李少華，谷曉杰，安麗，何曉婷，曹揮*

（1.太原學(xué)院，山西太原030001；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

隨著人們對(duì)食品、環(huán)境安全的關(guān)注，農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)及農(nóng)產(chǎn)品安全成為當(dāng)前最重要的熱點(diǎn)問(wèn)題。因缺乏有效的綠色防控方案和綠色安全農(nóng)藥，化學(xué)防治仍是當(dāng)前作物病蟲(chóng)害防治的重要手段，制約了農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的安全健康發(fā)展。從植物中尋找高效安全的新型農(nóng)藥，一直是植保領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

石菖蒲（Acorus gramineus），屬天南星科，別名九節(jié)菖蒲、菖蒲、菖草等［1］，生長(zhǎng)于海拔 20～2 600 m 的地區(qū)，主要分布于亞洲，以根部入藥，其味辛性溫，具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗癌、抗驚厥、抗心律失常、抗病蟲(chóng)害等作用［2］，其化學(xué)成分可分為揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分［3］。揮發(fā)油是石菖蒲的主要有效成分，主要有β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚、甲基異丁香酚欖香素等［4］；非揮發(fā)性成分主要包括生物堿類(lèi)，茲醇類(lèi)，醌和酮類(lèi)，醛和酸類(lèi)，氨基酸類(lèi)及糖類(lèi)等［5］。其中β-細(xì)辛醚的藥理研究揭示，具有抗腫瘤、抗炎，保護(hù)心肌組織、保護(hù)呼吸和消化系統(tǒng)，殺蟲(chóng)滅菌等作用［6～9］，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響方面，具有良好的抗老年癡呆、抗癲癇、抗抑郁作用［10］。

在殺蟲(chóng)抑菌方面，石菖蒲乙醇提取物對(duì)番茄灰霉孢子萌發(fā)的抑制效果顯著［11］，且溫室防效良好。黃衍章等［12］發(fā)現(xiàn)菖蒲烯酮對(duì)玉米象和谷蠢具有很好的熏蒸活性。謝紅英等［13］研究發(fā)現(xiàn)石菖蒲的甲醇提取物對(duì)粘蟲(chóng)具有極強(qiáng)的拒食和生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用，兼具一定觸殺活性。

本試驗(yàn)研究了石菖蒲提取物對(duì)15 種植物病原菌的抑菌活性，旨在為植物病害的安全防治提供新的依據(jù)，同時(shí)為充分利用我國(guó)豐富的植物資源為植物源農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物

供試植物為石菖蒲根，購(gòu)自河北省安國(guó)藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地為江西吉安市泰和縣。

1.1.2 供試菌種

梨黑斑病菌（Alternaria kikuchiana）、蘋(píng)果輪紋病菌（Botryosphaeria）、核桃枯梢病菌（Phomopsis macrospora）、甜瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、蘭花枯萎病菌（Fusarium oxysporium）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、番茄枯萎病病原菌（Phomopsis macrospora）、三七根腐病菌（Cylindrocaipon destructans）、蘋(píng)果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidies）、葡萄根腐病菌（Fusarium oxysporum）、茄子 枯萎病 菌（Fusarium oxysporum）、棗炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioidies）、番茄灰霉病病原菌（Botrytis cinerea）、番茄早疫病病原菌（Alternaria solani）、番茄黑斑病病原菌（Pseudomonas syringae）均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 儀器和試劑

試劑：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，95%乙醇。

儀器：1702-MP8 型電子天平（上海拓衡實(shí)業(yè)有限公司）、SW-CJ-1D 型單人凈化工作臺(tái)（蘇州普愛(ài)德凈化設(shè)備科技有限公司）、100～1000 μL移液槍（濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司）、恒溫培養(yǎng)箱（上海皓莊儀器有限公司）、立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（立德泰勀科學(xué)儀器有限公司）、成像顯微鏡（深圳長(zhǎng)欣自動(dòng)化設(shè)備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 植物粗提物的制備

將石菖蒲根烘干粉碎，過(guò)60 目篩，按提取物干粉和 95% 乙醇=1∶5（m∶v）裝入廣口瓶，浸泡 24 h后，30 ℃超聲波萃取1 h，用循環(huán)水式真空泵抽濾；將抽濾液減壓濃縮至一定濃度，室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性測(cè)定

抑菌活性采用菌絲生長(zhǎng)速率法［14］測(cè)定。

取1 mL 濃度為40 g·L-1石菖蒲乙醇提取物加入 19 mL 的 PDA 培養(yǎng)基中，配制成濃度為 2 g·L-1的加藥培養(yǎng)基，以加入等體積的無(wú)菌水作為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。用直徑為0.7 cm 的打孔器在培養(yǎng)4d 的生長(zhǎng)旺盛的供試菌株上打取菌餅，將菌餅接種在加藥培養(yǎng)基與空白對(duì)照的培養(yǎng)基中，置于28 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，并在96 h 拍照觀察石菖蒲提取物處理不同病菌后菌落的形態(tài)變化。

1.2.3 石菖蒲乙醇提取物對(duì)蘋(píng)果炭疽病的毒力測(cè)定

采用二倍稀釋法將石菖蒲乙醇提取物配制成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 g·L-16 個(gè)濃度梯度，測(cè)定其對(duì)蘋(píng)果炭疽病的抑制作用，并計(jì)算EC50。

1.2.4 石菖蒲乙醇提取物對(duì)菌絲形態(tài)的影響

參照沈曉強(qiáng)等［15］的方法，將石菖蒲提取物配制成濃度為1 g·L-1的含藥培養(yǎng)基，接種振蕩培養(yǎng)（150 r·min-1，28 ℃）96 h 后觀察菌絲形態(tài)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將收集的數(shù)據(jù)利用Excel 2013 和DPS 軟件分別計(jì)算抑菌率及進(jìn)行毒力分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 石菖蒲乙醇提取物對(duì)15 種病原菌的抑菌活性

試驗(yàn)測(cè)定了質(zhì)量濃度為2 g·L-1的石菖蒲乙醇提取物對(duì)梨黑斑病菌、三七根腐病菌、和蘋(píng)果炭疽病菌等15 種病原菌的抑菌活性，在96 h 石菖蒲乙醇提取物對(duì)15 種病原菌的菌絲抑制率達(dá)到80%的有5 種。其中以對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌的抑制效果最好，可達(dá)到94%；對(duì)核桃枯梢病菌次之，抑制率為92%，抑菌效果穩(wěn)定（表1，圖1）。

2.2 石菖蒲乙醇提取物對(duì)蘋(píng)果炭疽病原菌的毒力作用

石菖蒲對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌的抑制效果隨著石菖蒲濃度的減少而降低（表2）。選取96 h 的抑菌數(shù)據(jù)運(yùn)用DPS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析可得，毒力方程為y=6.054 3+1.934 7x。 其 中 EC50為 0.29 g·L-1，相關(guān)系數(shù)是0.980 6。

2.3 石菖蒲提取物對(duì)菌絲形態(tài)的影響

將培養(yǎng)好的菌絲在成像顯微鏡下觀察（圖2）。無(wú)處理的蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)正常，菌絲體飽滿，無(wú)色，無(wú)隔膜，且分枝較長(zhǎng)；而石菖蒲處理過(guò)的菌絲明顯受到了抑制，生長(zhǎng)緩慢，分叉增多，并且分枝很短，菌絲生長(zhǎng)雜亂。

3 討論與結(jié)論

從植物中尋找綠色安全的植物源農(nóng)藥一直是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，石菖蒲為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，本研究發(fā)現(xiàn)其提取物對(duì)15 種病原菌的均有不同程度的抑制作用，其中，對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌的效果極為顯著，96 h 抑制率達(dá)到94%，抑制中濃度 EC50值為0.29g·L-1。此外，從用提取物處理后菌絲的形態(tài)顯微觀察，也可以明顯地看到石菖蒲提取物處理過(guò)的蘋(píng)果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)緩慢，分叉增多，分枝變短，這也進(jìn)一步證明了石菖蒲提取物的抑菌效果。

表1 石菖蒲乙醇提取物對(duì)15 種病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table1 Inhibitory effect of ethanol extract of A.tatarinowii against 15 species of pathogens

圖1 15 種病原菌在96 h 的菌絲生長(zhǎng)圖Fig.1 Hyphal growth diagram of 15 pathogens at 96 h

從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，石菖蒲提取物中含有廣譜性的抑菌活性成分，Lee 等研究表明，石菖蒲中對(duì)白粉菌等病原起抑制作用的活性成分主要是α-細(xì)辛醚和細(xì)辛醛［16］，但白粉菌為子囊菌亞門(mén)的真菌，而本試驗(yàn)所用真菌基本為半知菌亞門(mén)真菌，是否為同一成分在起作用，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

表2 不同濃度石菖蒲對(duì)蘋(píng)果炭疽病菌菌絲的抑制作用Table2 Inhibitory effect of ethanol extract of A.tatarinowii against growth of C.Gloeosporioidies

圖2 石菖蒲提取物對(duì)菌絲形態(tài)的影響（40×）Fig.2 Effect of A.tatarinowii extract on mycelium morphology（40×）

殺菌劑對(duì)細(xì)胞壁的作用大多是響細(xì)胞壁的形成，達(dá)抑制或殺滅真菌的目的［17］。因此大多藥物處理真菌菌絲后，菌絲會(huì)發(fā)生破裂，原生質(zhì)滲漏，如從心黎等曾報(bào)道過(guò)YX 擬青霉菌發(fā)酵濃縮物引起馬鈴薯晚疫病菌菌絲扭曲、破裂、分枝增多、菌絲膨大［17］。而本研究中，石菖蒲提取物處理蘋(píng)果炭疽病菌菌絲后，并無(wú)明顯的菌絲破裂，只是表現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)受抑和菌絲變短、分枝增多。真菌菌絲絲狀生長(zhǎng)是高度專一性的頂端生長(zhǎng)，其中幾丁質(zhì)扮演了重要角色。幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分，在真菌菌絲體頂端細(xì)胞中含有其合成酶體，它會(huì)源源不斷的運(yùn)送幾丁質(zhì)合成酶到菌絲尖端細(xì)胞壁表面，使該處不斷合成幾丁質(zhì)微纖維，從而保證菌絲不斷向前延伸［18］。本研究中菌絲的生長(zhǎng)受阻，不能向前延伸，分枝增多，可能是抑制了幾丁質(zhì)合成酶的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞壁上纖維原的結(jié)構(gòu)發(fā)生變形所致，相關(guān)結(jié)果需進(jìn)一步研究。

與化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥來(lái)源于自然，具有對(duì)生態(tài)環(huán)境友好、無(wú)污染、不易產(chǎn)生抗藥性、且生產(chǎn)原料廣泛等特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。本研究結(jié)果證明了石菖蒲提取物有很好的室內(nèi)抑菌活性，有待進(jìn)一步田間試驗(yàn)和農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)。