何禮 韓瑞偉 閻雪瑩

[摘要] 目的 討論染料木素（GEN）甲氧基封端的聚乙二醇-乳酸羥基乙酸共聚物（MePEG-PLGA）膠束多次給藥在健康大鼠體內的藥動學行為。 方法 將24只健康Wistar大鼠按體重分成四組，每組6只，分別為GEN乳劑組，GEN膠束低、中、高劑量組。每組分別多次尾靜脈注射GEN乳劑和GEN膠束，乳劑劑量為40 mg/kg，膠束劑量分別為20、40、60 mg/kg。采用高效液相色譜法（HPLC）測定給藥后不同時間點血漿中GEN濃度。 結果 GEN乳劑組和GEN膠束組最小血藥濃度（Cmin）、半衰期（t1/2）、藥時曲線下面積（AUC0～t）、清除率（CL）、波動系數(shù)（DF）比較，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）;GEN膠束低、中和高3個劑量組主要藥動學參數(shù)Tmax、t1/2、CL、表觀分布容積（Vd）和DF比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。與GEN膠束低劑量組比較，GEN膠束中劑量組最大血藥濃度（Cmax）、AUC0～t升高，與GEN膠束低、中劑量組比較，GEN膠束高劑量組Cmax、AUC0～t升高，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。GEN膠束各劑量組AUC0～t、AUC0-∞、Cmax、平均穩(wěn)態(tài)濃度（Cav）隨給藥劑量增大而增加，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01），AUC0-t、AUC0-∞、Cmax、Cav與劑量呈線性關系（r > 0.97）。在相同劑量下，單次和多次給藥后的主要藥動學參數(shù)Cmax、t1/2、AUC0～t、CL、Vd、MRT0～t差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結論 GEN膠束能明顯延遲GEN在大鼠體內滯留時間，提高生物利用度，且血藥濃度與劑量呈線性關系，多次給藥后在大鼠體內不存在蓄積現(xiàn)象。

[關鍵詞] 染料木素;MePEG-PLGA膠束;多次給藥;藥動學

[中圖分類號] R969.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（c）-0017-05

Pharmacokinetic study of genistein -loaded methoxy-terminated polyethylene glycol-lactic acid glycolic acid copolymer micelles after multiple dosing in rats

HE Li1? ?HAN Ruiwei1? ?YAN Xueying2

1.Laboratory for Medicinal Resources and Utilization in Northwest Sichuan， Sichuan University of Traditional Chinese Medicine， Sichuan Province， Mianyang? ?621000， China; 2.College of Pharmacy，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China

[Abstract] Objective To discuss the pharmacokinetic behavior of genistein （GEN） methoxy-terminated polyethylene glycol-lactic acid glycolic acid copolymer （MePEG-PLGA） micelles administered multiple times in healthy rats. Methods Twenty-four healthy Wistar rats were randomly divided into four groups according to their body weight， with 6 rats in each group， namely the GEN emulsion group and the GEN micelle low， medium and high dose groups. In each group， GEN emulsion and GEN micelles were injected into the tail vein several times， respectively， with the emulsion dose of 40 mg/kg and the micelle dose of 20， 40 and 60 mg/kg. The high performance liquid chromatography （HPLC） was used to analysis drug delivery in different time points after plasma GEN concentration. Results The differences in minimum blood drug concentration （Cmin）， half-life （t1/2）， area under the curve （AUC0-t）， clearance rate （CL） and fluctuation coefficient （DF） between GEN emulsion group and GEN micelles group were statistically significant （P < 0.01）. There were no statistically significant differences in the major pharmacokinetic parameters Tmax， t1/2， CL， apparent distribution volume （Vd） and DF in the GEN micelles groups with low， medium and high doses （P > 0.05）. Compared with the low-dose group of GEN micelles， the maximum blood concentration （Cmax） and AUC0-t in the medium-dose group of GEN micelles were increased， while the Cmax and AUC0-t in the high-dose group of GEN micelles were increased compared with the low-dose and medium-dose group of GEN micelles， and the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）. The differences of AUC0-t， AUC0-∞， Cmax and average steady stateconcentration （Cav） in each dose group of GEN micelles increased with the increase of the dose （P < 0.01）， and there was a linear relationship between AUC0-t， AUC0-∞， Cmax and Cav and the dose （r > 0.97）. There were no significant differences in the major pharmacokinetic parameters Cmax， t1/2， AUC0-t， CL， Vd， MRT0-t between single and multiple doses at the same dose （P > 0.05）. Conclusion GEN micelles can significantly delay the retention time of GEN in rats and improve the bioavailability. Moreover， there is a linear relationship between blood drug concentration and dose， and there is no accumulation in rats after repeated drug administration.

[Key words] Genstein; MePEG-PLGA micelle; Multiple dosing; Pharmacokinetics

染料木素（genstein，GEN）是一種大豆異黃酮類活性成分，其結構與雌激素相似，又被稱為“植物雌激素”。GEN可通過直接與體內雌激素受體（estrogen receptor，ER）結合或通過調節(jié)內源性雌激素分泌等途徑發(fā)揮作用，對腫瘤、女性更年期綜合征、骨質疏松等疾病有良好療效[1-9]，目前國內外已有多個制劑獲準進入臨床研究[10-13]。然而GEN在水中幾乎不溶，且存在較強的首過效應，直接口服生物利用度低，極大限制了其臨床應用[14-16]。為解決GEN低溶解度及提高GEN的生物利用度，本課題組采用MePEG-PLGA為載體成功制備GEN膠束凍干針劑[17]。體外釋放動力學研究顯示，GEN膠束具有良好的緩釋特性[18]。單次給藥藥動學研究顯示，染料木素制備成膠束后明顯延長消除半衰期，曲線下面積（AUC）顯著增加，消除率顯著降低，延長了染料木素在循環(huán)系統(tǒng)中的滯留時間，相對生物利用度顯著提高[19-20]。目前關于GEN膠束在大鼠體內多次多劑量藥動學研究及其藥物蓄積研究尚無報道，本研究旨在考察GEN膠束多次多劑量給藥后的藥動學行為，進一步探討其藥動學特征，為其臨床合理應用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010 AHT型高效液相色譜儀（日本島津公司）;R-205B型旋轉蒸發(fā)器（上海申勝生物技術有限公司）;W202B型數(shù)控恒溫浴鍋（上海申勝生物技術有限公司）;Scientz-ⅡD型超聲波細胞破碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 試藥

GEN對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111704-200502）;GEN原料藥（西安小草植物科技有限責任公司，批號：XC100310）;GEN膠束滅菌注射用粉末（實驗室自制，5 mL安瓿瓶盛裝，GEN 2.0 mg/瓶，生產(chǎn)批號：20180717）;MePEG-PLGA（濟南岱罡生物科技有限公司，批號：102106）;聚乙烯醇（PVA，北京益利精細化學品有限公司;醇解度：88%）;二氯甲烷（北京北化精細化工品有限公司）;透析袋（美國Sigma公司，MW=8000～14400）;甲醇（色譜純，DIKMA公司）;其他試劑均為分析純。

1.3 動物

清潔級健康Wistar大鼠24只，8～12周，雌雄各半，體重（200±20）g，黑龍江中醫(yī)藥大學藥物非臨床研究（GLP）實驗室提供[合格證號：SCXK（黑）2017-0013]，通過動物倫理學審核，飼養(yǎng)條件：室溫（25±2）℃，相對濕度為（50±10）%，每天交替12 h光照，自由飲水和進食。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，組間比較采用t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

LC-2010 AHT型高效液相色譜儀，配有四元梯度泵，恒溫標準自動進樣器，可變波長掃描紫外檢測器和工作站（日本島津公司）;色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;檢測波長：260 nm;流動相：甲醇-水（60∶40）;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;進樣量：10 μL。

2.2 血漿樣品預處理

精密吸取100 μL血漿樣品，置于1.5 mL離心管中，加入200 μL甲醇沉淀血漿蛋白，渦旋混合1 min，10 000 r/min離心10 min，吸取全部上清液過微孔濾膜（0.22 μm）用于高效液相色譜（HPLC）分析。

2.3 溶液制備

精密稱取GEN對照品8.80 mg，置于50 mL容量瓶中，用稀釋至刻度，得0.176 mg/mL的對照品貯備液。

精密稱取約10 mg GEN膠束，置于離心管中，加入10 mL二氯甲烷，渦旋溶解，混懸液離心10 min（轉速5000 r/min），重復2次，合并上清液并用二氯甲烷定容至20 mL，即得供試品溶液。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性考察? 取小鼠空白血漿、加0.2 μg/mL GEN標準溶液的大鼠血漿、靜脈注射GEN膠束后90 min的大鼠血漿樣品，按“2.2”項下處理，分別得到空白血漿、加藥血漿和含藥血漿樣品的色譜圖，血漿中其他物質均不干擾GEN測定。見圖1。

2.4.2 標準曲線繪制? 分別精密量取“2.3”項下GEN對照品貯備液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得濃度1.76、3.52、7.04、14.08、28.16、56.32、112.64 μg/mL的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積（Y）對濃度（X）進行線性回歸，得GEN標準曲線方程為Y = 124 815X +37 925，r = 0.9999。

2.4.3 精密度試驗? 制備GEN濃度為1.76、14.08、112.64 μg/mL的血漿樣品各6份，處理后連續(xù)進樣6次，得日內精密度，連續(xù)進樣6 d，得日間精密度。GEN對照溶液日內精密度RSD值分別為0.46%、0.63%、1.24%（n = 6），日間精密度RSD值分別為0.94%、1.21%、2.05%（n = 6），精密度滿足分析要求。

2.4.4 回收率試驗? 制備GEN濃度為1.76、14.08、112.64 μg/mL的血漿樣品各6份，進樣分析，以加入量和測得量計算提取回收率。低、中、高濃度樣品的平均回收率分別為（97.10±0.89）%、（96.80±0.94）%、（98.10±0.78）%（n = 6），回收率滿足分析要求。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗? 取同一批次制備的GEN膠束于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h，計算GEN濃度的RSD值為1.73%，穩(wěn)定性滿足分析要求。

2.4.6 重復性性試驗? 取同一批次制備的GEN膠束6份，平行配制供試品溶液進樣分析，計算GEN濃度的RSD值為1.06 %，重復性滿足分析要求。

2.5 藥動學研究

2.5.1 實驗動物與給藥方案? 健康Wistar大鼠12只，雌雄各半，按照體重分為兩組，每組6只，分別為GEN乳劑組和GEN膠束組。實驗前禁食12 h，自由飲水。各組稱重后，尾靜脈注射給藥（劑量為40 mg/kg），于給藥后0.00、0.083、0.170、0.500、1.000、2.000、4.000、6.000、 8.000、10.000、12.000、24.000 h從眼眶后靜脈叢取血約0.4 mL，冷凍保存。

健康Wistar大鼠24只，雌雄各半，按照體重隨機分為四組，每組6只，分別為GEN乳劑組，GEN膠束低、中、高劑量組。實驗前禁食12 h，自由飲水。根據(jù)給藥劑量設為GEN乳劑組（40 mg/kg）[按2015版《中華人民共和國藥典》[21]（一部）中規(guī)定，本研究設定劑量接近人臨床等效劑量]、GEN膠束低（20 mg/kg）、中（40 mg/kg）、高（60 mg/kg）劑量組。各組稱重后，尾靜脈注射給藥，給藥間隔24 h，連續(xù)7次，于第4、5、6次給藥前采血作為谷濃度，并于末次給藥后0.000、0.083、0.170、0.500、1.000、2.000、4.000、6.000、8.000、10.000、12.000、24.000 h從眼眶后靜脈叢取血約0.4 mL，冷凍保存。

2.5.2血藥濃度-時間曲線? 按“2.5.1”項下給藥方案，分別計算單次給藥和多次給藥各組各時間點血藥濃度，其平均血藥濃度-時間曲線見圖2和圖3。

2.5.3 多次給藥GEN乳劑組和GEN膠束組藥動學參數(shù)比較? 在相同給藥劑量下，GEN乳劑組與GEN膠束組最小血藥濃度（Cmin）、半衰期（t1/2）、藥時曲線下面積（AUC0～t）、清除率（CL）、波動系數(shù)（DF）比較，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。見表1。

2.5.4 不同劑量GEN膠束組藥動學參數(shù)比較? 采用DAS 3.0軟件進行非房室模型擬合并計算藥動學參數(shù)，最大血藥濃度（Cmax）和達峰時間（Tmax）采用實測值，AUC0～t采用梯形法計算。大鼠靜脈注射GEN膠束后，GEN膠束低、中和高3個劑量組主要藥動學參數(shù)Tmax、t1/2、CL、表觀分布容積（Vd）和DF比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;與GEN膠束低劑量組比較，GEN膠束中劑量組Cmax、AUC0～t升高，與GEN膠束低、中劑量組比較，GEN膠束高劑量組Cmax、AUC0～t升高，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。見表2。

2.5.5多次給藥不同劑量GEN膠束組藥動學參數(shù)比較及其與劑量的相關性分析? 與GEN膠束低劑量組比較，GEN膠束中劑量組AUC0～t、AUC0～∞、Cmax、平均穩(wěn)態(tài)濃度（Cav）升高，與GEN膠束低、中劑量組比較，GEN膠束高劑量組AUC0～t、AUC0～∞、Cmax、Cav升高，差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P < 0.01）。AUC0-t、AUC0-∞、Cmax、平均穩(wěn)態(tài)濃度（Cav）與劑量呈線性關系（r > 0.97）。見表3。

2.5.6 GEN膠束單次給藥和多次給藥藥動學參數(shù)比較在劑量相同情況下，大鼠單次給藥和多次給藥后的主要藥動學參數(shù)Cmax、t1/2、AUC0～t、CL、Vd、MRT0～t差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖4。

3 討論

目前國內外現(xiàn)尚無GEN相關注射制劑，且GEN在水中溶解度很差，無法直接將GEN溶解在生理鹽水中進行大鼠的尾靜脈注射，根據(jù)參比制劑選擇原則，實驗中將GEN制成乳劑作為參比制劑與GEN膠束凍干針劑進行比較。

與GEN乳劑組比較，GEN膠束組MRT0-t顯著延長，主要原因為將親水性的PEG通過酯鍵共價連接到PLGA上，形成PEG包衣的納米粒子，有效避免了網(wǎng)狀內皮吞噬系統(tǒng)的識別和吞噬，延長了體內循環(huán)時間。

使用多次給藥測定生物利用度可以揭示單次給藥研究所觀察不到的變化。多次給藥后，從第4天血藥濃度已基本穩(wěn)定，提示已達到穩(wěn)態(tài)。與前期大鼠單次注射GEN膠束藥動學結果比較，可以看出多次給藥達穩(wěn)態(tài)后的主要藥動學參數(shù)Cmax、t1/2、AUC0～t、CL、Vd、MRT0～t差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。多次給藥Cav分別為1.900、4.098、1、7.904 mg/L，波動系數(shù)DF分別為4.036、3.862、3.644，提示GEN膠束多次給藥后在正常大鼠體內不存在蓄積現(xiàn)象，連續(xù)給藥不改變GEN膠束凍干針劑的藥動學特征。

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（收稿日期：2019-11-13? 本文編輯：劉永巧）