李 楊 陳凡凡 王中江 滕 飛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(Soy protein isolate，SPI)是一種全價(jià)蛋白[1]，常作為乳化劑應(yīng)用于乳制品、肉制品和面制品中，通過降低水和油的表面張力、水和空氣的表面張力，達(dá)到改善食品風(fēng)味、顏色、質(zhì)地和儲(chǔ)存穩(wěn)定性以及提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的[2-3]。在加熱、殺菌、干燥等加工過程中，蛋白質(zhì)極易受到溫度的影響，進(jìn)而發(fā)生構(gòu)象改變，造成蛋白功能活性的衰減，而熱聚集體的形成是導(dǎo)致蛋白喪失某些生物和功能特性(如蛋白的溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性)的重要原因[4-6]。熱聚集體的形成主要包括兩個(gè)階段：分子解聚成亞基形式，隨后亞基逐漸去折疊，此時(shí)分子內(nèi)部疏水殘基逐漸暴露，表面巰基含量增高；當(dāng)這些分子累積的能力足夠彼此接近以實(shí)現(xiàn)聚合物形成時(shí)，去折疊的亞基通過疏水相互作用迅速聚集形成聚集體[7]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)熱誘導(dǎo)聚集領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究，考察了熱誘導(dǎo)聚集對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響[8]，并嘗試通過各種物理方法來解聚熱聚集體，以達(dá)到提高蛋白質(zhì)功能特性的目的[9]，但對(duì)于調(diào)控?zé)嵴T導(dǎo)可溶性聚集體形成的研究較少。

超聲作為一種非熱物理加工技術(shù)，能產(chǎn)生局部的空化效應(yīng)，改變分子間氫鍵、范德華力、疏水性等維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用力，促進(jìn)蛋白構(gòu)象改變，進(jìn)而引起蛋白乳化特性的改變，因此引起廣泛關(guān)注。超聲技術(shù)應(yīng)用范圍較廣[10]，蛋白經(jīng)過超聲處理后，其溶解度發(fā)生變化[11]，且超聲對(duì)蛋白的作用分為兩種：一種是蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)修飾，以增強(qiáng)功能性，然后應(yīng)用于生產(chǎn)；另一種是將超聲直接作用于生產(chǎn)體系，增強(qiáng)蛋白與其他物質(zhì)結(jié)合的穩(wěn)定性。目前，關(guān)于超聲改性提高蛋白特性的研究較多，研究發(fā)現(xiàn)，超聲處理可提高米糠蛋白溶解性和乳化性[12]、破壞黑豆蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部疏水作用、解聚和重組黑豆蛋白結(jié)構(gòu)[13]，而適當(dāng)?shù)某暪β屎统晻r(shí)間會(huì)使黑豆蛋白的粒徑最小化、電位絕對(duì)值最大化、蛋白表面疏水性提高[14]。研究表明超聲可用于改性蛋白增加蛋白功能特性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，但經(jīng)超聲處理的蛋白進(jìn)行熱處理后，其結(jié)構(gòu)和功能特性變化的相關(guān)研究卻未見報(bào)道。蛋白自身特性可直接影響加工生產(chǎn)中的構(gòu)象改變和功能特性發(fā)揮，本文將超聲技術(shù)作用于大豆蛋白，然后將處理后的蛋白進(jìn)行常規(guī)加工的熱誘導(dǎo)處理，利用超聲穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的特性，抑制蛋白因過熱處理而發(fā)生的聚集，進(jìn)而提高蛋白的功能特性，以解決熱誘導(dǎo)引起蛋白功能衰減的難題。

本文以超聲處理為預(yù)處理技術(shù)，并對(duì)超聲后的蛋白進(jìn)行熱誘導(dǎo)，探究超聲處理對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)特性(微觀結(jié)構(gòu)、粒徑分布、官能團(tuán)、二三級(jí)結(jié)構(gòu)、電位、疏水性)和乳化特性(乳化性和乳化穩(wěn)定性)的影響，分析蛋白結(jié)構(gòu)的改變與蛋白乳化特性的關(guān)系。研究超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)蛋白熱聚集的抑制效果，并探究其原因，為解決熱效應(yīng)造成蛋白熱聚集而使蛋白功能衰退的難題提供方法和理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白(純度91.12%)，山東禹王集團(tuán)；2,4-二硝基苯肼，天津博迪化工股份有限公司；三氯乙酸，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；疊氮化鈉，山東浩中化工有限公司；乙酸乙酯，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；β-巰基乙醇、過硫酸銨，Geniview公司；2-硝基苯甲酸(DTNB)、乙二胺四乙酸(EDTA)，天津市博迪化工有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)，廣州奈姆塔貿(mào)易有限公司；8-苯胺萘磺-1-酸鹽(ANS)，上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司；尿素(Urea)試劑，武漢博士康生物工程有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，索萊寶生物科技有限公司。其他試劑均為分析純等級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Biosafer 650-92型超聲波細(xì)胞破碎儀，江蘇賽飛信息技術(shù)有限公司；HH-6型數(shù)顯水浴鍋，山東愛博科技貿(mào)易有限公司；LW-1600FC型紫外可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；Zetasizer Nano ZSP型馬爾文納米粒度電位儀，馬爾文儀器公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；MAGNA-IR560型傅里葉變換紅外光譜，美國尼高力公司；Ultra-Turrax T25型高速分散器，德國IKA公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；PHSJ-4A型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；XW-80A型旋渦混合器，上海青浦滬西儀器廠；GL10M型立式高速冷凍離心機(jī)主機(jī)，北京新諾立華儀器有限公司；FJ200-S型數(shù)顯高速均質(zhì)機(jī)，邢臺(tái)浩誠科技開發(fā)有限公司。

1.3 蛋白超聲預(yù)處理和加熱誘導(dǎo)處理

利用0.01 mol/L、pH值7.4的磷酸鹽緩沖溶液將大豆分離蛋白(SPI)溶液(含0.5 mg/mL NaN3)質(zhì)量濃度調(diào)配為10 mg/mL，超聲(對(duì)照；6 min， 200 W；6 min，400 W；6 min，600 W； 12 min，600 W；24 min，600 W)處理之后轉(zhuǎn)移至100℃恒溫箱中20 min，誘導(dǎo)大豆蛋白發(fā)生熱聚集。將熱聚集液體于低溫離心機(jī)中9 000 r/min離心20 min，棄去沉淀物后留存上清液經(jīng)過24 h冷凍干燥后即可得到6種可溶性蛋白樣品，再加上可溶性大豆分離蛋白(SSPI)(蛋白溶液經(jīng)離心凍干所制)，即7個(gè)樣品，分別記為SSPI、STSPI、6 min 200 W-STSPI、6 min 400 W-STSPI、6 min 600 W-STSPI、12 min 600 W-STSPI和24 min 600 W-STSPI。

1.4 蛋白的微觀結(jié)構(gòu)

通過掃描電鏡對(duì)樣品的表面形貌進(jìn)行觀察。將樣品均勻平攤在貼有導(dǎo)電膠的樣品臺(tái)上，噴金處理，觀察成像時(shí)加速電壓為20 kV，觀測(cè)倍數(shù)為10 000。

1.5 粒徑分布測(cè)定

將可溶性蛋白溶于水中配成質(zhì)量濃度為0.05 g/mL的溶液，攪拌均勻后，緩慢加入測(cè)量池中，用儀器測(cè)量其粒徑電位和蛋白質(zhì)分散度指數(shù)(PDI)。

1.6 濁度的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]的方法，并稍作修改。將樣品溶于去離子水中配制成所需的濃度，在室溫(20℃)下磁力攪拌60 min。分光光度計(jì)在600 nm下測(cè)定其吸光度。以去離子水作空白，測(cè)定其吸光度A，濁度計(jì)算公式為

(1)

式中V——稀釋倍數(shù)

I——光程距離，取0.01 m

1.7 游離氨基含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[16]的方法，并稍作修改。400 mg OPA試劑充分溶解于1 mL甲醇溶液中，而后依次向溶液中加入預(yù)先配置的質(zhì)量濃度為200 g/L的SDS溶液2.5 mL及質(zhì)量濃度為0.1 mol/L的硼酸溶液25 mL，繼而轉(zhuǎn)移至通風(fēng)櫥內(nèi)加入100 μL的β-巰基乙醇，最后將溶液用蒸餾水定容至50 mL，制備成OPA溶液用于后續(xù)檢測(cè)分析，量取OPA試劑4 mL與200 μL蛋白樣品充分混勻后進(jìn)行35℃水浴處理2 min，以蒸餾水空白組為對(duì)照在340 nm處測(cè)定吸光度。

1.8 游離巰基和二硫鍵含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]的方法，并稍作修改。稱取400 mg的DTNB，加入Tris-Gly(氨丁三醇-甘氨酸)緩沖液定容至100 mL，配成Ellman試劑。分別稱取2 mg樣品溶解于2 mL的Tris-Gly緩沖液(pH值8.0)和0.02 mL的Ellman試劑。測(cè)定時(shí)溶液振蕩快速混合后在25℃下保溫反應(yīng)15 min，用分光光度計(jì)測(cè)定其在412 nm處的吸光度，以不加Ellman試劑為空白。將樣品用磷酸鹽緩沖液配制成0.5 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，置于10 mL塑料離心管中，加入2.5 mL含8 mol/L尿素的Tris-Gly(10.4 g Tris，6.9 g Gly，每1 L加1.2 g EDTA，pH值8.0)，每隔1.5 min加入20 μL DTNB(0.004 g DTNB用Tris-Gly溶解定容至1 mL，避光)，反應(yīng)25 min，立即在412 nm處測(cè)吸光度。對(duì)照組不加蛋白質(zhì)溶液，其他處理方法相同。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.050 2x-0.000 9，R2=0.999 4)計(jì)算出蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度ρ。摩爾消光系數(shù)取13 600 L/(mol·cm)，巰基質(zhì)量摩爾濃度計(jì)算公式為

(2)

式中S——巰基質(zhì)量摩爾濃度，μmol/g

A412——加Ellman試劑時(shí)412 nm處樣品的吸光度

D——稀釋系數(shù)

C——樣品蛋白最終質(zhì)量濃度，mg/mL

1.9 羰基含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]的方法，并稍作修改。將蛋白用去離子水配制為5 mg/mL的蛋白溶液，以雙縮脲指示劑法測(cè)定蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度(y=0.241 2x+0.013 5,R2=0.997)。在367 nm處用2, 4-二硝基苯肼比色法進(jìn)行比色，每毫克蛋白質(zhì)羰基衍生物的摩爾數(shù)通過摩爾消光系數(shù)22 000 L/(mol·cm)進(jìn)行計(jì)算，公式為

(3)

式中G——蛋白羰基質(zhì)量摩爾濃度，nmol/mg

n——稀釋因子

A367——367 nm處吸光度

E——蛋白質(zhì)溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL

1.10紅外光譜分析

參照文獻(xiàn)[19]的方法，并稍作修改。將凍干樣品置于干燥器內(nèi)充分干燥，稱取1 mg樣品于100 mg溴化鉀中混勻，在瑪瑙研堝中研磨并用壓片器壓片，于紅外光譜儀中測(cè)定吸收光譜。測(cè)量條件：波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，波數(shù)精度0.01 cm-1，掃描次數(shù)64次，環(huán)境溫度25℃。

1.11內(nèi)源性光譜分析

參照文獻(xiàn)[20]的方法，并稍作修改。稱取一定量樣品于5 mmol磷酸緩沖液(pH值 7.0)配成質(zhì)量濃度為0.001 g/mL的溶液，取適量樣品置于熒光分光光度計(jì)中測(cè)量。測(cè)量條件：激發(fā)波長290 nm，發(fā)射波長300～400 nm，狹縫寬均為5 nm，電壓為700 mV。

1.12Zeta電位的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[21]的測(cè)定方法，并稍作修改。采用Zetasizer Nano ZSP型馬爾文納米粒度電位儀對(duì)蛋白溶液的Zeta電位進(jìn)行測(cè)定。將蛋白樣品分散到50 mmol/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液中，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的蛋白溶液，取樣量為3 mL，測(cè)定溫度為25℃。

1.13 表面疏水性指數(shù)H0測(cè)定

參照文獻(xiàn)[22]的ANS熒光探針法測(cè)定樣品表面疏水性的方法，并稍作修改。用0.1 mol/L的中性磷酸鹽緩沖溶液稀釋，10 000 r/min高速離心處理0.5 h除去沉淀物，以Lowery法分析測(cè)試上清液中蛋白濃度，通過磷酸鹽緩沖液的逐步稀釋，調(diào)控蛋白溶液質(zhì)量濃度至0.05～0.4 mg/mL，取40 μL濃度為8 mmol/L的ANS溶液滴加至不同濃度的蛋白溶液4 mL，經(jīng)振蕩混勻后靜置3 min，在熒光分光光度計(jì)下進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)試，測(cè)試條件為：激發(fā)波長λex=390 nm，發(fā)射波長λem=468 nm，掃描夾縫寬度設(shè)置為5 nm，掃描速度設(shè)置為10 nm/s。將熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)量濃度作線性圖，初始段的斜率計(jì)為樣品的表面疏水性指數(shù)。

1.14乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[23]的方法，并稍作修改。在測(cè)試管中分別加入15 mL質(zhì)量濃度0.001 g/mL蛋白質(zhì)溶液和5 mL玉米油，乳液經(jīng)高速均質(zhì)機(jī)(24 000 r/min)處理1 min后，從測(cè)試管底部取出50 μL乳液，用0.001 g/mL的SDS溶液稀釋100倍后，于500 nm比色。乳化性指數(shù)EAI和乳化穩(wěn)定性指數(shù)ESI的計(jì)算公式為

(4)

(5)

式中EAI——乳化性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

F——稀釋因子，取100

A0—— 0 min時(shí)的吸光度

A30——30 min時(shí)的吸光度

H——蛋白質(zhì)量濃度，g/mL

φ——光程，取0.01 m

θ——油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)，取25%

1.15數(shù)據(jù)處理和分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)平行實(shí)驗(yàn)，利用SPSS Statistics 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，以P<0.05為顯著性差異。采用Origin 9.1軟件、Peak Fit 4.12軟件等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性蛋白的微觀結(jié)構(gòu)變化

由圖1箭頭指出的孔洞結(jié)構(gòu)可知，SPI在經(jīng)過熱處理后由片狀結(jié)構(gòu)聚集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；隨著超聲功率的增大，USTSPI微觀圖中箭頭所指的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)由松散雜亂逐漸變得致密且孔洞均勻；但當(dāng)超聲功率不變，隨著超聲時(shí)間的增大，超聲后熱可溶性蛋白的結(jié)構(gòu)逐漸由致密均勻逐漸變得松散。這表明超聲處理可以影響蛋白的聚集效果，進(jìn)而影響蛋白的微觀結(jié)構(gòu)[24]。

圖1 超聲預(yù)處理對(duì)蛋白微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of ultrasonic pretreatment on microstructure of protein

2.2 熱處理對(duì)預(yù)處理蛋白粒徑的影響

由圖2和表1可知，與SSPI相比，STSPI的平均粒徑、PDI和濁度均顯著增大，且粒徑分布圖由原來的單峰變成了三峰；與STSPI相比，經(jīng)過超聲預(yù)處理的蛋白在熱誘導(dǎo)時(shí)粒徑、PDI和濁度顯著降低，隨著超聲功率的增大，其粒徑分布圖逐漸左移，且STSPI最右側(cè)峰消失，表中平均粒徑、濁度和PDI逐漸減小；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時(shí)間的增大，粒徑分布圖逐漸右移，平均粒徑、PDI和濁度呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)。

圖2 超聲預(yù)處理對(duì)蛋白粒徑分布的影響Fig.2 Effect of ultrasonic pretreatment on protein particle size distribution

加熱處理可使蛋白先解聚后聚集，導(dǎo)致粒徑、PDI和濁度增大。而超聲預(yù)處理使蛋白發(fā)生一定程度的疏水性基團(tuán)暴露，增強(qiáng)顆粒間的靜電排斥力，從而提高蛋白質(zhì)分散體系的穩(wěn)定性[14]。超聲功率越大，蛋白疏水性基團(tuán)暴露得越明顯，分子間斥力越大，抑制熱聚集體形成的效果越明顯[25]。而超聲時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致蛋白分子在疏水作用力的情況下發(fā)生聚合，溶液穩(wěn)定性變差，從而降低了抑制熱聚集體形成的效果，并促進(jìn)小分子聚集體向中等大小聚集體轉(zhuǎn)變。粒徑分布圖可在一定程度上反映蛋白粒度的分布狀況，而PDI 則反映粒徑分布范圍，而溶液濁度可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度，可從側(cè)面衡量蛋白質(zhì)相互作用大小及聚集體的相對(duì)尺寸。圖2中超聲預(yù)處理后峰圖較STSPI左移，且大顆粒峰圖消失，顆粒分布較為集中。從表1可知，經(jīng)過超聲預(yù)處理的蛋白PDI處于0.25～0.35之間，較SSPI的0.52和STSPI的0.58小，經(jīng)過超聲預(yù)處理的蛋白濁度也顯著降低。粒徑、PDI和濁度的變化趨勢(shì)說明超聲預(yù)處理在一定程度抑制了蛋白熱聚集，且超聲功率和時(shí)間的不同對(duì)熱誘導(dǎo)聚集抑制程度不同。

表1 超聲預(yù)處理對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響Tab.1 Effect of ultrasonic pretreatment on protein structure

注：同列中相同字母表示數(shù)據(jù)差異不顯著(P>0.05)，不同則表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3 可溶性蛋白游離氨基和羰基含量的測(cè)定

蛋白結(jié)構(gòu)在受熱展開的過程中，埋藏在分子內(nèi)部的氨基側(cè)鏈暴露并很快被氧化生成羰基結(jié)構(gòu)，氨基含量和羰基含量在一定程度上可用來表征蛋白結(jié)構(gòu)的展開程度和氧化程度[26]。巰基基團(tuán)(—SH)是蛋白中重要的功能基團(tuán)，其含量變化可反映蛋白質(zhì)的變性程度，對(duì)其功能性質(zhì)的發(fā)揮具有很重要的作用[27]。如表2所示，與可溶性SPI相比，可溶性TSPI的游離氨基、游離巰基和總巰基含量減少，而羰基和二硫鍵含量增多；與STSPI相比，隨著超聲功率的增大，其游離氨基和巰基呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，而羰基含量和二硫鍵含量呈現(xiàn)減小趨勢(shì)；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時(shí)間的增大，游離氨基和巰基含量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，而羰基含量先增大后減小，二硫鍵含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。

表2 游離氨基、巰基、二硫鍵和羰基含量Tab.2 Free amino, sulfhydryl, disulfide and carbonyl contents

蛋白溶液在進(jìn)行熱處理時(shí)，當(dāng)?shù)鞍拙奂潭雀哂诮饩蹠r(shí)，巰基基團(tuán)部分轉(zhuǎn)換為二硫鍵，部分被重新掩藏，導(dǎo)致巰基含量降低，二硫鍵含量增加。蛋白結(jié)構(gòu)在展開過程中產(chǎn)生的部分氨基因氧化生成新的羰基基團(tuán)[26,28]，羰基含量增多。已有研究證實(shí)，超聲波的空化效應(yīng)和剪切力可將大聚集體解聚轉(zhuǎn)化為小聚集體，提高蛋白表面疏水性，增大巰基的暴露量，破壞分子間二硫鍵形成游離巰基[25]，增加蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷，增強(qiáng)顆粒間靜電排斥，并提高蛋白質(zhì)分散體的穩(wěn)定性[14]，抑制蛋白聚集，進(jìn)而減少羰基量。當(dāng)超聲功率為600 W和超聲時(shí)間為6 min時(shí)疏水性基團(tuán)的暴露量達(dá)到最大值，超聲功率和時(shí)間持續(xù)增大，存在過量的自由基，促進(jìn)羰基的形成[29]。蛋白之間非共價(jià)相互作用推動(dòng)蛋白顆粒聚集，游離巰基和游離氨基減少，二硫鍵含量增多。

2.4 可溶性蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組分含量測(cè)定

傅里葉變換紅外光譜是表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要技術(shù)方法之一。熱處理可斷開蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)中的氫鍵，使α-螺旋結(jié)構(gòu)減少[30]，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)(β1+β2)含量增多。而反向平行的折疊結(jié)構(gòu)(β1)通常在聚集的蛋白質(zhì)分子間形成[31]，在一定程度上可表征蛋白的聚集程度。如圖3和表3所示，與SSPI相比，STSPI的β1結(jié)構(gòu)增多，α-螺旋和γ-無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)均減少；隨著超聲功率的增大，β1呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，α-螺旋和γ-無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增多；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時(shí)間的增大，β1增多，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和γ-無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)均減少。

圖3 蛋白的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of protein

表3 超聲預(yù)處理對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Tab.3 Effect of ultrasonic pretreatment on secondary structure of protein

研究表明，超聲功率和超聲時(shí)間的增大可能增加了蛋白質(zhì)上的負(fù)表面電荷，而顆粒的有效表面電荷主要決定了它們的分散和聚集[32]，增強(qiáng)顆粒間靜電排斥，并提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[14]。與STSPI相比，超聲后再經(jīng)熱誘導(dǎo)的可溶性蛋白β-折疊(尤其是β1)結(jié)構(gòu)減少，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增多，可能與超聲使蛋白表面電荷增多抑制蛋白受熱聚集有關(guān)[25]。當(dāng)超聲條件為600 W、6 min時(shí)抑制蛋白聚集的能力達(dá)到最大，β1蛋白結(jié)構(gòu)達(dá)到最小值。當(dāng)超聲時(shí)間進(jìn)一步增大時(shí)，β-折疊結(jié)構(gòu)增加[14]，同時(shí)伴隨著聚集體中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，抑制聚集的能力減弱，這可能是局部氨基酸序列之間和部分分子之間相互作用被破壞所致[33]。這表明適當(dāng)?shù)某曨A(yù)處理可在一定程度上抑制蛋白發(fā)生熱聚集，這與之前的研究結(jié)果一致。

2.5 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化可以通過內(nèi)源性熒光的最大吸收波長的變化來確定[34]。由圖4可知，與SSPI相比，STSPI的最大吸收波長出現(xiàn)藍(lán)移現(xiàn)象；超聲預(yù)處理后再經(jīng)過熱處理得到的可溶性蛋白，與STSPI相比，隨著超聲功率的增大，蛋白最大吸收波長出現(xiàn)不同程度紅移；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時(shí)間的增大，蛋白最大吸收波長出現(xiàn)藍(lán)移。加熱誘導(dǎo)蛋白聚集時(shí)，隨著溫度的增大，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生聚集，發(fā)色基團(tuán)被掩藏，最大吸收波長發(fā)生藍(lán)移[18]。隨著超聲功率增大，蛋白發(fā)生的紅移現(xiàn)象可能與超聲使蛋白結(jié)構(gòu)柔性打開和伸展，暴露出疏水性基團(tuán)和帶電粒子，穩(wěn)定的蛋白結(jié)構(gòu)抑制蛋白進(jìn)一步發(fā)生聚集有關(guān)，使蛋白暴露的發(fā)色基團(tuán)較STSPI多，進(jìn)而發(fā)生紅移[35]。當(dāng)超聲功率和超聲時(shí)間為600 W和6 min時(shí)，疏水性基團(tuán)達(dá)到穩(wěn)定值，蛋白溶液狀態(tài)達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定態(tài)臨界值。但隨著超聲時(shí)間的進(jìn)一步增加，較高的疏水相互作用促使蛋白聚集，最大吸收波長較6 min 600 W-STSPI出現(xiàn)藍(lán)移。

圖4 超聲預(yù)處理對(duì)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of ultrasonic pretreatment on tertiary structure of protein

2.6 蛋白表面疏水性的測(cè)定

Zeta電位通常被用來表征溶液體系的穩(wěn)定性，絕對(duì)值越大溶液越穩(wěn)定，而表面疏水性變化側(cè)面反映了大豆蛋白的結(jié)構(gòu)變化[8]，且對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、構(gòu)象和功能至關(guān)重要。由表4可知，與SSPI相比，STSPI的表面疏水性指數(shù)和電位絕對(duì)值增大；與STSPI相比，超聲預(yù)處理蛋白電位絕對(duì)值整體減小，且隨著超聲功率的增大，蛋白的表面疏水性指數(shù)和電位絕對(duì)值呈現(xiàn)增大趨勢(shì)；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時(shí)間的增大，蛋白的電位絕對(duì)值呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，表面疏水性指數(shù)先增大后減小，且在6 min 600 W-STSPI電位絕對(duì)值達(dá)到最大值，在12 min 600 W-STSPI表面疏水性指數(shù)達(dá)到最大值。

表4 超聲預(yù)處理對(duì)蛋白電位和表面疏水性的影響Tab.4 Effect of ultrasonic pretreatment on protein potential values and surface hydrophobicity

熱處理可以打開蛋白結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水殘基和帶電基團(tuán)暴露，電位絕對(duì)值增大，而蛋白疏水相互作用的增大可促進(jìn)蛋白發(fā)生聚集，導(dǎo)致蛋白表面疏水性降低[36]，表中STSPI的表面疏水性高于SSPI可能與蛋白聚集方式發(fā)生變化導(dǎo)致部分疏水性基團(tuán)仍處于暴露態(tài)有關(guān)。超聲預(yù)處理導(dǎo)致電位絕對(duì)值整體減小，側(cè)面反映了超聲抑制聚集的作用。隨著超聲功率增大，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)子去折疊，從而導(dǎo)致最初在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)數(shù)量增加并暴露于極性周圍環(huán)境[14]，增大空氣和水的界面面積，干擾分子間氫鍵和疏水相互作用[24]，同時(shí)游離官能團(tuán)和帶電粒子數(shù)量的增多，增大了溶液中的靜電作用力，進(jìn)而增加溶液穩(wěn)態(tài)，抑制了蛋白熱誘導(dǎo)聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致表面疏水性和電位絕對(duì)值增大[14]。且當(dāng)處理功率和時(shí)間達(dá)到600 W、6 min時(shí)抑制能力達(dá)到最大，蛋白溶液狀態(tài)達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定態(tài)臨界值。隨著超聲時(shí)間的進(jìn)一步增加，蛋白的抑制能力減弱，高功率超聲波處理可能會(huì)增加蛋白結(jié)合程度，進(jìn)而降低蛋白分散體穩(wěn)定性，導(dǎo)致電位絕對(duì)值和表面疏水性減小[37]。

2.7 蛋白乳化性的測(cè)定

蛋白質(zhì)分子因具有疏水和親水的基團(tuán)，從而能夠分別作用于油相和水相，起到乳化劑的作用。蛋白質(zhì)的熱聚集會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的乳化性。如圖5(圖中同一參數(shù)不同字母表示差異顯著)所示，與SSPI相比，STSPI的乳化性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)降低；超聲預(yù)處理后再經(jīng)過熱處理得到的可溶性蛋白，與STSPI相比，隨著超聲功率的增大，蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)增大趨勢(shì)；與6 min 600 W-STSPI相比，隨著超聲時(shí)間的增大，蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，且在6 min、600 W時(shí)乳化性和乳化穩(wěn)定性達(dá)到最大值。

圖5 超聲預(yù)處理對(duì)蛋白乳化特性的影響Fig.5 Effect of ultrasonic pretreatment on protein emulsifying properties

熱誘導(dǎo)降低了蛋白質(zhì)分子疏水性指數(shù)/親水性指數(shù)比值，蛋白質(zhì)分子柔韌性降低，在油水界面不能迅速展開，進(jìn)而降低了大豆蛋白的乳化性。超聲功率和超聲時(shí)間的增大可減小蛋白的粒徑和增大蛋白的比表面積，增加分子間靜電斥力和疏水相互作用，提高蛋白溶液穩(wěn)定性，抑制蛋白聚集，提高乳液界面吸附蛋白能力，進(jìn)而增強(qiáng)乳化性和乳化穩(wěn)定性[38-39]。當(dāng)超聲時(shí)間和功率增大到6 min、600 W時(shí)，蛋白的疏水性基團(tuán)的暴露量達(dá)到臨界值。隨著超聲時(shí)間的增大，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部疏水相互作用的破壞增加和蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的加速使蛋白逐漸發(fā)生聚集，乳液界面上大分子顆粒蛋白極易被小分子蛋白置換，乳液界面張力增大，乳液發(fā)生絮凝，造成乳化性和乳液穩(wěn)定性下降。

3 結(jié)論

(1)與SSPI相比，STSPI的平均粒徑、PDI和濁度分別升高了373.47 nm、0.06和303.69；官能團(tuán)中二硫鍵和羰基質(zhì)量摩爾濃度分別升高了0.16 μmol/g和0.34 nmol/mg，游離巰基和氨基質(zhì)量摩爾濃度分別降低0.34 μmol/mg和0.08 μmol/g；二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)減少，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，β1結(jié)構(gòu)相對(duì)含量提高了3.37個(gè)百分點(diǎn)；乳化性和乳化穩(wěn)定性指數(shù)分別降低了16.77 m2/g和60.03 min，表面疏水性指數(shù)提高了113.21。這表明熱聚集體可改變蛋白結(jié)構(gòu)，并降低蛋白的乳化特性。

(2)與STSPI相比，經(jīng)過超聲預(yù)處理(6 min、 600 W)的蛋白在進(jìn)行熱處理后，其平均粒徑、PDI、電位絕對(duì)值和濁度顯著降低，而α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)、表面疏水性、乳化性和乳化穩(wěn)定性提高，微觀結(jié)構(gòu)變得均勻致密。這表明適當(dāng)?shù)某曨A(yù)處理可抑制因蛋白聚集而導(dǎo)致蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而防止蛋白因熱聚集導(dǎo)致蛋白乳化特性的降低，這為解決因加熱引起蛋白乳化特性衰減問題提供了方法和理論。