作用的HSF細(xì)胞活力僅為72.69%，加入JX-Y孵育24 h后，提高了細(xì)胞活力，當(dāng)JX-Y質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最高，為86.54%。但當(dāng)JX-Y質(zhì)量濃度繼續(xù)提高至0.8 mg/mL時(shí)，細(xì)胞活力低于模型組，說(shuō)明JX-Y濃度過(guò)高并不利于HSF的生長(zhǎng)。

從圖5還可以看出，2.8 mol/L H2O2作用的HaCat細(xì)胞活力為73.65%，加入JX-Y孵育24 h后，同樣提高了細(xì)胞活力，當(dāng)JX-Y質(zhì)量濃度為2.4 mg/mL時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最高,為91.54%。但當(dāng)JX-Y質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時(shí)，細(xì)胞活力低于模型組，這與HSF的表現(xiàn)相似。HaCat和HSF不同的是HSF更易受到H2O2的影響，HaCat需要更高的多肽質(zhì)量濃度提高細(xì)胞活力。

2.7 南瓜籽多肽對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

JX-Y在低質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)HSF細(xì)胞影響較為明顯，因此選擇HSF為代表測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。不同組別細(xì)胞內(nèi)ROS水平如圖6所示。

由圖6可見(jiàn)，HSF中加入1.4 mmol/L H2O2氧化損傷1 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平相比于對(duì)照組明顯增加，達(dá)到163%，0.2 mg/mL JX-Y溶液的加入使細(xì)胞內(nèi)ROS水平降低至124%，表明南瓜籽多肽清除了細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS，緩解了細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

圖6 不同組別細(xì)胞內(nèi)ROS水平

3 結(jié) 論