蔡斌 鄧剛 易全勇

miR-127-5p是miRNAs家族中的一員，與其他miRNAs一樣，可以通過靶向調控靶基因來參與多種細胞分化、增殖和凋亡的生理過程。有研究表明在開角型青光眼、白內障、糖尿病性視網膜病變等眼科疾病中miR-127-5p存在差異表達，這些研究結果預示著miR-127-5p可能在一些眼科疾病的發(fā)生中起到重要作用[1]。Müller細胞是脊椎動物視網膜的主要大膠質細胞，是視網膜最大的細胞，細胞體位于內核層，Müller細胞對于視網膜神經元的功能和代謝有支持作用，同時也負責神經膠質活化、增殖，它還能經內界膜的裂口游離至視網膜表面參與形成視網膜前膜。筆者推測miR-127-5p可能會通過調控Müller細胞增殖能力從而影響多種眼底疾病的發(fā)生、發(fā)展，因此筆者通過miR-127-5p模擬物miR-127-5p mimics轉染大鼠視網膜Müller細胞來探討這一機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 主要試劑：Müller細胞完全培養(yǎng)基購自無錫欣潤生物科技有限公司；鏈霉素-青霉素雙抗、OPTI-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR預混液、CCK-8檢測試劑盒均購自中國賽默飛世爾科技有限公司；基質膠原液購自上海前塵生物科技有限公司；多聚甲醛、結晶紫均購自北京科創(chuàng)經緯科技有限公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、Propidium Iodide流式細胞儀檢測試劑盒均購自上海艾博抗貿易有限公司。細胞：大鼠視網膜Müller細胞購自上海吉瑪生物技術有限公司；miR-127-5p mimics購自上海吉瑪生物技術有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 將大鼠視網膜Müller細胞置于Müller細胞完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入10%FBS、100U/ml的青霉素和0.1mg/ml的鏈霉素，放入37℃、含5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。取對數(shù)生長期細胞，在無菌條件下用0.25%胰酶消化，在顯微鏡下觀察到80%的細胞形態(tài)開始變圓時，取2ml細胞培養(yǎng)基加入細胞培養(yǎng)瓶中終止消化，將細胞濃度調整為5×106個/ml，備用。

1.3 分組和轉染 將培養(yǎng)后的大鼠視網膜Müller細胞分為實驗組和陰性對照組，其中實驗組分為3個亞組分別轉染 10、30、100μM 3 種濃度的 miR-127-5p mimics進行細胞增殖能力的檢測，陰性對照組轉染miR-127-5p陰性對照劑miR-127-5p-NC。吸取200pmol miR-127-5p mimics（對照組為miR-127-5p-NC）加入 1.5ml的無菌EP離心管中，再加入無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM 1ml，充分混勻后加入轉染試劑Lipofectamine RNAiMAX 12μl，混勻后室溫靜置20min。吸取混合液緩慢滴加到Müller細胞培養(yǎng)板中。48h后進行后續(xù)實驗。

1.4 細胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將轉染后的細胞常規(guī)消化、離心、重懸后計數(shù)，將細胞接種于96孔板內，每孔細胞數(shù)2 000個，每組處理細胞設置4個復孔，放于細胞培養(yǎng)箱內孵育。分別于6h、第2、3、4、5天加入20%CCK-8，37°C避光孵育2h后，用酶標儀檢測450nm時的吸光度（OD）值來表示細胞增殖能力。以上實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞侵襲、遷移能力檢測 采用Transwell小室實驗。分為遷移小室實驗和侵襲小室實驗，前者無基質膠而后者有基質膠。取結晶紫0.05g溶于甲醇制成0.5%的結晶紫溶液，用PBS溶液1（:5～8）制成0.1%的結晶紫染液。將BD matrigel和無血清培養(yǎng)基以1:8比例稀釋，吸取80μl加入Trans well的上室中，放置于培養(yǎng)箱中至少2h。將細胞消化、離心、無血清重懸、并稀釋成5×105個/ml的細胞懸液。Transwell板中加入500μl含20%FBS的完全培養(yǎng)基，將小室放入板中。在Transwell小室中加入200μl的細胞懸液，將Transwell板37℃下于CO2（含量5%）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。將小室取出，用PBS洗去培養(yǎng)基，結晶紫染色10min；自來水將表面的結晶紫洗除干凈，用棉簽將上室中接種側的細胞擦除干凈，最后使用奧林巴斯BX51顯微鏡檢測細胞的侵襲、遷移能力，并采用Image J軟件對發(fā)生侵襲、遷移行為的大鼠視網膜Müller細胞進行計數(shù)。

1.6 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術。細胞懸液處理同上，取 100μl細胞懸液、5μl的 7-AAD 及 5μl的FITC Annexin V充分混勻，置于室溫（20～25℃）避光15min，加400μl Binding Buffer在1h內進行檢測，計算細胞凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度miR-127-5p mimics轉染細胞OD值的比較 與陰性對照組相比，轉染10、30、100μM miR-127-5p mimics組中大鼠視網膜Müller細胞OD值均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），同時這3種濃度組間OD值比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同濃度miR-127-5p mimics轉染細胞OD值的比較

2.2 兩組細胞侵襲能力比較 陰性對照組、30μM的miR-127-5p mimics實驗組（下同）細胞侵襲數(shù)目分別為（29.19±3.42）、（14.59±2.38）個，實驗組細胞侵襲數(shù)目較陰性對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 1（插頁）。

2.3 兩組細胞遷移能力比較 實驗組、陰性對照組細胞遷移的數(shù)目分別為（29.68±3.28）、（58.19±5.42）個，實驗組細胞遷移數(shù)目較陰性對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖 2（插頁）。

2.4 兩組細胞凋亡率的比較 實驗組細胞凋亡率（26.11±2.13）%，明顯高于陰性對照組的（4.19±0.76）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3（插頁）。

3 討論

miR-127-5p近年來被發(fā)現(xiàn)在多種疾病中的表達水平與正常組織比較差異均有統(tǒng)計學意義，同時miR-127-5p表達水平的失調也參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過程[2]。研究表明miR-127-5p對于生理活動的調控主要是通過調控細胞的增殖能力，如miR-127-5p可以通過靶向結合SETD8基因調控骨肉瘤細胞系的增殖能力[3]。在骨關節(jié)炎軟骨細胞中，miR-127-5p的表達水平顯著低于正常關節(jié)軟骨組織，說明miR-127-5p過表達可以提高軟骨細胞的增殖能力[4-5]。在一系列肝癌細胞系中，miR-127-5p的表達水平顯著高于正常細胞系，而在乳腺癌細胞中miR-127-5p的表達水平顯著下調[2]。在眼科類疾病中同樣也發(fā)現(xiàn)miR-127-5p具有表達水平差異，例如在視網膜發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)的一系列具有表達差異的miRNAs中就有miR-127-5p的存在，在開角型青光眼與白內障患者中發(fā)現(xiàn)的16種具有差異表達的miRNAs中也包含miR-127-5p[6]，在糖尿病引起的視網膜病變組織中，存在17種差異表達的miRNAs，而miR-127-5p也正是差異表達的miRNAs中的一員[7]。

根據(jù)文獻報道可知，miRNAs在目標組織的異常表達通常暗示著該miRNAs在該組織中可能存在調控作用[2]。在本實驗中筆者選用大鼠視網膜Müller細胞為研究對象，Müller細胞是視網膜中非常重要的一類膠質細胞，Müller細胞不僅在正常的視網膜功能中有重要作用，在各類型的視網膜變性疾病中Müller細胞同樣具有重要作用[8]，同時在特發(fā)性黃斑前膜的形成過程中，視網膜Müller細胞發(fā)揮重要作用，研究表明在大多數(shù)特發(fā)性黃斑前膜組織中都具有谷氨酰胺合成酶免疫反應性，這表明特發(fā)性黃斑前膜的組成細胞可能主要起源于Müller細胞，因為谷氨酰胺合成酶的免疫反應性主要表達在Müller細胞中[9-10]。此外，轉化生長因子β可以通過調控視網膜Müller細胞的增殖、遷移和轉化參與特發(fā)性黃斑前膜的形成[11]。這些研究證據(jù)充分證明Müller細胞的活性在特發(fā)性黃斑前膜的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，因此為了探究miR-127-5p表達水平顯著下調在特發(fā)性黃斑前膜中的作用，筆者使用Müller細胞作為研究模型，通過細胞增殖、細胞侵襲、細胞遷移以及細胞凋亡實驗以探究miR-127-5p對于Müller細胞行為的影響。

本研究采用 10、30、100μM 的 miR-127-5p mimics轉染大鼠視網膜Müller細胞，并檢測這3種濃度的miR-127-5p mimics對于大鼠視網膜Müller細胞的增殖能力的影響，結果顯示miR-127-5p mimics轉染后可以顯著抑制大鼠視網膜Müller細胞的增殖能力，該結果與miR-127-5p在其他細胞中對于細胞增殖能力的調控作用一致，如在肝癌細胞系中，miR-127-5p可以通過靶向結合BLVRB基因抑制其表達水平從而抑制肝癌細胞系的增殖能力，在乳腺癌細胞中，miR-127-5p可以通過抑制靶基因BCL6表達水平從而抑制乳腺癌細胞的增殖能力[7]。此外，筆者還進一步檢測了miR-127-5p表達水平升高后對于大鼠視網膜Müller細胞的其他細胞行為的影響。根據(jù)實驗結果發(fā)現(xiàn)，miR-127-5p表達水平升高之后，大鼠視網膜Müller細胞的侵襲能力和遷移能力均受到顯著抑制，該結果同樣與miR-127-5p在其他細胞侵襲和遷移中的作用類似[7]，證明miR-127-5p表達水平升高能抑制大鼠視網膜Müller細胞的增殖能力。此外，筆者采用流式細胞術檢測凋亡結果發(fā)現(xiàn)，miR-127-5p表達水平升高后，大鼠視網膜Müller細胞凋亡率增加，證明miR-127-5p表達水平升高不僅能抑制大鼠視網膜Müller細胞的增殖能力，同時還在一定程度上促進了視網膜Müller細胞的凋亡。

總之，本研究證實了miR-127-5p表達水平升高可以抑制大鼠視網膜Müller細胞增殖、侵襲和遷移能力，并促進視網膜Müller細胞的凋亡。miR-127-5p可能是治療或者阻止特發(fā)性黃斑前膜發(fā)展的潛在靶點。