孫兆帥，楊 野，田夢(mèng)媛，代春艷，石 玥，汪 瑞，官會(huì)林*

(1.云南師范大學(xué)，云南省農(nóng)村能源工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

【研究意義】三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen]是五加科人參屬植物，主要種植于云南和廣西[1]，三七的干燥根和根莖含多種豐富的化學(xué)成分，如皂苷、揮發(fā)油、三七素、氨基酸、甾醇類等，其中皂苷是最主要藥效成分，目前已從其不同部位分離出60多種單體皂苷[2]。三七對(duì)心、腦血管疾病有較好的療效[3]，在國(guó)內(nèi)外擁有極高的聲譽(yù)，是中國(guó)出口的大宗藥材之一，近年來(lái)其出口量呈快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)[4]。然而，重金屬超標(biāo)現(xiàn)象在三七藥材中偶有發(fā)生，讓消費(fèi)者對(duì)三七的安全性產(chǎn)生了質(zhì)疑[5]。有研究表明，根表面粘土中的重金屬是三七重金屬的主要來(lái)源[6]。因此，洗凈三七根表泥土，就能極大限度地降低三七中重金屬含量?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】三七傳統(tǒng)的加工方式為將鮮三七根表泥土抖落，分成不同部位曬干，再用銼刀把表面泥土打磨干凈。該方式較為費(fèi)力，且銼刀附著的泥土雜物容易在打磨過(guò)程中再次進(jìn)入三七中，從而存在重金屬超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)[7]。趙剛等[9]超聲提取蔬菜中的重金屬；曾清如等[10]采用不同濃度酸去除煙草、牧草等植物中的重金屬。隨著人們對(duì)重金屬安全意識(shí)的增加，有人使用清水浸泡和流水清洗來(lái)清除三七根表泥土，這2種方法可有效清洗三七，但容易使三七中皂苷類成分流失[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在其他藥材或其他農(nóng)產(chǎn)品中，發(fā)現(xiàn)超聲波清洗樣品，調(diào)整清洗溶液pH值、螯合劑濃度等，可以有效清除重金屬。然而，這些清洗方式是否適用于三七清洗仍未知?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以打磨處理三七主根為對(duì)照組，采用不同超聲時(shí)間、不同pH清洗液以及不同濃度乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)清洗三七，測(cè)定其鎘(Cd)、砷(As)、銅(Cu)、鉛(Pb)含量以及各皂苷含量，探索減少三七重金屬含量最大限度，最低限度減少皂苷損失的清洗條件，為三七的清洗方式提供參考，以促進(jìn)三七藥材的出口。

1 材料與方法

1.1 供試材料

三七主根樣品于2017年11月購(gòu)自云南文山三七市場(chǎng)。

1.2 測(cè)試儀器和標(biāo)樣

高效液相色譜儀(HPLC-1260 infinity ，Agilent，美國(guó))，原子吸收光譜儀(Agilent 240 Duo AAS Agilent，美國(guó))，原子熒光光譜儀(AFS-F69B5，湖北匯瑞通光電科技有限公司)。Pb、Cd、Cu、As標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL，國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心鋼鐵研究總院)，對(duì)照品R1(CAS：80418-24-2，純度： HPLC≥98 %)、Rg1(CAS：22427-39-0，純度：HPLC≥98 %)、 Re(CAS：52286-59-6，純度：HPLC≥98 %)、Rb1(CAS：41753-43-9，純度：HPLC≥98 %)和Rd(CAS：52705-93-8，純度：HPLC≥98 %)均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，乙腈為色譜純，其他試劑均為優(yōu)級(jí)純。

1.3 處理方法

1.3.1 不同時(shí)間超聲清洗三七主根 將7組鮮三七主根依次超聲清洗0、1、2、4、6、8、10 min；超聲完成后，依次將每組三七用玻璃棒攪拌10、9、8、6、4、2、0 min，再流水沖洗3 min，干燥后打粉，每組處理重復(fù)3次。

1.3.2 不同pH值水溶液清洗三七主根 分別使用pH值為2.00、4.00、6.00、7.00、8.00、10.00、12.00的水溶液清洗鮮三七主根6 min，干燥后打粉，每組處理重復(fù)3次。

1.3.3 不同濃度EDTA-2Na溶液清洗三七主根 分別使用濃度為0、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mol/L的EDTA-2Na溶液清洗鮮三七主根6 min，干燥后打粉，每組處理重復(fù)3次。

1.3.4 打磨處理三七主根 以打磨處理三七主根為對(duì)照，即選取質(zhì)量合適的三七主根，使用銼刀進(jìn)行打磨，搓掉表皮及泥土雜物后干燥打粉，重復(fù)3次。

1.4 重金屬含量測(cè)定

根據(jù)GB 5009.12-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛的測(cè)定》、GB 5009.15-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鎘的測(cè)定》、GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》和GB 5009.13-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中銅的測(cè)定》的測(cè)定方法，對(duì)三七樣品中Pb、Cd、As和Cu含量進(jìn)行測(cè)定。Pb、Cd和Cu含量測(cè)定采用原子吸收光譜儀進(jìn)行測(cè)定，As含量測(cè)定采用原子熒光光譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.5 藥效成分的測(cè)定

1.5.1 供試品溶液的制備 精密稱取三七粉0.2 g，置于10 mL離心管中，加入甲醇5 mL，稱定質(zhì)量，搖勻，超聲30 min，繼續(xù)加甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，于3000 r/min離心5 min，再由0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)可以得到供試品溶液，待測(cè)。

1.5.2 色譜條件 HPLC條件為Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色譜柱(美國(guó)Thermo Scientific公司，250 mm×4.6 mm，5μm)。流動(dòng)相：水(A)-乙睛(B)。線性梯度洗脫：(0 ～20 min，20 %B；20～45 min，20 %～46 %B；45 ～55 min： 46 % ～55 %B；55～60 min：55 %B)。檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm。流速：1.0 mL/min。進(jìn)樣量：10 μl。

1.5.3 方法學(xué)考察 精密量取對(duì)照品溶液 3、5、8、10、13、15 μl進(jìn)行測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得三七皂苷 R1和人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd回歸方程分別為y=3107088x+39382(R2=0.9996)，y=3710214x+59857(R2=0.9994)，y=2786843x+47939(R2=0.9994)，y=2344051x+ 51125(R2=0.9992)，y=2728930x+50515(R2=0.9992)。日內(nèi)和日間精密度RSD均<5.0 %，供試樣品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，樣品加樣回收率97 %～102 %,表明建立的含量測(cè)定方法可靠。

表1 不同超聲時(shí)間清洗三七主根對(duì)其重金屬含量及藥效成分影響

注：同列后不同小寫字母表示差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters after the same column indicated significant difference (P<0.05), the same as below.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超聲時(shí)間清洗三七主根對(duì)其重金屬含量和藥效成分影響

由表1顯示，對(duì)照As、Cu、Pb含量均低于安全限量標(biāo)準(zhǔn)，Cd含量超標(biāo)。不同超聲時(shí)間清洗三七主根As、Cu、Cd、Pb含量都低于安全限量標(biāo)準(zhǔn)。與對(duì)照相比，超聲0、1 min條件下Cu含量分別為(4.26±0.06)、(4.11±0.09)mg/kg，顯著高于對(duì)照8.3 %、4.6 %；超聲0、1、2 min條件下Pb含量分別為(4.19±0.14)、(3.85±0.28)、(3.55±0.07)mg/kg，顯著高于對(duì)照37.4 %、26.2 %、16.2 %；其余超聲條件下As、Cu、Cd、Pb含量都顯著低于對(duì)照。隨超聲清洗時(shí)間增加，各超聲條件下重金屬的平均去除率呈上升趨勢(shì)，但在超聲時(shí)間大于6 min后上升趨勢(shì)不顯著，在超聲10 min條件下達(dá)到最高，為62.8±1.51 %。超聲8、10 min時(shí)，總皂苷含量分別為(6.61±0.13)%、(6.49±0.20)%，低于對(duì)照0.2 %和2.2 %，無(wú)顯著性差異；其他超聲條件下總皂苷含量均顯著高于對(duì)照?？傇碥論p失率表現(xiàn)為隨超聲時(shí)間增加不斷升高，超聲0 min時(shí)總皂苷損失率最低，為-21.5 %±1.45 %。

表2 不同pH值水溶液清洗三七主根對(duì)其重金屬含量及藥效成分影響

表3 不同濃度EDTA-2Na溶液清洗三七主根對(duì)其重金屬含量及藥效成分影響

2.2 不同pH值水溶液清洗三七主根對(duì)其重金屬含量和藥效成分影響

由表2顯示，不同pH值條件下清洗三七主根As、Cu、Pb含量都低于安全限量標(biāo)準(zhǔn)，Cd含量在pH值為8、10、12時(shí)超過(guò)安全限量標(biāo)準(zhǔn)，分別為(0.41±0.04)、(0.45±0.02)、(0.49±0.03)mg/kg。與對(duì)照相比，所有處理As、Cu、Cd、Pb含量都顯著低于對(duì)照。隨著清洗液pH的升高，各處理重金屬的平均去除率呈下降趨勢(shì)，pH值為2～6和8～12時(shí)，平均去除率下降趨勢(shì)不顯著，在清洗液pH值為4時(shí)平均去除率最高，為57.2 %±0.79 %。清洗液pH值為10、12時(shí)，總皂苷含量分別為6.59 %±0.16 %、6.53 %±0.03 %，低于對(duì)照0.6 %、1.6 %，無(wú)顯著性差異，其他處理下總皂苷含量均高于對(duì)照，除pH值為8的處理皆差異顯著?？傇碥論p失率隨pH值增加先降低再升高，在pH值6時(shí)最低，為-23.7 %±2.39 %。

2.3 不同濃度EDTA-2Na溶液清洗三七主根對(duì)其重金屬含量和藥效成分影響

表3顯示，不同濃度EDTA-2Na溶液清洗三七主根As、Cu、Pb含量均低于安全限量標(biāo)準(zhǔn)，在EDTA-2Na濃度為0、0.005、0.01 mol/L條件下，Cd的含量超過(guò)安全限量標(biāo)準(zhǔn)，分別為(0.63±0.02)、(0.54±0.02)、(0.32±0.02)mg/kg。與對(duì)照相比，EDTA-2Na濃度為0 mol/L時(shí)，As、Cu、Pb含量分別為(0.63±0.02)、(3.95±0.07)、(3.09±0.06)mg/kg，高于對(duì)照4.1 %、0.4 %、1.2 %，均無(wú)顯著性差異。EDTA-2Na濃度為0.005 mol/L時(shí)，Cu含量為(3.95±0.06)mg/kg，高于對(duì)照0.4 %，差異不顯著。EDTA-2Na濃度為0.01、0.02 mol/L時(shí)，Cu含量分別為(3.86±0.03)、(3.85±0.03)mg/kg，低于對(duì)照1.8 %、2.1 %，均無(wú)顯著性差異。其他處理下As、Cd、Cu、Pb含量均低于對(duì)照，差異顯著。隨著EDTA-2Na濃度升高，重金屬的平均去除率呈上升趨勢(shì)，但EDTA-2Na濃度大于0.05 mol/L后上升趨勢(shì)不顯著，濃度達(dá)到0.2 mol/L時(shí)，重金屬去除率最高，為54.4 %±3.16 %。該處理下總皂苷含量均顯著高于對(duì)照。隨著EDTA-2Na濃度變化，總皂苷損失率并沒(méi)有顯著變化趨勢(shì)。

3 討 論

三七傳統(tǒng)干燥方式是將新鮮采挖的三七在曬場(chǎng)上攤開(kāi)、修剪(將剪口、主根和筋條分開(kāi))直至干燥，或?qū)⑿藜艉蟮募艨诤椭鞲诳痉恐懈稍?。?duì)于干燥后的三七，通常采用打磨的方式去除表面附著的泥土。因而，三七產(chǎn)地加工中鮮見(jiàn)清洗操作環(huán)節(jié)，僅少數(shù)飲片廠可見(jiàn)。研究發(fā)現(xiàn)三七根表浮土是藥材中重金屬主要來(lái)源[6]，故通過(guò)清洗的方式去除根表浮土是有效控制重金屬含量的重要途徑之一。曾憲彩等[7]曾研究比較過(guò)流水與浸泡清洗對(duì)三七剪口重金屬清除和皂苷損失的影響。但三七清洗過(guò)程操作仍缺乏科學(xué)數(shù)據(jù)支撐。

通過(guò)對(duì)超聲波清洗三七主根實(shí)驗(yàn)考察，發(fā)現(xiàn)隨超聲波作用時(shí)間增加，清洗后三七主根As、Cu、Cd、Pb的平均去除率和總皂苷損失率均呈上升趨勢(shì)，但在6 min后4種重金屬元素去除率趨于穩(wěn)定。即一定范圍內(nèi)延長(zhǎng)超聲清洗時(shí)間可降低三七主根重金屬含量，同時(shí)亦造成了皂苷的損失。邵玉芳等[11]研究表明超聲波對(duì)蔬菜中重金屬的提取率在一定時(shí)長(zhǎng)內(nèi)隨超聲時(shí)間增加，亦驗(yàn)證了本研究結(jié)果。這是超聲波在液體介質(zhì)傳播中產(chǎn)生空化效應(yīng)，對(duì)清洗物表面進(jìn)行撞擊、剝離，從而隨超聲時(shí)間增加不斷加強(qiáng)對(duì)重金屬的去除效果直至最大值[12-14]。三七皂苷具有較好的水溶性，超聲作用會(huì)加劇皂苷水溶現(xiàn)象，從而增加皂苷的損失率。馬妮等[15]研究也表明三七皂苷的提取率隨超聲時(shí)間的增加而增加。因而，在保障三七藥材重金屬含量符合標(biāo)準(zhǔn)的條件下應(yīng)盡量降低超聲清洗時(shí)間以減少皂苷損失。

Jing Yuan[16]等研究發(fā)現(xiàn)用0 %、0.1 %、0.25 %、0.5 %、1 % 5種濃度鹽酸萃取油菜籽中重金屬，重金屬萃取效率隨鹽酸濃度升高而增加。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水溶液pH值不超過(guò)7時(shí)，清洗后三七重金屬含量均未超標(biāo)，且隨水溶液pH值增加，重金屬的平均去除率呈下降趨勢(shì)。這種現(xiàn)象是由于低pH環(huán)境有利于重金屬的遷移及釋放，高pH環(huán)境會(huì)提高重金屬的穩(wěn)定性[17-18]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在水溶液pH值6時(shí)，三七主根總皂苷損失率最小，即皂苷損失在弱酸酸環(huán)境中較少。這是由于皂苷水溶液呈弱酸性，在堿性條件下，皂苷上的OH-以陰離子-O-形式存在，無(wú)法與離子液體的陰離子產(chǎn)生氫鍵；而強(qiáng)酸條件下，糖鍵易發(fā)生斷裂，發(fā)生水解[19]。因此，綜合考慮重金屬的去除和皂苷的保留，以使用弱酸性清洗液清洗三七為宜。

螯合劑可使重金屬離子生成性質(zhì)完全不同的螯合物，主要應(yīng)用于重金屬元素的萃取[20]。如文陳兆慧等[21]采用吡咯烷二硫代氨基甲酸銨-二乙基二硫代氨基甲鈉-甲基異丁基甲酮(APDC-DDTC-MIBK)螯合萃取茜草，以準(zhǔn)確測(cè)定茜草中Pb的含量。雷鳴等[22]研究也表明在EDTA濃度為0～0.02 mol/L時(shí)，對(duì)土壤重金屬萃取率急速上升，而在0.05 mol/L處，萃取效率則基本達(dá)到平衡。使用不同濃度的EDTA-2Na清洗三七主根，隨EDTA-2Na濃度升高，重金屬的平均去除率呈上升趨勢(shì)，在EDTA-2Na濃度大于0.05 mol/L后趨于平緩，而總皂苷損失率則無(wú)明顯變化趨勢(shì)。即增加EDTA-2Na濃度可以在一定范圍內(nèi)減少三七的重金屬含量，且對(duì)皂苷含量無(wú)明顯影響。說(shuō)明EDTA對(duì)重金屬的去除效果隨濃度增加有最大值，需要選取合適的濃度進(jìn)行清洗來(lái)節(jié)約成本，清洗三七主根的EDTA-2Na濃度以0.05 mol/L為宜。

4 結(jié) 論

確保三七藥材重金屬含量在允許標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定之下應(yīng)盡量降低超聲清洗時(shí)間以減少皂苷損失；使用弱酸性水清洗三七可以保證藥材重金屬不超標(biāo)并能最大限度保留皂苷成分；使用濃度0.05 mol/L EDTA-2Na溶液清洗三七主根能保證重金屬清洗效果并節(jié)約成本。