何穎恒，余學(xué)玲，陳旭新

（福建東威食品有限公司，福建 福清 350315）

白對蝦蝦肉質(zhì)嫩爽口又營養(yǎng)價值極高，因而廣受人們歡迎。白對蝦絕大多數(shù)器官在蝦頭中，蝦頭重量將近全蝦的一半。蝦頭中含有大量的有益物質(zhì)和微量元素[1,2]。蝦頭在多酚氧化酶的作用下會變褐色，且一般不被消費者食用。因此，大多數(shù)食品處理廠會將蝦頭分離，只剩蝦的軀干部分再出售。隨著白對蝦養(yǎng)殖和銷售規(guī)模的不斷擴大，大量的蝦頭常被丟棄，不僅造成了蝦頭資源的大量浪費，還可能導(dǎo)致一定程度的環(huán)境污染。

為了挖掘蝦頭的價值，張樣剛等人[3]分析了南美白對蝦蝦頭的一般化學(xué)組成；彭燕等人[4]分析了南美白對蝦蝦頭的氨基酸組成。由于蝦頭富含蛋白和氨基酸，通過蛋白酶水解可進一步提高其呈味氨基酸的含量以賦予其更濃郁的鮮味，因而蝦頭蛋白水解液常被用于開發(fā)蝦味調(diào)味料[5-10]。高志中[6]等人進行了海蝦風(fēng)味料的開發(fā)及應(yīng)用；劉素磊[7]利用酶解的方法對南美白對蝦蝦頭調(diào)味汁進行了研究；李天琪[8]等用GC-MS手段分析蝦調(diào)味料的風(fēng)味得出在酶解的基礎(chǔ)上添加生姜油可以提高其風(fēng)味及功能；岑劍偉[9]等人研究了海鮮醬制備工藝技術(shù)；錢飛[10]等人對克氏原螯蝦蝦頭酶解液的揮發(fā)性風(fēng)味成分進行了大量的分析；徐坤華[11]等人分析了堿性蛋白酶水解中華管鞭蝦蝦頭的工藝優(yōu)化。為了提高蝦頭蛋白的水解度，本試驗以南美白對蝦蝦頭為原料，通過添加蛋白酶和用超聲輔助處理來制備蝦頭蛋白的水解液，探討了蛋白酶類型、蛋白酶添加量、料液比、pH值、超聲功率、超聲時間、酶解溫度和酶解時間這8個因素對蝦頭蛋白水解度的影響，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化最佳的超聲和酶解條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蝦頭：由福清市東威水產(chǎn)食品實業(yè)有限公司提供。

1.1.2 主要試劑：中性蛋白酶，堿性蛋白酶，酸性蛋白酶、酸性復(fù)合肽酶和復(fù)合肽酶PR50G，由杜邦公司提供。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備：數(shù)控超聲波清洗器，購自昆山市超聲儀器有限公司；自動凱氏定氮儀，購自海能儀器有限公司；臺式高速大容量冷凍離心機，購自湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；實驗室pH計，購自梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；弗魯克電動攪拌器，購自上海弗魯克科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蝦頭預(yù)處理

將冷凍蝦頭解凍，再用高速粉碎機破碎成泥狀，以備后續(xù)處理。

1.2.2 工藝流程

蝦頭解凍→沸水煮沸→超聲→震蕩酶解→沸水煮沸滅酶→離心→測氨基酸態(tài)氮含量

1.2.3 總氮含量的測定方法

根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》中規(guī)定的凱氏定氮法測定蝦頭中的總氮含量。

1.2.4 氨基酸態(tài)氮含量的測定方法

根據(jù)GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中規(guī)定的酸度計法測定氨基酸態(tài)氮含量

1.2.5 水解度的測定

蛋白質(zhì)的水解度（DH）代表其在水解過程中肽鍵被裂解[12]的程度。

計算式為：

式中：

T為蝦頭中總氮含量，g/100g；

X1為酶解液中氨基酸態(tài)氮含量，g/100g；

X0為未酶解的蝦頭中游離氨基酸態(tài)氮含量，g/100g。

1.3 單因素試驗設(shè)計

1.3.1 蛋白酶類型對蝦頭蛋白水解度的影響

取經(jīng)破碎處理后的蝦頭泥10 g，按料液比為1∶10加入蒸餾水，沸水煮5 min后冷卻，分別調(diào)節(jié)pH值至各個蛋白酶的最適值（分別為6.6、8.5、2.8、4.0、4.0），超聲功率300 W超聲處理40 min，按占蝦頭泥重量的1%分別加入中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、酸性復(fù)合肽酶、復(fù)合肽酶PR50G，在最適溫度（分別為55、58、55、53、53 ℃）下攪拌酶解2 h，沸水中煮10 min使酶失去活性，4000 r/min下再離心20 min，取上清液，測定其水解度。

1.3.2 蛋白酶添加量對蝦頭蛋白水解度的影響

取經(jīng)破碎處理后的蝦頭泥10 g，按料液比1∶10加入蒸餾水，pH值調(diào)節(jié)至8.5，超聲功率300 W超聲處理40 min，將堿性蛋白酶按占蝦頭重量的0.01%、0.1%、1%的量分別加入，在58 ℃攪拌酶解2 h，沸水中煮10 min使酶失去活性，4000 r/min下再離心20 min，取上清液，測定其水解度。而中性蛋白酶的處理為，pH調(diào)節(jié)至6.6，55 ℃下攪拌酶解2 h，其余做同樣處理。

表1 響應(yīng)面分析法的因素和水平

1.3.3 料液比對蝦頭蛋白水解度的影響

取經(jīng)破碎處理后的蝦頭泥10 g，分別按料液比1∶8、1∶10、1∶12加入蒸餾水，沸水煮5 min后冷卻，調(diào)節(jié)pH至7.5，超聲功率180 W處理30 min，按蝦頭泥重量加入1%的堿性蛋白酶和1‰中性蛋白酶，在50 ℃下攪拌酶解3 h，之后沸水中煮10 min使酶失去活性，4000 r/min下離心20 min，取上清液，測定其水解度。

1.3.4 pH對蝦頭蛋白水解度的影響

考察pH分別為6.5、7.5、8.5時所獲得的蝦頭蛋白的水解度。其料液比為1∶10，除pH外其他工藝條件同于1.3.3。

1.3.5 超聲功率對蝦頭蛋白水解度的影響

考察超聲功率分別為150、180、210 W時所獲得的蝦頭蛋白的水解度。其料液比為1∶10，除超聲功率外其他工藝條件同于1.3.3。

1.3.6 超聲時間對蝦頭蛋白水解度的影響

考察超聲時間分別為10、20、30、40 min時所獲得的蝦頭蛋白的水解度。其料液比為1∶10，除超聲時間外其他工藝條件同于1.3.3。

1.3.7 酶解溫度對蝦頭蛋白水解度的影響

考察酶解溫度分別為30、40、50、60 ℃時所獲得的蝦頭蛋白的水解度。其料液比為1∶10，除酶解溫度外其他工藝條件同于1.3.3。

1.3.8 酶解時間對蝦頭蛋白水解度的影響

考察酶解時間比分別為1、2、3、4 h時所獲得的蝦頭蛋白的水解度。其料液比為1∶10，除酶解時間外其他工藝條件同于1.3.3。

1.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

對比單因素試驗結(jié)果的顯著性，選取pH值、酶解溫度、超聲功率以及超聲時間為因素，以水解度為響應(yīng)值，選擇3水平進行試驗。因素與水平設(shè)計見表1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用 Excel、SPSS和Design-Expert軟件進行統(tǒng)計和方差分析。所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均所得的平均值。當 P＜0.05 時，差異性顯著；當P＜0.01，差異性極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 蛋白酶類型對蝦頭蛋白水解度的影響

圖1 蛋白酶類型對蝦頭蛋白水解度的影響

由圖1可知，5種蛋白酶在最適的pH和溫度下，經(jīng)攪拌酶解3 h后，以堿性蛋白酶的水解效果較為理想。通過顯著性分析可以看出，堿性蛋白酶的水解度顯著高于其他蛋白酶；其次是中性蛋白酶，其水解效果弱于堿性蛋白酶，是由于它是內(nèi)切酶的一種，其作用位點不在蛋白質(zhì)的表面，不能準確地進行酶解反應(yīng)，因而水解作用減弱。酸性蛋白酶的酶解效果也要弱于前兩者。復(fù)合肽酶PR50G和酸性復(fù)合肽酶的水解效果較為一般。因此，我們選擇了堿性蛋白酶與中性蛋白酶進行雙酶的復(fù)合酶解。

2.1.2 蛋白酶添加量對蝦頭蛋白水解度的影響

圖2 蛋白酶添加量對蝦頭蛋白水解度的影響

由圖2可知，隨著蛋白酶添加量的增大，堿性蛋白酶的水解效果逐漸顯著增強，而中性蛋白酶則在0.1%的添加量下為較高值，當添加量為1%時，其水解度發(fā)生顯著下降。因此，中性蛋白酶的較優(yōu)添加量為0.1%，而在堿性蛋白酶上，出于成本的考慮，我們將其添加量定為1%。

2.1.3 料液比對蝦頭蛋白水解度的影響

圖3 料液比對蝦頭蛋白水解度的影響

由圖3可知，從料液比1∶8到1∶10，其水解度顯著增加；從料液比1∶10到1∶12，其水解度無顯著差異。當料液比為1∶8時，底物中蝦頭的質(zhì)量分數(shù)大，則其水解液的黏度就會遠超于正常值，進一步導(dǎo)致酶在酶解過程中的速度減慢，酶解反應(yīng)的作用效率會發(fā)生下降。而隨著料液比的增大，水解度沒有發(fā)生顯著增加。因此，可選擇料液比1∶10。

2.1.4 pH對蝦頭蛋白水解度的影響

圖4 pH對蝦頭蛋白水解度的影響

由圖4可知，隨著料液pH值的增加，水解度先上升再下降；當料液pH為7.5時，其水解度較高。本實驗中使用堿性蛋白酶和中性蛋白酶進行共同酶解。堿性蛋白酶的活力pH范圍為7.0～9.0，中性蛋白酶的活力pH范圍為6.0～7.5；雙酶共同酶解在pH7.5（均在各自蛋白酶的較優(yōu)活力范圍內(nèi)）時，可獲得較高的水解度。

2.1.5 超聲功率對蝦頭蛋白水解度的影響

圖5 超聲功率對蝦頭蛋白水解度的影響

由圖5可知，水解度會隨著超聲功率的增大而先顯著上升后有顯著降低，在超聲功率為180 W為較高值。這是因為超聲功率的增大，水運動的速度隨之加快，強化傳質(zhì)，并且也增強了對細胞的破碎作用，更有利于水解蝦頭蛋白。而超聲功率過高會使溫度快速上升[13]，復(fù)合酶的活性可能會下降，從而削弱水解作用。因此，實驗應(yīng)選擇180 W超聲功率為宜。

2.1.6 超聲時間對蝦頭蛋白水解度的影響

圖6 超聲時間對蝦頭蛋白水解度的影響

由圖6可知，從超聲時間10 min到30 min內(nèi)，蝦頭水解度發(fā)生顯著上升；到40 min時，其水解度顯著下降；超聲時間30 min時為水解度的較高值。當超聲處理時間不充分時，由于空化作用[14]會使水解液中產(chǎn)生大量微小的氣泡，這些氣泡受到振動會不斷的重生和破滅，在氣泡被擠壓會產(chǎn)生巨大的壓力，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與原來不同，從而影響了水解過程。而若超聲強度太高，由于超聲波不斷通入水解液中，使得液體中的氣泡不斷受到壓力而使溫度上升且壓強增大，形成了一定數(shù)量的游離基團[15]，這些基團會進攻復(fù)合酶分子，降低酶的活性，從而減弱了水解反應(yīng)。因此，實驗應(yīng)選擇30 min的超聲時間為宜。經(jīng)過超聲波處理的蝦頭蛋白水解度要高于單獨使用酶法的水解度，也說明蝦頭經(jīng)過一定強度的超聲處理，能夠更好的提取蝦頭蛋白。

2.1.7 酶解溫度對蝦頭蛋白水解度的影響

圖7 酶解溫度對蝦頭蛋白水解度的影響

由圖7可知，從酶解溫度30～60 ℃，蝦頭蛋白的水解度開始顯著上升而后又顯著降低，在40℃和50℃時達到較高值，二者在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異。這是因為酶解溫度可以很大程度地影響酶活力，酶會在最適溫度下達到最高活力值。實驗所采用的中性蛋白酶的最適溫度范圍在50～55℃，堿性蛋白酶的最適溫度范圍則在55～65℃，故而選擇酶解溫度為50℃。

2.1.8 酶解時間對蝦頭蛋白水解度的影響

圖8 酶解時間對蝦頭蛋白水解度的影響

由圖8可知，隨著酶解時間的增加，水解度會逐漸顯著上升，3 h時為較高，4 h時的水解度與3 h的差異不顯著，因此單因素實驗中酶解時間以3 h為宜。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.1 結(jié)果與方差分析

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 方差分析

Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

四元二次回歸方程為：

由表3可知，此模型的F檢驗值為＜0.0001，失擬項P＞0.05，說明非試驗因素影響小且誤差小。決定系數(shù)R2=0.9692，說明該模型所得出的預(yù)測值有較好的可信度。校正后的決定系數(shù)Radj2=0.9383，與R2接近。因此可以用于優(yōu)化試驗設(shè)計與結(jié)果分析，以確定超聲波輔助復(fù)合酶法水解蝦頭蛋白的最佳工藝。A、B、C、D、AB、BD、 A2、B2、C2、D2的F值均小于0.01，AD、CD的F值大于0.01且小于0.05，其他因子均為不顯著。各試驗因素對蝦頭蛋白的水解度大小的影響依次是A＞C＞B＞D，即pH＞超聲功率＞酶解溫度＞超聲時間。

2.2.2 響應(yīng)曲面圖和等高線圖分析

圖9 pH與酶解溫度

由圖9可知，該響應(yīng)面的坡度大且等高線的形狀不圓但較扁，說明pH與酶解溫度的交互作用很強。pH坡度更大且等高線聚積，說明酶解溫度比前者的影響略低。

圖10 pH與超聲功率

由圖10可知，等高線圖形狀略圓，pH與超聲功率的交互作用對響應(yīng)值的影響不大。pH的坡度比超聲功率更大且等高線堆積在pH方向，說明pH對水解度的作用更大。

圖11 pH與超聲時間

圖11 pH與超聲時間

由圖11可知，pH與超聲時間共同作用對響應(yīng)值有較大的影響。pH曲面坡度更大且等高線向pH聚積，說明pH對水解度的影響比超聲時間更大。

圖12 酶解溫度與超聲功率

由圖12可知，該響應(yīng)面的曲面略平滑、等高線的形狀略扁，說明酶解溫度與超聲功率的交互作用對提取蝦頭蛋白的影響不大。

由圖13可知，該響應(yīng)面不平滑，并且等高線的形狀說明酶解溫度與超聲時間的交互作用極顯著。酶解溫度曲面坡度更大且其對應(yīng)的等高線更集中，說明酶解溫度對水解度的影響比超聲時間大。

圖13 酶解溫度與超聲時間

圖14 超聲功率與超聲時間

由圖14可知，超聲功率與超聲時間的交互作用顯著。超聲功率的坡度更大且等高線靠超聲功率方向匯集，說明超聲功率對水解度的影響比超聲時間略大。

因此，由上述圖可看出以上4因素對水解度的影響極顯著，與方差分析基本一致。并且可以從6個等高線圖看出，最佳的pH應(yīng)在7.5～8.0之間、最佳的酶解溫度范圍是45～50 ℃、最佳的超聲功率在174～180 W以及最佳的超聲時間應(yīng)在25～30 min范圍內(nèi)。

2.3 驗證實驗

通過此模型預(yù)測超聲波輔助酶法提取蝦頭蛋白水解液的最佳工藝條件是pH7.67、酶解溫度49.09 ℃、超聲功率176.29 W以及超聲時間29.32min，蝦頭蛋白水解度的預(yù)測值為43.6684。考慮到實際情況，對上述條件進行修正，最終的優(yōu)化條件為pH7.5、酶解溫度50 ℃、超聲功率180 W以及超聲時間30 min。根據(jù)最佳工藝條件，再做三次重復(fù)試驗進行驗證，水解度的平均值為42.5，與預(yù)測值接近，從而進一步驗證了試驗結(jié)果，說明優(yōu)化的超聲和酶解條件可行。

3 結(jié)論

超聲波輔助雙蛋白酶法提取蝦頭蛋白的最佳提取工藝條件為：蝦頭泥以料液比1∶10（g/mL）調(diào)配→pH調(diào)節(jié)為7.5→超聲功率180 W下處理30 min→料液中添加1%堿性蛋白酶和0.1%中性蛋白酶→50 ℃下酶解時間3 h→加熱煮沸10 min→4000 r/min下離心20 min→取上清液，即水解蛋白液；該工藝條件下，蝦頭蛋白水解度可達到42.5%。實驗過程發(fā)現(xiàn)，當超聲時間由10 min上升到30 min和超聲功率從150 W上升至180 W時，水解度可顯著性增加。因此，超聲輔助雙蛋白酶水解法是提取蝦頭蛋白的有效方法。