郝亞鋒，王漢杰

(天津大學生命科學學院，天津 300072)

干擾特定蛋白表達是研究蛋白質功能的重要途徑，也是用于治療由蛋白異常表達引起的相關疾病的重要措施。近年來,干擾特定蛋白表達技術的發(fā)展引起了生命科學技術領域的變革，從最早出現(xiàn)的通過封閉靶蛋白的活性位點發(fā)揮作用的化學抑制劑到基于DNA與RNA水平發(fā)揮作用的RNAi技術[1]與CRISPR-Cas9技術[2]等，都在一定程度上發(fā)揮了敲低目標蛋白的功能。然而隨著研究的深入也暴露了技術的局限性：化學抑制劑只有在高濃度化合物的作用下與目標蛋白的活性位點結合才能發(fā)揮效應[3]，具有很高的細胞毒性[4]；RNAi技術與CRISPR-Cas9技術雖然在一定程度上解決了化學抑制劑的缺陷，但是容易產生脫靶效應[5]，作為一種間接方式，干擾特定蛋白表達所需的時間較長，導致細胞有足夠長的時間激活補償機制，恢復原有的蛋白質水平[6-7]，同時也無法確定目的蛋白表達量的下降是否與基因水平早期缺陷有關。

靶向蛋白質降解技術(targeted protein degradation technology)是近年來發(fā)展起來的干擾蛋白質功能、維持胞內蛋白質穩(wěn)態(tài)的新技術。與上述技術相比，靶向蛋白質降解技術是調控蛋白表達最直接和有效的方式之一，其可特異性地識別靶蛋白，利用細胞內固有的蛋白質降解途徑直接在蛋白質水平降解靶蛋白，提高了敲除靶蛋白的效率以及省略了長時間調控過程中產生的中間效應，為研究特定蛋白質的功能和治療由蛋白異常表達引起的疾病提供了新方法，因此逐漸受到研究者的關注。靶向蛋白質降解技術從誕生起，便不斷獲得優(yōu)化，在生物醫(yī)學研究中得到廣泛應用。然而隨著研究的深入，現(xiàn)有的靶向蛋白質降解技術也面臨著新的機遇和挑戰(zhàn)，探索更加安全、高效、精準、可控的新型靶向蛋白質降解技術成為當前研究的主要方向。

1 細胞內固有的蛋白質降解途徑

細胞中的蛋白質穩(wěn)態(tài)主要依賴細胞內固有的蛋白質降解途徑的協(xié)調運作維持，即分子伴侶蛋白系統(tǒng)與兩個蛋白質水解系統(tǒng)，其中自噬-溶酶體途徑(autophagy-lysosome pathway)和泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)在蛋白質降解中發(fā)揮著重要的生物學功能。

1.1 自噬-溶酶體途徑

自噬-溶酶體途徑是非特異性蛋白質降解途徑，主要與表面膜蛋白和胞吞的胞外蛋白質、完整細胞器和蛋白多聚體的降解相關，在調控細胞內蛋白質降解中不發(fā)揮主要作用。溶酶體是真核細胞內重要的細胞器，屬于內膜系統(tǒng)的重要組成組分，內含多種酸性水解酶，能夠分解蛋白質、核酸、多糖及脂類等。其主要作用機理為：當細胞受到饑餓、壓力、高溫、低氧、細胞器損壞、蛋白質突變或者微生物感染等條件的刺激，會引發(fā)細胞自噬，蛋白質等大分子在溶酶體的酸性環(huán)境中被相應的酶降解，然后通過溶酶體膜的載體蛋白運送至胞液的代謝庫[8]。

1.2 泛素-蛋白酶體途徑

泛素-蛋白酶體途徑是細胞內最重要的蛋白質降解途徑，具有高度特異性和選擇性[9]，是細胞內環(huán)境穩(wěn)定的關鍵調節(jié)因素，負責降解細胞80%的正?；虍惓５牡鞍譡10]，并在細胞周期調控、信號轉導、核酸密碼翻譯等多種生命過程中發(fā)揮重要作用[11]，是目前細胞內參與靶向蛋白質降解技術的主要途徑。

泛素-蛋白酶體途徑主要包括：泛素(ubiquitin,Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme,E1)、泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2)、泛素連接酶(ubiquitin ligase,E3)、26S蛋白酶體(26S proteasomes)、去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)等。

泛素-蛋白酶體途徑的主要作用機理(圖1)：E1利用ATP水解釋放的能量，通過其活性中心的半胱氨酸殘基與泛素的C端形成硫酯鍵活化單個游離的泛素，并將泛素呈遞給E2，E3具有特異性識別靶蛋白的能力，其通過招募底物蛋白和E2，介導泛素從E2轉移到靶蛋白并與靶蛋白共價結合，蛋白酶體催化泛素與靶蛋白的偶連體降解。泛素-蛋白酶體途徑的作用過程屬于可逆過程，其通過E1、E2、E3與DUBs共同維持平衡。單泛素化不能介導靶蛋白降解，只起到一定程度的調節(jié)作用，只有當4個及4個以上被激活的泛素分子連接到靶蛋白上形成多聚泛素鏈時，底物才能被輸送至蛋白酶體進行降解，而多聚泛素鏈在泛素再循環(huán)酶的作用下分解成單個泛素分子，重新循環(huán)利用。

圖1 泛素-蛋白酶體途徑的主要作用機理Fig.1 Main reaction mechanism of ubiquitin-proteasome pathway

2 靶向蛋白質降解技術的發(fā)展與應用

靶向蛋白質降解技術從誕生起就受到了研究者的廣泛關注，其發(fā)展歷經了從無選擇性的熱休克蛋白抑制劑、到意外發(fā)現(xiàn)的選擇性雌激素受體降解劑(selective estrogen receptor modulator,SERM)、到機理未知的疏水性標簽(hydrophobic tagging,HyT)、再到被廣泛應用于多種生物醫(yī)學研究的蛋白降解靶向嵌合體(proteolytic targeting chimera,PROTAC)技術，在研究過程中不斷完善和發(fā)展。

2.1 選擇性雌激素受體降解劑

氟維司群(Fluvestrant)，是一種意外發(fā)現(xiàn)的SERM，屬于完全拮抗劑[12]，目前已被批準用于治療晚期乳腺癌。氟維司群誘導受體蛋白降解的機制還未完全清楚，通常認為是該化合物中的雌二醇的7R-疏水鏈結合于受體的疏水域，導致構象改變，招募蛋白酶體，降解了高表達的雌激素受體。與SERM相對應的還有選擇性雄激素受體降解劑(SARD)，利用SARD降解雄激素受體是治療前列腺癌的重要途徑。

2.2 疏水性標簽

HyT技術是將疏水性部分經連接鏈(linker)與目標蛋白上可結合的配體連接，從而附加到靶蛋白的表面，使靶蛋白模擬未折疊的蛋白質狀態(tài)，并利用胞質未折疊蛋白響應系統(tǒng)來降解靶蛋白。

HyT技術的作用機理(圖2)：HyT的配體片段識別和結合靶蛋白，并引導所連接的疏水性片段附加于靶蛋白表面，使目標蛋白構象改變，在分子伴侶的參與下被蛋白酶體降解[13]。通過共價抑制劑etacrynic acid與Boc3-Arg連接靶向降解谷胱甘肽-S-轉移酶α1(GST-α1)、通過非共價抑制劑甲氨芐氨嘧啶(trimethoprim)偶聯(lián)Boc3-Arg降解二氫葉酸還原酶等都是利用HyT技術實現(xiàn)的。

圖2 HyT技術的作用機理Fig.2 Reaction mechanism of HyT technology

2.3 蛋白降解靶向嵌合體

PROTAC技術是目前在靶向蛋白質降解技術領域獲得廣泛研究的一項技術，屬于藥物研發(fā)領域。與傳統(tǒng)小分子藥物抑制劑不同，該技術通過小分子化合物將靶蛋白送入蛋白酶體并使其降解發(fā)揮作用。

2.3.1 PROTAC的理化性質和設計注意事項

PROTAC的核心是一種雙功能雜合化合物[14-15]，其基本結構包括：靶蛋白配體(target-binding moiety,TBM)、E3連接酶配體(ligase-binding moiety,LBM)和將前兩部分連接在一起的連接鏈，在實際設計過程中三部分不一定存在明顯的界限，通?；ハ嗦?lián)系，共同影響PROTAC的理化性質和作用效果。(1)靶蛋白配體：PROTAC的設計一般從靶蛋白配體的選擇開始，靶蛋白配體的結構大多源于已有的小分子抑制劑藥物或者已有藥物的改構物，在設計過程中強調其特異性選擇能力以及與靶蛋白的結合能力。(2)E3連接酶配體：E3連接酶配體的選擇通常要經過反復的實驗推理與驗證，依據(jù)與靶蛋白匹配的E3連接酶來決定，真核生物中約有600多種E3，不同的E3氨基酸序列差異很大，可識別不同的底物，具有特異性[16]，但目前為止只有少數(shù)幾個被用于PROTAC的開發(fā)[17]，現(xiàn)已知的PROTAC常用的E3連接酶(表1)有CRBN、cIAP1和VHL等。(3)連接鏈：當靶蛋白配體和E3連接酶配體確定后，優(yōu)化操作就集中在連接鏈的組成、長度[18]和連接位點上[19]。

表1 PROTAC常用的E3連接酶

Tab.1 E3 ligase commonly used in PROTAC

2.3.2 PROTAC技術的作用機理(圖3)

圖3 PROTAC技術的作用機理Fig.3 Reaction mechanism of PROTAC technology

當設計好的PROTAC進入細胞后，其一端的靶蛋白配體特異性識別靶蛋白并與之結合，另一端的E3連接酶配體與E3結合，從而形成POI-PROTAC-E3 ligase三元復合物，E3介導E2將靶蛋白泛素化，使被泛素分子標記的靶蛋白被蛋白酶體降解。完成降解后，PROTAC被釋放，參與下一次的蛋白質降解[20]。

2.3.3 PROTAC技術在生物醫(yī)學中的應用

PROTAC技術目前已經在生物醫(yī)學研究領域取得了一系列進展：

(1)用于腫瘤治療：大多數(shù)腫瘤的形成與胞內關鍵蛋白的異常表達有關，通過PROTAC技術敲除與腫瘤形成相關的蛋白已被廣泛應用于多種癌癥疾病的治療研究中。如Wee1是一種調節(jié)細胞周期的蛋白激酶，特異性調控G2/M細胞周期檢查點，Gray課題組[21]針對Wee1開發(fā)了一種選擇性的Weel降解劑ZNL-02-096，可在比Wee1的小分子抑制劑AZD1775濃度低10倍的劑量下誘導細胞凋亡和G2/M期的累計，肝外細胞色素P4501B1(CYP1B1)在腫瘤細胞中高度表達，可加速不同結構的抗癌藥物的失活。Zhou等[22]基于CYP1B1的抑制劑ANF，開發(fā)出了能夠特異性降解CYP1B1的降解劑6A-D，能夠消除DU145/CY細胞的耐藥性，為惡性腫瘤耐藥的疾病治療提供了新的方法和策略。

(2)用于神經性疾病治療：Tau蛋白是大腦表達的微管相關蛋白家族的一員，Tau蛋白在腦內的異常堆積與阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease,AD)、顱腦損傷(traumatic brain injury,TBI)和慢性創(chuàng)傷性腦病(chronic traumatic encephalopathy,CTE)都有關聯(lián)[23]。Lu等[24]利用PROTAC招募Keap1-Cul3泛素連接酶成功實現(xiàn)了細胞內Tau蛋白的降解，為相關神經疾病研究提供了新的治療思路。BET蛋白的降解可以減少缺血性腦卒中成年小鼠的腦水腫體積、降低促炎基因CXCL、TNFα、MMP-9等的轉錄，還能促進血腦屏障(BBB)的修復，Candelario-Jalil課題組[25]證明通過小分子降解劑dBET1可靶向降解BET蛋白，顯示了其治療缺血性腦卒中疾病的潛力。

(3)用于白血病治療：人9號和22號染色體交叉易位導致BCR-ABL1融合蛋白表達，引起ABL1激酶的持續(xù)激活，從而引發(fā)慢性粒細胞白血病(CML)。Crews課題組[26]利用PROTAC技術構造了GMB-651分子用于降解BCR-ABL1融合蛋白，提供了一種新的治療慢性粒細胞白血病的方法。

(4)用于基礎代謝調節(jié)：PROTAC技術在調控基礎代謝方面也顯示出了相應的潛力。如Waldmann課題組[27]曾應用PROTAC技術靶向降解PDEδ從而影響脂質代謝。

3 靶向蛋白質降解技術面臨的機遇與挑戰(zhàn)

隨著對靶向蛋白質降解技術研究的深入，現(xiàn)有技術存在的問題也逐漸顯現(xiàn)出來：(1)由于小分子降解劑的研發(fā)與試驗需要耗費一定的人力物力，現(xiàn)在能用靶向蛋白質降解技術敲除的靶蛋白仍然是非常小的一部分，無法滿足干擾特定蛋白表達領域的需求；(2)由于蛋白質的相互作用較復雜，涉及到蛋白空間構象的正確折疊，因此靶向蛋白質降解技術本身存在著許多客觀上難以逾越的障礙，包括降解劑能否與目標蛋白有效結合、是否存在脫靶效應、在細胞內發(fā)揮作用是否穩(wěn)定等問題；(3)現(xiàn)有的靶向蛋白質降解技術多基于細胞內的泛素-蛋白酶體途徑，而泛素-蛋白酶體途徑主要作用于胞內蛋白，因此膜蛋白及分泌蛋白的降解仍然是目前的難點；(4)現(xiàn)有的靶向蛋白質降解技術在發(fā)揮作用時，存在未達到理想的降解程度、無法達到疾病治療或蛋白質功能研究的目的、目標蛋白完全降解且細胞內與該蛋白相關的所有功能隨之消失、蛋白量不足以維持機體正常生理活動等情況。因此，能夠在機體中局部激活靶蛋白降解，避免對其它部位造成損傷，準確調控降解劑的活性，實時調控蛋白降解進程，勢必會成為今后靶向蛋白質降解技術發(fā)展的方向。

針對靶向蛋白質降解技術在實際研究與應用中存在的問題，研究者也在不斷探索對其進行改進，提高其應用價值。Clift等[28]利用細胞內一種特異性的泛素連接酶TRIM21結合抗體Fc結構域的性質，創(chuàng)造了一種新型的快速降解內源蛋白的方法，命名為TRIM-AWAY途徑，可特異性識別不同的蛋白質甚至同一蛋白質的兩種不同變體，對由蛋白變體引發(fā)的疾病研究具有重要意義。Trauner課題組[29]結合近年來發(fā)展迅速的光藥理學概念，將PROTAC技術與光化學技術相結合，創(chuàng)造了一種帶有光學開關的PROTAC，命名為PHOTACs(photochemically targeting chimeras)，可在一定波長(380～400 nm)的紫外光照射下，實現(xiàn)激活/失活狀態(tài)轉變，使靶蛋白的降解具有可調性。Bertozzi等[30]利用帶有M6P標記的蛋白可與細胞表面的M6PR結合，通過細胞內的溶酶體途徑將蛋白運送至溶酶體降解的性質，開發(fā)出了LYTACs技術，通過嵌合M6PR激動劑可利用細胞內溶酶體途徑靶向降解分泌蛋白及膜蛋白。

綜上所述，盡管靶向蛋白質降解技術在現(xiàn)階段仍然存在諸多問題，但隨著研究方法和技術的不斷改進，靶向蛋白質降解技術必將會成為與基因編輯技術比肩的有力工具，在生物醫(yī)學研究與臨床應用領域發(fā)揮出巨大的優(yōu)勢。