吳禮貴，鄒小明，楊方社，龔錦程，黃 浩，曾慶華 ，張傳庭

（1.西北大學城市與環(huán)境學院，陜西西安710127；2.井岡山大學生命科學學院，江西吉安343009）

我國水體富營養(yǎng)化問題較為突出，許多河湖都 出現(xiàn)了水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象，而導致水體富營養(yǎng)化的主要元素是排放的工業(yè)生產(chǎn)廢水及生活污水中的磷元素〔1〕。為解決水體富營養(yǎng)化問題，我國對污（廢）水排放標準中磷的去除提出了更高的要求。目前，國內(nèi)外常用的污（廢）水除磷方法主要有生物除磷和化學除磷。其中，生物法中的強化生物除磷（EBPR）工藝因具有經(jīng)濟高效且污泥產(chǎn)量低等特點，在世界各地的污水處理廠中被廣泛采用〔2〕。EBPR系統(tǒng)中一類能夠在厭氧條件下釋磷、好氧條件下過量吸磷的微生物——聚磷菌（PAOs）在除磷過程中起著重要作用。PAOs能夠在厭氧條件下將可揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）轉化為聚羥基烷酸酯（PHA）儲存在體內(nèi)，糖原的降解為此過程提供還原力。在之后的好氧階段，PAOs分解PHA產(chǎn)生能量，并利用此能量吸收水中的磷酸鹽及合成糖原〔3〕。由于PAOs在好氧段的吸磷量大于厭氧段的釋磷量，故可通過在好氧結束時排放含磷污泥達到除磷的目的。

在污水處理過程中，Zn2+被頻繁檢出。工業(yè)廢水中的 Zn2+可達 30~300 mg/L〔4〕。 Zn2+存在于污水處理系統(tǒng)中，可能會對系統(tǒng)中的功能微生物（聚磷菌、硝化菌及反硝化菌等）造成不良影響，進而影響系統(tǒng)的污染物凈化能力?，F(xiàn)階段，已有學者開展了Zn2+對污水處理工藝脫氮除磷性能影響的研究〔5〕。然而，Zn2+對EBPR系統(tǒng)的影響及其作用機理尚不清楚。

為此，本研究采用活性污泥構建EBPR除磷體系，探究了如下幾個問題:（1）Zn2+對EBPR系統(tǒng)除磷性能的影響；（2）Zn2+對PAOs代謝中間產(chǎn)物的影響；（3）Zn2+對與PAOs除磷密切相關的關鍵酶〔多聚磷酸鹽激酶（PPK）、多聚磷酸鹽酯酶（PPX）及腺苷酸激酶（ADK）〕活性以及細胞膜完整性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗用泥及實驗廢水

實驗接種污泥取自吉安市新源污水處理廠，該污泥具有良好的脫氮除磷性能。實驗模擬廢水組成見表1。以CH3COONa作為單一碳源（COD為400 mg/L），KH2PO4為磷源〔可溶性正磷酸鹽（SOP）為 10 mg/L〕，NH4Cl為氮源（NH4+-N 為 20 mg/L）。 C4H8N2S用于抑制硝化細菌的生長。所用化學試劑均購自上海阿拉丁有限公司，為分析純。

1.2 反應器構建及運行

聚磷菌富集實驗在有效容積50 L的序批式反應器（SBR）中進行，進水體積為25 L，實驗裝置如圖1所示。每晝夜運行3個周期，1個周期包括進水10 min、厭氧 2 h、好氧 3 h、沉淀 1 h、排水 10 min 及閑置100 min。反應器污泥齡控制在15 d左右。厭氧段 DO 控制在（0±0.1）mg/L，好氧段 DO 控制在（6.5±0.5）mg/L，反應器放置在（21±1）℃的恒溫室中。 聚磷菌富集期間定期檢測反應器水質(zhì)變化?；钚晕勰嘟?jīng)過40 d左右的培養(yǎng)馴化后，系統(tǒng)釋磷、吸磷量穩(wěn)定，除磷率達到且穩(wěn)定在90%以上，符合EBPR工藝運行條件。從該反應器中取出5 L活性污泥混合液，離心（4 000 r/min，5 min）去除上清液，然后用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的NaCl溶液清洗3次，重懸浮于500 mL蒸餾水中，分裝至5個小型SBR反應器中。分別加入500 mL人工模擬廢水，再加入Zn2+溶液使得反應器中 Zn2+質(zhì)量濃度分別為 0（對照組）、3、10、30、100 mg/L，最后用去離子水補至1 L。各反應器MLSS為（4 000±103）mg/L，MLVSS 為（3 550±78）mg/L。 反應器運行1個周期，運行條件與聚磷菌富集實驗一致。

表1 實驗模擬廢水組成

圖1 SBR實驗裝置示意

1.3 測定方法

SOP采用鉬銻抗分光光度法進行測定〔6〕；COD采用重鉻酸鉀法進行測定〔6〕；DO采用便攜式溶解氧儀測定；糖原采用蒽酮法進行測定〔7〕。PPK、ADK和PPX酶活性的測定參照文獻〔8〕，所有酶活性均基于蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)含量的測定采用Folin-酚法。通過乳酸脫氫酶（LDH）活性來表征細胞膜完整性〔9〕，LDH活性采用南京建成公司試劑盒測定。PHA的含量采用氣相色譜法測定〔10〕。氣相色譜儀為TM7900II型（天美科學儀器有限公司），配置氫火焰離子化檢測器，載氣為氮氣，色譜柱為TM-5柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）；進樣器和檢測器溫度為220℃，采用程序升溫:起始柱溫80℃，停留2 min；然后以8℃/min速度升溫至140℃，停留3 min。一個樣品的運行時間約10 min，進樣量1μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差來表示。應用SPSS25.0軟件對實驗結果進行單因素方差分析，差異顯著性水平p<0.05。

Zn2+對EBPR系統(tǒng)除磷的抑制率計算公式:

式中:I——Zn2+對EBPR系統(tǒng)除磷的相對抑制率，%；

R0——對照組除磷率；

R——投加Zn2+后反應器除磷率。

利用Origin 2019函數(shù)數(shù)據(jù)庫中的Hill方程對Zn2+毒性劑量效應進行擬合，采用模型決定系數(shù)（R2）、加權卡方檢驗系數(shù)（Reduced Chi-Sqr）來評價模型擬合的效果。

2 結果與討論

2.1 Zn2+對EBPR系統(tǒng)SOP去除及轉化的影響

依據(jù)實驗方法，研究了Zn2+對EBPR系統(tǒng)SOP去除的影響，結果如圖2所示。

圖2 Zn2+對EBPR系統(tǒng)除磷性能的抑制作用

由圖2可知，當Zn2+質(zhì)量濃度為3 mg/L時，對EBPR系統(tǒng)的除磷抑制作用不明顯（p>0.05），抑制率的平均值為2.06%。隨著Zn2+濃度的增加，EBPR系統(tǒng)的除磷抑制率也不斷升高。當Zn2+質(zhì)量濃度從10 mg/L增加至100 mg/L時，系統(tǒng)除磷平均抑制率從40.72%升高至98.05%。基于Zn2+濃度與抑制效應關系，采用Hill方程進行擬合計算（R2為0.999，Reduced Chi-Sqr為0.29），發(fā)現(xiàn)Zn2+對EBPR系統(tǒng)除磷的IC50為11.28 mg/L。

此外，依據(jù)實驗方法，研究了不同濃度的Zn2+暴露于EBPR系統(tǒng)1個周期（8 h）內(nèi)SOP濃度的變化，結果如圖3所示。

圖3 Zn2+對EBPR系統(tǒng)SOP轉化的影響

由圖3可知，當Zn2+質(zhì)量濃度為3 mg/L時，系統(tǒng)的磷釋放和磷吸收能力均未受到顯著影響（p>0.05）；當Zn2+質(zhì)量濃度增加到10 mg/L時，系統(tǒng)厭氧釋磷和好氧吸磷量均明顯降低（p<0.05）；當Zn2+質(zhì)量濃度增加到30 mg/L及100 mg/L時，系統(tǒng)釋磷、吸磷能力進一步減弱，厭氧釋磷平均抑制率分別為51.60%、94.83%，好氧吸磷平均抑制率分別為63.99%、96.48%。

實驗結果表明，Zn2+短期暴露對EBPR系統(tǒng)除磷性能的影響是由Zn2+濃度決定的，較高濃度的Zn2+對PAOs的釋磷及吸磷進程均存在抑制作用。

2.2 Zn2+對PAOs代謝中間產(chǎn)物的影響

PHA及糖原是PAOs代謝的關鍵物質(zhì)，PHA的大量積累是PAOs在好氧條件下超量吸磷的保證，且以乙酸鈉作為碳源時，PHA的成分主要為3-羥基丁酸酯（PHB）和 3-羥基戊酸酯（PHV）〔11〕。 為探究Zn2+對PAOs體內(nèi)中間代謝產(chǎn)物轉化的影響，依據(jù)實驗方法，研究了Zn2+暴露于EBPR系統(tǒng)1個周期（8 h）內(nèi)系統(tǒng)中PHA及糖原含量的變化，結果分別如圖4、圖5所示。

實驗結果表明，當Zn2+質(zhì)量濃度為3 mg/L時，PHA及糖原的轉化曲線與對照實驗組相比幾乎相同。當Zn2+質(zhì)量濃度≥10 mg/L時，厭氧段PHA的合成、糖原的降解幾乎被完全抑制。相比于對照實驗組，投加10~100 mg/L的Zn2+，PHA的合成平均抑制率為82.87%~95.59%。在好氧段，當Zn2+質(zhì)量濃度為10、30 mg/L時，盡管糖原的合成幾乎被完全抑制，但仍存在PHA的降解；當Zn2+質(zhì)量濃度增至100 mg/L，PHA的降解、糖原的合成幾乎被完全抑制。此外，研究表明，各反應器活性污泥中PHB占PHA的絕大部分，如對照組中PHA合成量的平均值為4.99 mmolC/gVSS，其中PHB合成量為3.72 mmolC/gVSS，占比平均值達74.55%。

圖5 Zn2+對EBPR系統(tǒng)中糖原含量的影響

綜上，較高濃度Zn2+對EBPR系統(tǒng)活性污泥中PHA及糖原的代謝均有抑制作用，最終導致系統(tǒng)除磷性能減弱。較高濃度Zn2+的存在抑制了PAOs厭氧時多聚磷酸鹽的分解及糖原的降解，從而減少了PHA合成所需的能量、還原力，使得PHA的合成受到影響，導致在好氧段沒有足夠的PHA降解產(chǎn)生能量供PAOs吸收水中的磷酸鹽。賈利濤等〔5〕也發(fā)現(xiàn)，隨著Zn2+濃度的升高，單級好氧工藝活性污泥中的PHA合成量與降解量均逐漸減少，除磷效率降低。任志群〔12〕的研究表明，高濃度（25 mg/L）納米ZnO短期暴露于SBR系統(tǒng)對其除磷性能有顯著不利影響，系統(tǒng)中PHA的合成與降解受到影響，且糖原的變化幅度更大。雖然其采用的研究對象為納米ZnO，但有研究表明，Zn2+的釋放是導致納米ZnO產(chǎn)生毒性的主要原因〔13〕。其實驗結果中糖原變化與本研究存在差異，可能是由反應器中聚糖菌微生物的豐度差異所導致。

2.3 Zn2+對EBPR系統(tǒng)除磷關鍵酶活性及細胞膜完整性的影響

PPX、PPK 及 ADK 是 PAOs除磷的關鍵酶〔8〕，其中，ADK能與一磷酸腺苷反應生成二磷酸腺苷（ADP），從而生成三磷酸腺苷（ATP），為生物代謝提供能量，此過程是聚磷酸鹽水解的關鍵反應。PPX和PPK分別在厭氧段分解多聚磷酸鹽及好氧段合成多聚磷酸鹽中起關鍵作用。依據(jù)實驗方法，研究了Zn2+暴露于EBPR系統(tǒng)1個周期內(nèi)系統(tǒng)中PPX、PPK、ADK活性及LDH釋放量的變化，結果如圖6所示。

圖 6 Zn2+對 EBPR 系統(tǒng)中 PPX、PPK、ADK 活性（a）及LDH 釋放量（b）的影響（* 表示 p＜0.05；** 表示 p＜0.01）

實驗結果表明，較高濃度的Zn2+對PAOs中PPX、PPK及ADK活性均有抑制作用，且隨著Zn2+濃度的升高，抑制作用增強〔圖 6（a）〕。當 Zn2+質(zhì)量濃度為 3 mg/L時，3種酶活性與對照組相比均無顯著性差異（p＞0.05）。 而當 Zn2+質(zhì)量濃度為 10 mg/L 時，ADK 活性下降至對照組的76.83%，與對照組相比存在顯著差異（p＜0.05）；PPX、PPK活性下降至對照組的 65.33%、52.48%，較對照組有極顯著性差異（p＜0.01）。當Zn2+質(zhì)量濃度增加到30、100 mg/L時，3種酶活性幾乎被完全抑制。較高濃度Zn2+抑制3種酶活性的現(xiàn)象與厭氧段釋磷及好氧段吸磷受到的影響一致。因此可得出結論，較高濃度的Zn2+對EBPR系統(tǒng)中除磷關鍵酶（PPX、PPK和ADK）的抑制作用是導致EBPR系統(tǒng)除磷性能降低的重要原因。

現(xiàn)已知金屬離子對酶的抑制機理有以下幾方面:（1）進入細胞內(nèi)的重金屬與蛋白酶活性中心的—SH發(fā)生反應，或與其他非活性中心部分結合導致酶結構發(fā)生變化，致使酶活性減弱甚至失活〔14〕；（2）重金屬誘導產(chǎn)生的自由基和活性氧（ROS）抑制了酶活性〔8〕。

細胞膜是ROS攻擊的重要靶點。根據(jù)實驗結果，Zn2+（3～100 mg/L）短期暴露對 EBPR 系統(tǒng)中微生物細胞膜完整性未造成顯著影響〔圖6（b）〕，說明機理（1）導致3種酶活性降低的可能性更大。Xiong Zheng等〔15〕的研究也表明，雖然10 mg/L以上的納米ZnO對SBR系統(tǒng)脫氮除磷有抑制作用，但未對系統(tǒng)中微生物的細胞膜完整性造成顯著影響。如前所述，眾多研究表明，Zn2+的釋放是造成納米ZnO產(chǎn)生毒性的主要因素，故可認為該結果與本實驗結果相一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)，長期投加10 mg/L納米ZnO可破壞活性污泥系統(tǒng)中微生物細胞膜的完整性〔16〕。Zn2+長期暴露對EBPR系統(tǒng)中微生物細胞膜的影響仍需作進一步探究。

3 結論

采用活性污泥構建EBPR體系，研究了Zn2+短期暴露對EBPR系統(tǒng)除磷性能的影響及其作用機理，得到如下結論:

（1）當Zn2+質(zhì)量濃度為3 mg/L時，其對EBPR系統(tǒng)除磷性能無顯著影響；當Zn2+質(zhì)量濃度為10 mg/L時，對系統(tǒng)的除磷抑制作用明顯，相比于對照組，平均抑制率為40.72%；當Zn2+質(zhì)量濃度增加到30、100 mg/L時，平均抑制率分別升至94.30%、98.05%。

（2）較高濃度的 Zn2+（≥10 m/L）會影響 PAOs的釋磷及吸磷能力，且會抑制PHA、糖原的正常代謝，進而影響好氧段PAOs分解PHA產(chǎn)生的能量，降低吸磷能力。

（3）較高濃度的 Zn2+（≥10 m/L）會抑制 EBPR 系統(tǒng)中除磷關鍵酶ADK、PPX和PPK的活性，從而對PAOs厭氧釋磷和好氧吸磷造成影響，降低系統(tǒng)的除磷性能。Zn2+（3~100 mg/L）短期暴露對EBPR系統(tǒng)中微生物細胞膜完整性無顯著影響。