朱秀紅，楊金橘，溫道遠(yuǎn)，韓曉雪，茹廣欣

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450000)

【研究意義】中華紅葉楊是首個(gè)由黑楊2025雄株芽變產(chǎn)生的彩葉楊樹品種，推向市場以來彩葉楊樹品種的豐富度與觀賞度不斷提高，以其色彩的繽紛斑斕，極強(qiáng)的適應(yīng)能力以及較快的生長周期廣受喜愛，而花色素苷作為彩葉植物成色的關(guān)鍵因素，研究不同品種彩葉楊樹花色苷合成機(jī)制及其在不同環(huán)境脅迫下對葉片保護(hù)作用的調(diào)控機(jī)理，對促進(jìn)我國進(jìn)一步豐富以花色素苷呈色為基礎(chǔ)的彩葉樹品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】花色素苷不止可以為植物提供豐富多彩的顏色，已有研究還證明作為多酚類物質(zhì)的花色素苷能夠以其特殊結(jié)構(gòu)減弱光照脅迫引起的過量ROS產(chǎn)生，對葉片起到一定的光保護(hù)作用[1-2]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過研究光照脅迫期間及恢復(fù)后5個(gè)彩葉楊樹品種的花色素苷含量、葉綠素含量、類胡蘿卜素含量、葉黃素循環(huán)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)及相關(guān)酶活性和非酶抗氧化劑活性等指標(biāo)的差異，以探究葉色變化對于植物葉片光能的吸收與利用造成的影響，證明高光脅迫引起的花色素苷含量與積累與相關(guān)抗氧化酶活性，葉內(nèi)ROS以及非酶抗氧化劑活性(DPPH自由基清除能力)的相互關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問題】深入研究過剩光能誘導(dǎo)花色素苷的合成機(jī)制，以期為彩葉楊樹的廣泛栽培和應(yīng)用提供進(jìn)一步理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)計(jì)

在新密試驗(yàn)田中，選取長勢良好的全紅楊、中紅楊、金紅楊、紅霞楊與翡翠楊的一年生苗木同側(cè)枝剪下帶回進(jìn)行扦插培養(yǎng)(每個(gè)品種每株重復(fù)扦插3盆)，幼苗生長至25 cm(包括頂芽，主枝生3～4片葉 )放置于溫室內(nèi)，溫度為15～25 ℃，每天遮光10 h繼續(xù)培養(yǎng)，確?？扇⌒迈r樣品進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。

試驗(yàn)以常溫常光(CK)為對照(溫度為 25/15 ℃，光照強(qiáng)度為 200 μmol·m-2·s-1)，用高光脅迫(溫度為 25/15 ℃，光照強(qiáng)度為500 μmol·m-2·s-1)連續(xù)處理3 d，每天進(jìn)行取樣測定，3 d后將受脅迫后樣本材料放置于智能溫室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)遮陰處理恢復(fù)光照，在恢復(fù)的2 d進(jìn)行取樣測定。

1.2 試驗(yàn)方法

采用張憲政提出的丙酮乙醇萃取法[3]進(jìn)行葉綠素與類胡蘿卜素含量測定。采用何奕昆[4]，于曉南[5]等的鹽酸甲醇分光光度計(jì)方法，進(jìn)行花色素苷的測定。分別取5種彩葉楊樹頂芽向下第2片葉進(jìn)行葉黃素各組分含量的測定。采用THAYER等[6]的方法用高效液相色譜法測定。葉黃素循環(huán)的脫環(huán)氧化程度用(A+Z)/(V+A+Z)表示。用便攜式脈沖調(diào)制熒光儀FMS22測定5種彩葉楊樹葉片的初始葉綠素?zé)晒?Fo)及暗適應(yīng)下的最大葉綠素?zé)晒?Fm)，用Fv/Fm表示PSII的最大光化學(xué)效率值，其中Fv由(Fm-Fo)計(jì)算所得[7]。用過氧化氫紫外分光光度法[8]測定過氧化氫酶(CAT)的活性；用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶(POD)活性[8]；用 NBT(氮藍(lán)四唑)光化學(xué)還原法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用趙世杰等改進(jìn)紫外吸收法測定抗壞血酸還原酶(APX)活性[9]；采用De Gara L 等提出的磷酸緩沖法進(jìn)行DHAR活性測定[10]。H2O2含量采用劉俊等(2000)的離心標(biāo)準(zhǔn)曲線方法[11]。超氧離子產(chǎn)生速率采用王愛國等的方法[12]。DPPH測定采用張宏梅等改進(jìn)的紫外分光光度法[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Origin9.0與Excel2016軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，并用單因素方差分析來檢驗(yàn)樣本間的差異顯著性(置信區(qū)間為95 %)。本文中的折線圖以及柱狀圖均為平均值，標(biāo)準(zhǔn)差為誤差線。

2 結(jié)果與分析

2.1 Fv/Fm和ROS在高光脅迫下的變化

在脅迫開始的第1天，5個(gè)彩葉楊樹品種的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)差異并不顯著，在0.65～0.75范圍內(nèi)(圖1)。隨著高光脅迫處理的時(shí)間(天數(shù))增長，5個(gè)品種的Fv/Fm均開始下降，即在葉片內(nèi)都發(fā)生了光抑制現(xiàn)象。且根據(jù)圖1可知，翡翠楊(綠葉品種)的Fv/Fm值下降最快，全紅楊的Fv/Fm值變化幅度最小，中紅楊、金紅楊與紅霞楊的下降幅度介于兩者之間。在脅迫開始的第3天，全紅楊的Fv/Fm值最高，是翡翠楊的1.63倍。進(jìn)行光照恢復(fù)后，5個(gè)品種的Fv/Fm逐漸上升，光照恢復(fù)第1天，全紅楊的最大光化學(xué)效率已恢復(fù)至脅迫初始水平，其余4個(gè)品種均上升至略低于初始水平。光照恢復(fù)后的第2天，全紅楊和中紅楊的Fv/Fm值上升到略高于原始水平，翡翠楊的Fv/Fm值恢復(fù)到脅迫初始值的85 %，金紅楊和紅霞楊恢復(fù)至與初始水平相當(dāng)。表明5個(gè)品種中，全紅楊對高光脅迫有較強(qiáng)的抵御作用，能更好的對光照脅迫做出應(yīng)答。而翡翠楊的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)隨光照強(qiáng)度變化顯著，在高光脅迫時(shí)葉片內(nèi)遭受了更強(qiáng)烈的光系統(tǒng)破壞。

圖1 高光脅迫下5個(gè)彩葉楊樹品種的最大光化學(xué)效率變化Fig.1 Changes in Fv/Fm in leaves of five colorful poplar varieties in response to high-light stress

圖2 高光脅迫下5個(gè)彩葉楊樹品種的H2O2含量(A)和產(chǎn)生速率(B)變化Fig.2 Changes in H2O2 content and production rate in leaves of five colorful poplar varieties in response to high-light stress

2.2 色素含量在高光脅迫下的變化

表1 高光脅迫下5個(gè)品種的彩葉楊樹的花色素苷、葉綠素及類胡蘿卜素含量變化

續(xù)表1 Continued table 1

色素含量Pigment content脅迫時(shí)間Stress time全紅楊Populus ×euramericana ‘quanhong’中紅楊Populus ×euramericana ‘zhonghong’金紅楊Populus ×euramericana ‘jinhong’紅霞楊Populus ×euramericana ‘hongxia’翡翠楊Populus ×euramericana ‘feicui’30.743±0.0903b0.424±0.1377c0.424±0.0691c0.586±0.0495bc1.374±0.0747a40.657±0.0554c0.341±0.0563b0.406±0.0852a0.341±0.1202c1.012±0.0694b50.723±0.0406a0.328±0.0448bc0.433±0.1017b0.272±0.1039c0.443±0.0382bCK3.207±0.0877a2.761±0.1353b2.529±0.1153 b2.686±0.1518b2.167±0.1181 c葉綠素含量(mg/g)Chlorophyll content13.004±0.0266a2.524±0.0548bc2.402±0.0798c2.579±0.0803b2.405±0.1013c22.757±0.1633a2.286±0.0694b2.257±0.0511b2.401±0.0849a2.689±0.1545a32.467±0.1191b2.049±0.0590c2.121±0.0799c2.337±0.1026b2.972±0.1474a42.414±0.1064a1.957±0.0710b2.004±0.0785b2.002±0.0972c2.514±0.1167b52.401±0.1149a1.935±0.0502b1.973±0.0894b1.907±0.0763b1.848±0.1339bCK0.712±0.0180a0.663±0.0502ab0.595±0.0407c0.612±0.0271bc0.501±0.0219d類胡蘿卜素含量(mg/g)Carotenoid content10.792±0.0376a0.707±0.0132b0.622±0.0131c0.649±0.0108c0.556±0.0554d20.813±0.0164a0.725±0.0066b0.701±0.0101b0.727±0.0098b0.611±0.0816c30.845±0.0286ab0.796±0.0115ab0.735±0.0076c0.784±0.0061bc0.665±0.0584d40.701±0.0197c0.671±0.0113ab0.554±0.0104c0.635±0.0079b0.581±0.0562c50.619±0.0157a0.589±0.0106ab0.546±0.0085b0.565±0.0082ab0.477±0.0699c

在對照組中，全紅楊的花色素苷含量是翡翠楊的11.72倍(表1)，進(jìn)行光照脅迫后，5個(gè)品種的花色素苷含量均顯著增加，但翡翠楊的花色素苷含量變化幅度的相較于其余4個(gè)品種小，脅迫后的第3天，全紅楊的花色素苷含量增加至翡翠楊的26.21倍。恢復(fù)2 d后，翡翠楊的花色素苷含量降至與對照水平相當(dāng)，中紅楊的花色素苷含量下降至對照水平的4.30倍，金紅楊與紅霞楊恢復(fù)后下降至對照水平的3倍左右，全紅楊維持了脅迫誘導(dǎo)后積累的大部分花色素苷。

5個(gè)品種的葉綠素a與葉綠素b含量在對照組中差異不顯著，進(jìn)行脅迫的第1天，全紅楊葉綠素a含量是翡翠楊的1.3倍，中紅楊，金紅楊與紅霞楊的葉綠素a含量維持在1.82～1.94 mg/g范圍內(nèi)，差異并不顯著。進(jìn)行光照脅迫后，5個(gè)品種的葉綠素a含量均呈不明顯的下降趨勢。進(jìn)行恢復(fù)的第2天，翡翠楊的葉綠素a含量下降至1.40 mg/g，其余4個(gè)品種均維持在1.60 mg/g左右。全紅楊，中紅楊，金紅楊與紅霞楊的葉綠素b含量在脅迫后同樣呈不顯著的下降趨勢，而值得注意的是翡翠楊的葉綠素b含量在高光脅迫過程中卻出現(xiàn)緩慢上升，在脅迫的第3天，葉綠素b含量上升至對照水平的2.65倍；恢復(fù)光照后，翡翠楊的葉綠素b含量開始下降，恢復(fù)的第2天下降至對照的85.50 %。葉綠素含量與組成成分的比值是衡量植物光捕獲能力的標(biāo)準(zhǔn)之一，雖然5個(gè)彩葉楊樹品種的花色素苷含量差異顯著，但光捕獲能力在遭受高光脅迫及恢復(fù)后并未出現(xiàn)顯著差異。

圖3 高光脅迫下5個(gè)彩葉楊樹品種的葉黃素循環(huán)庫(C)和脫環(huán)氧化程度(D)Fig.2 Changes in xanthophyll pool size(V+A+Z) and de-epoxidation state[(A+Z)/(V+A+Z)]in leaves of five colorful poplar varieties in response to high-light stress

5個(gè)品種的類胡蘿卜素含量在光照恢復(fù)后與對照水平基本一致，但高光脅迫期間使5個(gè)品種的類胡蘿卜素出現(xiàn)了不同程度的下降，全紅楊在脅迫后與恢復(fù)后都具有較高的類胡蘿卜素含量。

2.3 葉黃素變化

葉黃素循環(huán)可以表現(xiàn)植物的熱耗散效率，對熱能的耗散使植物具有一定的光保護(hù)作用。從圖3可以看出，高光脅迫對全紅楊的葉黃素庫容量(V+A+Z)沒有顯著影響(C)，其余4個(gè)品種在光照脅迫下呈上升趨勢，其中翡翠楊的葉黃素庫容量(V+A+Z)上升幅度最大。光照恢復(fù)后5個(gè)品種的葉黃素庫容量(V+A+Z)均下降至對照水平。從圖3(D)可以知道，高光脅迫對5個(gè)品種的葉黃素脫環(huán)氧化程度(A+Z)/(V+A+Z)影響較為顯著，進(jìn)行脅迫3 d后，翡翠楊的(A+Z)/(V+A+Z)上升至對照的1.67倍，全紅楊和中紅楊的(A+Z)/(V+A+Z)的變化幅度略小，增長1.45倍左右，金紅楊和紅霞楊的增幅均為1.5倍左右。即在高光脅迫下，5個(gè)品種的葉黃素脫環(huán)氧化增長程度類似，進(jìn)行光照恢復(fù)后，5個(gè)品種均恢復(fù)至略高于對照水平，其中翡翠楊的葉黃素脫環(huán)氧化程度在光照恢復(fù)后保持在對照值的1.33倍。綜合對比可以知道，雖然翡翠楊的(A+Z)/(V+A+Z)值高于其余4個(gè)品種，但全紅楊在具有較高的葉黃素脫環(huán)氧化程度的同時(shí)，其葉黃素庫容量(V+A+Z)高于翡翠楊，因此全紅楊具有較高的熱耗散效率。

2.4 抗氧化劑和抗氧化酶活性變化

從圖4可以看出，全紅楊的DPPH清除能力在脅迫前最高，隨著光照脅迫時(shí)間的延長顯著增加，恢復(fù)階段維持平緩下降。中紅楊、金紅楊和紅霞楊的DPPH清除能力依次下降，在脅迫下的增加幅度也依次減小，恢復(fù)2 d后能維持最初水平。翡翠楊的DPPH清除能力相比于其他4個(gè)品種較低，且在整個(gè)脅迫階段和恢復(fù)階段都沒有顯著變化。說明，全紅楊，中紅楊等紅葉品種具有較高的非酶抗氧化劑活力，對其光保護(hù)能力有較大貢獻(xiàn)，而翡翠楊的非酶抗氧化劑活力較低。

圖4 高光脅迫下5個(gè)彩葉楊樹品種的非酶抗氧化劑DPPH清除能力Fig.4 Changes in radical scavenging activities in leaves of five colorful poplar varieties in response to high-light stress

由圖4與表1的對比可得，隨著花色素苷含量的增加，5個(gè)品種的DPPH活性也不斷上升。表明在高光脅迫與光照恢復(fù)階段，基于DPPH的自由基清除能力與花色素苷含量密切相關(guān)，花色素苷存在下，葉片的光保護(hù)能力主要表現(xiàn)為對非酶抗氧化劑的促進(jìn)作用。

在對照組中(脅迫前)，5個(gè)品種的SOD、POD、CAT和APX 4種抗氧化酶活性差異并不顯著(圖5-E，F(xiàn)，G，I)，脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)的差異較為明顯(圖4-H)。高光脅迫使5個(gè)品種的彩葉楊樹葉片內(nèi)的5種抗氧化酶活性有不同程度的提高。全紅楊與翡翠楊的SOD，POD活性相當(dāng)，在進(jìn)行光照脅迫后，兩者的酶活性增加幅度也相同，但光照恢復(fù)以后，翡翠楊的POD維持在對照水平的171.24 %，而全紅楊下降至對照的76 %，其余3個(gè)品種在光照恢復(fù)后均下降至對照水平。

翡翠楊的過氧化氫酶(CAT)和脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)在高光脅迫下的增加幅度基本相同，其增幅與含量均顯著高于全紅楊。中紅楊，金紅楊和紅霞楊CAT和DHAR活性介于2個(gè)品種之間，且在光照恢復(fù)后都恢復(fù)至對照水平。值得注意的是，與其余4個(gè)品種相比，翡翠楊的抗壞血酸過氧化物酶(APX)在脅迫后顯著上升，且在恢復(fù)光照強(qiáng)度后仍維持了較高APX含量，而其余4個(gè)品種的APX活性隨著光照強(qiáng)度的減弱下降至對照水平。

綜合圖4～5可以知道，全紅楊紅葉品種對高光脅迫的良好應(yīng)答機(jī)制主要?dú)w功于較高的非酶抗氧化劑活力(DPPH自由基清除能力)，而抗氧化酶并未對其光照保護(hù)能力表現(xiàn)出突出貢獻(xiàn)。翡翠楊(綠葉品種)對高光脅迫的應(yīng)答機(jī)制主要依靠抗氧化酶含量及活性的增強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

3.1 高光脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的過剩光能

與對照組相比，維持相同溫度條件下，光照強(qiáng)度增強(qiáng)導(dǎo)致5個(gè)品種彩葉楊樹的Fv/Fm值明顯下降，表明葉片的最大光化學(xué)效率下降，光系統(tǒng)的反應(yīng)中心遭到損傷[14-15]。

圖5 高光脅迫下5個(gè)彩葉楊樹品種的抗氧化酶活性變化Fig.5 Changes in antioxidant enzyme activities in leaves of five colorful poplar varieties in response to high-light stress

3.2 高光脅迫下花色素苷的產(chǎn)生與積累

3.3 花色素苷在彩葉楊樹中的光保護(hù)作用

Chalker-Scott L在花色素苷對環(huán)境脅迫的響應(yīng)一文中已討論，出現(xiàn)環(huán)境脅迫時(shí)(例如本文中利用高光脅迫)，植物在各組織中會積累一定的花色素苷[25]，這為花色素苷與葉片光保護(hù)作用之間存在密切關(guān)系提供了證據(jù)。且后有研究已報(bào)道，遭受低溫及光照等非生物脅迫后均可以導(dǎo)致花色素苷的進(jìn)一步合成，同時(shí)增加積累量[26-27]。本文中，光照脅迫下花色素苷的大量合成與積累以及各抗氧化酶活性和非酶抗氧化劑活性的顯著變化，均證明高光脅迫下花色素苷含量越高的品種對葉片的光保護(hù)能力越強(qiáng)。同時(shí)，進(jìn)行光照脅迫后，5個(gè)品種的葉綠素含量及組成比例變化未出現(xiàn)明顯變動，即它們的光捕獲能力在遭受高光脅迫及恢復(fù)后并未出現(xiàn)顯著差異。側(cè)面說明，葉片此時(shí)出現(xiàn)的光保護(hù)作用并非來自光捕獲能力的貢獻(xiàn)，而主要源自于花色素苷的大量合成與積累，這為彩葉楊樹中含有花色素苷含量更多的品種具有更強(qiáng)的光保護(hù)能力提供了進(jìn)一步證明。