和 淵 郭雨薇

（中國(guó)人民大學(xué)附屬中學(xué) 北京 100080）

STEM課程側(cè)重于現(xiàn)實(shí)世界的問(wèn)題解決，有科學(xué)探究或工程設(shè)計(jì)過(guò)程，培養(yǎng)學(xué)生運(yùn)用所學(xué)知識(shí)、創(chuàng)造性解決問(wèn)題的能力。本次課程針對(duì)噬菌體療法殺菌譜范圍窄的問(wèn)題，學(xué)生應(yīng)用CRISPR-Cas9設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了尾絲蛋白序列基因改造的噬菌體，從而改變了噬菌體與宿主結(jié)合能力，或可對(duì)臨床治療提供一定的思路和操作路徑。在此過(guò)程中，學(xué)生綜合運(yùn)用了生物學(xué)、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)等學(xué)科知識(shí)解決問(wèn)題，并與同伴合作、溝通，提問(wèn)、論證等環(huán)節(jié)培養(yǎng)了學(xué)生創(chuàng)造性解決問(wèn)題的能力，使之成為適應(yīng)性的問(wèn)題解決者。

1 問(wèn)題的提出

隨著抗生素的不斷使用，細(xì)菌的耐藥性不斷增強(qiáng)。其中，耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌導(dǎo)致的流行性疾病引發(fā)了世界各地的廣泛關(guān)注［1］。鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacterbaumannii）可導(dǎo)致呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染、燒傷后感染、敗血癥、傷口感染等癥狀［2］。近年來(lái)針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的治療難度逐漸增高，目前尚無(wú)合適的抗生素能有效抑制多重耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)。在此背景下，尋找針對(duì)耐藥菌的治療方法已成為了當(dāng)前研究的重中之重。近年來(lái)，一種有前景的治療方法——噬菌體療法逐漸發(fā)展，相比于抗生素，噬菌體療法具有高效性和特異性等優(yōu)勢(shì)［3-4］。但由于噬菌體對(duì)宿主菌的識(shí)別和感染具有高度的特異性，使噬菌體殺菌譜過(guò)窄，難以廣泛投入應(yīng)用。

在STEM課程教學(xué)中，教師向?qū)W生介紹CRISPR-Cas9技術(shù)可進(jìn)行基因編輯，學(xué)生提出“是否可利用CRISPR-Cas9技術(shù)改造噬菌體的特異性以解決鮑曼不動(dòng)桿菌的抗藥性”的問(wèn)題，筆者認(rèn)為這是一個(gè)非常值得探究的問(wèn)題。CRISPR-Cas9技術(shù)是近年來(lái)出現(xiàn)的基因編輯新技術(shù)，而噬菌體展示技術(shù)也獲得了2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，因此，該問(wèn)題的提出非常接近前沿的科學(xué)問(wèn)題。通過(guò)探究性學(xué)習(xí)和基于項(xiàng)目式的學(xué)習(xí)方式，開(kāi)展對(duì)此問(wèn)題的可行性分析和實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)，也非常符合STEM教學(xué)中的“科學(xué)、技術(shù)和工程”結(jié)合的精神，可培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)科核心素養(yǎng)和解決真實(shí)問(wèn)題的能力。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)的確立

根據(jù)已提出的問(wèn)題，確立本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^(guò)對(duì)噬菌體基因組進(jìn)行編輯，改變噬菌體用于特異識(shí)別宿主菌的受體結(jié)合蛋白，從而改變其宿主特異性，拓寬噬菌體的殺菌譜［5-6］。為合理設(shè)計(jì)針對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌具有殺傷能力的噬菌體，并初步評(píng)估其臨床應(yīng)用潛力，學(xué)生需要解決如何設(shè)計(jì)可特異性結(jié)合泛耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌的噬菌體尾絲結(jié)構(gòu)、如何利用大腸桿菌的CRISPR-Cas9系統(tǒng)合成并純化噬菌體、如何篩選合成的噬菌體、如何評(píng)估噬菌體療法的治療效果這4個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)和內(nèi)容如圖1所示，實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)的確定符合STEM教學(xué)科學(xué)探究的要求。

圖1 實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

3 實(shí)驗(yàn)流程

本研究方案的設(shè)計(jì)旨在嘗試應(yīng)用CRISPRCas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)噬菌體基因組中編碼尾絲蛋白序列的基因編輯，通過(guò)對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體改造和篩選，以獲得針對(duì)泛耐藥菌株的噬菌體制劑。CRISPR-Cas9是近年來(lái)迅速發(fā)展的一項(xiàng)對(duì)基因進(jìn)行編輯的技術(shù)，學(xué)生在思考解決問(wèn)題方案時(shí)，查閱了大量資料，確立了嘗試采用這一手段進(jìn)行研究。事實(shí)上，利用此技術(shù)在噬菌體上進(jìn)行操作還鮮有報(bào)道，學(xué)生的嘗試是一次開(kāi)放性的探索，在理解的基礎(chǔ)上運(yùn)用多樣化的學(xué)習(xí)策略深度加工知識(shí)信息，充分體現(xiàn)了STEM探索精神。實(shí)驗(yàn)流程如圖2所示。

圖2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容流程圖

3.1 針對(duì)泛耐藥性鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的噬菌體設(shè)計(jì) 噬菌體的特異性決定于噬菌體尾絲蛋白底座與宿主菌表面脂多糖、蛋白質(zhì)等分子的特異性結(jié)合。噬菌體的尾絲具有可伸縮性，當(dāng)尾絲蛋白底座與宿主或環(huán)境信號(hào)結(jié)合時(shí)，尾絲會(huì)通過(guò)收縮穿透細(xì)菌外膜并注射遺傳物質(zhì)至細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中。不同菌株的鮑曼不動(dòng)桿菌其噬菌體對(duì)應(yīng)的尾絲蛋白結(jié)構(gòu)略有所不同，因此，在設(shè)計(jì)噬菌體時(shí)，首先需要對(duì)基于相對(duì)廣譜的鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體進(jìn)行改造。使用分子動(dòng)力學(xué)模擬（MD simulation）可分析不同突變型噬菌體的結(jié)構(gòu)及不同噬菌體和泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的親和性，通過(guò)模型計(jì)算給出的預(yù)測(cè)結(jié)果，可幫助下一步實(shí)驗(yàn)篩選出特異性結(jié)合泛耐藥菌效果最好的噬菌體結(jié)構(gòu)。

3.2 通過(guò)CRISPR-Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)噬菌體基因組的合成 除設(shè)計(jì)噬菌體外，本研究還需要能實(shí)現(xiàn)對(duì)噬菌體的合成和純化，且合成機(jī)制應(yīng)當(dāng)便捷高效。利用同源重組修復(fù)機(jī)制，可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組上編碼衣殼蛋白底座部分序列的任意替換。本研究需要注意的問(wèn)題是，傳統(tǒng)的Cas9蛋白以NGG為PAM位點(diǎn)，但是鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體基因組中CG堿基對(duì)含量相對(duì)較低，可能存在脫靶效應(yīng)，因此，構(gòu)建供體質(zhì)粒前，需在已經(jīng)驗(yàn)證CRISPR表達(dá)的大腸桿菌中，轉(zhuǎn)入具有不同長(zhǎng)度同源臂的供體質(zhì)粒，以篩選最合適的同源臂長(zhǎng)度（圖3）。圖3繪制了通過(guò)遺傳工程對(duì)噬菌體進(jìn)行改造的具體模式圖。

圖3 利用CRISPR系統(tǒng)在大腸桿菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)噬菌體的合成

3.3 對(duì)合成噬菌體的篩選和純化 在合成噬菌體后，需篩選侵染效率最高的噬菌體用于臨床治療。此過(guò)程可采用斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定特異性噬菌體的有無(wú)，并根據(jù)篩選結(jié)果對(duì)噬菌體進(jìn)行進(jìn)一步純化。

3.4 對(duì)噬菌體侵染效果、臨床治療效果的評(píng)估為評(píng)估合成的噬菌體的治療效果，首先需要測(cè)定噬菌體侵染泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的效率。這一過(guò)程可通過(guò)斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，對(duì)于噬菌體的效價(jià)（pfu／mL）進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)估噬菌體特異于鮑曼不動(dòng)桿菌的侵染效果。此外，還需要應(yīng)用數(shù)學(xué)建模的知識(shí)，驗(yàn)證基因編輯的效率和準(zhǔn)確度，以及噬菌體在小鼠感染模型中的臨床治療效果。

在整個(gè)探究流程中，運(yùn)用了數(shù)學(xué)、遺傳工程學(xué)、噬菌體侵染病理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等一系列的跨學(xué)科知識(shí)。

4 實(shí)驗(yàn)步驟的設(shè)計(jì)

4.1 驗(yàn)證CRISPR系統(tǒng)在大腸桿菌中能否進(jìn)行多位點(diǎn)切割 向大腸桿菌B834感受態(tài)中轉(zhuǎn)入編碼dCas9的質(zhì)粒（Addgene no.48645），表達(dá)sgRNA的質(zhì)粒（Addgene NO.42229）。sgRNA應(yīng)互補(bǔ)于編碼鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體尾絲蛋白序列上下游的一段20 bp左右的DNA序列。dCas9質(zhì)粒上具有綠色熒光蛋白用于檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化是否成功，而表達(dá)sgRNA質(zhì)粒上具有氨芐抗性用于檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染是否成功。挑選轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌菌落培養(yǎng)于1∶1 LB／M9CA培養(yǎng)基上并放置于37℃。向處于指數(shù)增長(zhǎng)期的鮑曼不動(dòng)桿菌Aba46（每毫升含有約2×108個(gè)細(xì)胞），取300μL接種含有鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體基因組的T4噬菌體（m.o.i為1時(shí)）100μL，并于37℃培養(yǎng)15 min（因鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體潛伏期為10 min），離心后取上清獲得編輯后的噬菌體。將分別稀釋為10、102、103體積的感染上清液，與未經(jīng)過(guò)基因編輯的同濃度感染的上清液，涂在鮑曼不動(dòng)桿菌Aba46培養(yǎng)皿上并過(guò)夜培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)感染效率并提取編輯后噬菌體基因組進(jìn)行測(cè)序，計(jì)算公式如下：

4.2 設(shè)計(jì)同源臂長(zhǎng)度梯度尋找最優(yōu)長(zhǎng)度 在已經(jīng)驗(yàn)證CRISPR表達(dá)的大腸桿菌B834中，轉(zhuǎn)入不同供體DNA質(zhì)粒pET28b（含有長(zhǎng)度為500 bp，700 bp，900 bp，1.1 kb，1.3 kb同源序列，轉(zhuǎn)入序列為鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體基因組本身序列，即基因編輯前、后噬菌體基因組序列不應(yīng)出現(xiàn)改變），挑選轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌菌落，培養(yǎng)于1∶1 LB／M9CA培養(yǎng)基上并放置于37℃。向處于指數(shù)增長(zhǎng)期的大腸桿菌B834（每毫升含有約2×108個(gè)細(xì)胞），取300μL接種含有鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體基因組的T4噬菌體（m.o.i為1時(shí)）100μL，并于37℃培養(yǎng)15 min，離心后取上清液。用分別稀釋為10、102、103體積的上清液，與未經(jīng)過(guò)基因編輯的同濃度鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體上清液，以及實(shí)驗(yàn)3.1中編輯后的同濃度鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體上清液，感染泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌Aba33并過(guò)夜培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)感染效率，挑選噬菌斑進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證基因編輯準(zhǔn)確度。

4.3 利用分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體突變型進(jìn)行設(shè)計(jì) 在分子動(dòng)力模擬中，以鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體的底盤結(jié)構(gòu)信息，與泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌Aba46菌株表面特異識(shí)別蛋白作為位置信息輸入，改變底盤結(jié)構(gòu)上親水氨基酸種類，并利用分子動(dòng)力學(xué)，模擬計(jì)算出2個(gè)結(jié)構(gòu)間親和性，計(jì)算方式如下：

這一公式可計(jì)算結(jié)構(gòu)的自由能，并以此側(cè)面表現(xiàn)2個(gè)結(jié)構(gòu)間親和性。選擇親和性超出原本結(jié)構(gòu)中最好的10種突變結(jié)構(gòu)構(gòu)建質(zhì)粒。

4.4 利用CRISPR在大腸桿菌中替換噬菌體基因組中編碼尾絲蛋白序列并進(jìn)行斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 在已經(jīng)驗(yàn)證CRISPR表達(dá)的大腸桿菌B834中，轉(zhuǎn)入不同供體DNA質(zhì)粒pET28b（上含有同源序列以及編碼目的噬菌體編碼尾絲蛋白的DNA序列），挑選轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌菌落，培養(yǎng)于1∶1 LB／M9CA培養(yǎng)基上并放置于37℃。其余方法同3.3，之后統(tǒng)計(jì)感染效率，挑選11種噬菌體侵染獲得的噬菌斑。

4.5 鮑曼不動(dòng)桿菌噬菌體的純化 挑選實(shí)驗(yàn)3.5中形狀規(guī)則、邊緣光滑的單個(gè)噬菌斑，接種于2 mL鮑曼不動(dòng)桿菌Aba46宿主菌液，于37℃以160 r／min振蕩培養(yǎng)4～6 h，4°C，l0 000 r／min離心l0 min。最后得到的上清液，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾除菌。重復(fù)上述過(guò)程3～5次，即得到純化的噬菌體。

4.6 構(gòu)建重癥小鼠感染模型 將泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌Aba46加入少量肉湯培養(yǎng)基中，在36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，再將此菌液涂在斜面營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，于36℃培養(yǎng)16 h后，用滅菌處理過(guò)的生理鹽水沖洗，取沖洗所得液體稀釋建立不同梯度，利用比濁法確定濃度同時(shí)計(jì)數(shù)其中活菌數(shù)量。取0.5 mL不同稀釋濃度的泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌Aba46對(duì)5組小鼠進(jìn)行腹腔注射，觀察小鼠生存情況，記錄小鼠全部死亡的最小劑量為絕對(duì)致死量。以此濃度腹腔注射小鼠建立重癥感染模型。

4.7 編輯后噬菌體臨床治療效果分析 將模型小鼠分為5組，每組10只，每組內(nèi)又隨機(jī)選取5只作為對(duì)照組。向?qū)嶒?yàn)組小鼠中注射相同效價(jià)的噬菌體，而對(duì)于對(duì)照組小鼠注入等濃度等體積的生理鹽水。不同實(shí)驗(yàn)組小鼠所注射的鮑曼不動(dòng)桿菌濃度不一，濃度最低為注入等濃度生理鹽水，最高為注入絕對(duì)致死量濃度鮑曼不動(dòng)桿菌，注入體積均為0.5 mL。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的預(yù)期

5.1 驗(yàn)證CRISPR系統(tǒng)在大腸桿菌中能否進(jìn)行多位點(diǎn)切割 如果CRISPR系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)在大腸桿菌中，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體的多位點(diǎn)切割，經(jīng)過(guò)基因編輯的鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體感染效率，應(yīng)顯著低于對(duì)照組感染效率，因?yàn)槿艋蚓庉嫵晒Γ删w基因組會(huì)在大腸桿菌內(nèi)被切割降解。此處應(yīng)注意，對(duì)照組噬菌體（即原AB1噬菌體）感染效率也會(huì)相對(duì)較低，因AB1噬菌體并不適用于泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株Aba46，故還需提取編輯后的噬菌體基因組進(jìn)行測(cè)序。

5.2 設(shè)計(jì)同源臂長(zhǎng)度梯度尋找最優(yōu)長(zhǎng)度 含有不同同源臂長(zhǎng)度的供體質(zhì)粒的大腸桿菌編輯后的噬菌體感染效率不同，選取基因編輯無(wú)誤差突變，感染效率最高的噬菌體對(duì)應(yīng)同源臂長(zhǎng)度作為最優(yōu)長(zhǎng)度。

5.3 利用CRISPR在大腸桿菌中替換噬菌體基因組中編碼尾絲蛋白序列并進(jìn)行斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 經(jīng)過(guò)基因編輯的鮑曼不動(dòng)桿菌AB1噬菌體對(duì)于泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染效率相對(duì)較高，說(shuō)明對(duì)噬菌體尾絲的修飾擴(kuò)大了原本不適用于泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的AB1噬菌體的殺菌譜。

5.4 編輯后噬菌體臨床治療效果分析 向?qū)嶒?yàn)組小鼠中注射相同效價(jià)的噬菌體、對(duì)照組不注射，由于噬菌體能侵染鮑曼不動(dòng)桿菌，所以各個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的小鼠均不會(huì)患病死亡，而對(duì)照組會(huì)有不同程度的患病現(xiàn)象（其中最高濃度組小鼠死亡）。

本實(shí)驗(yàn)是學(xué)生在STEM課程中的一個(gè)有益嘗試。隨著抗生素發(fā)展的減緩和細(xì)菌耐藥性的增加，噬菌體療法成為一種新的療法，學(xué)生通過(guò)提出問(wèn)題、查閱資料、可行性分析、目標(biāo)確定、內(nèi)容展示和步驟詳解，利用CRISPR-Cas9技術(shù)基因編輯解決噬菌體療法不夠廣譜的問(wèn)題。在這一過(guò)程中，學(xué)生通過(guò)高效地實(shí)現(xiàn)對(duì)噬菌體的設(shè)計(jì)、改造、生產(chǎn)和檢驗(yàn)過(guò)程，自己分析問(wèn)題、討論問(wèn)題、與同伴溝通、提問(wèn)和論證，在解決問(wèn)題的過(guò)程中應(yīng)用了生物學(xué)、數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)等學(xué)科的知識(shí)，發(fā)展了學(xué)生創(chuàng)造性解決問(wèn)題的能力，有效實(shí)現(xiàn)了STEM教學(xué)中科學(xué)探究的教學(xué)目標(biāo)，為培養(yǎng)學(xué)生的學(xué)科思維、學(xué)科能力奠定基礎(chǔ)。