汪建茹， 楊進波， 張 馳

（1.湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院檢驗科，湖北 襄陽 441000；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢 430030）

2019年12月底以來，嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）[1]感染引發(fā)的新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）在全球范圍內(nèi)迅速蔓延。SARSCoV-2具有較強的傳染性，并多呈家庭聚集性，給疾病的診斷和治療帶來較大壓力。目前，在國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中，將SARS-CoV-2核酸陽性作為COVID-19的確診依據(jù)[2]。但SARSCoV-2核酸檢測對于實驗室條件、檢測人員素質(zhì)和樣本采集及運輸要求較高，且在疫情暴發(fā)流行初期存在試劑盒質(zhì)量參差不齊、供應不足、檢驗人員易感染、檢測通量較低等缺點[3-4]。另外，SARS-CoV-2在引物設計上可參考的序列有限，且會出現(xiàn)變異，采樣人員培訓不到位導致采樣不合格，采樣部位不同（肺泡灌洗液、痰液、鼻咽拭子）會導致敏感性出現(xiàn)差異[5-7]，這些因素都會導致SARS-CoV-2核酸檢測的假陰性結(jié)果的增多，使部分疑似患者不能及時確診。人體在感染病原體后，免疫系統(tǒng)會針對病原體抗原產(chǎn)生特異性抗體，因此檢測患者血液中的特異性抗體也是一種常用的病原體快速診斷方法?；谀z體金免疫層析法（colloidal gold immunochromatography assay，CGIA）開發(fā)的SARS-CoV-2抗體檢測試劑盒具有操作簡單，無需設備，對檢測人員和環(huán)境無特殊要求等優(yōu)點，可用于COVID-19的快速篩查。本研究采用CGIA檢測血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體，評估其在COVID-19診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年1月28日—2月29日湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院COVID-19患者173例，其中男83例、女90例，年齡（57.4±15.4）歲。173例患者中有140例為首次SARS-CoV-2核酸檢測陽性，有33例首次SARS-CoV-2核酸檢測為陰性，連續(xù)追蹤后檢測結(jié)果由陰性轉(zhuǎn)陽性，最終確診。COVID-19診斷符合國家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[2]：（1）發(fā)病前2周內(nèi)有武漢市旅行史或居住史；或發(fā)病前14 d內(nèi)曾接觸過來自武漢市的發(fā)熱伴有呼吸道癥狀，或有聚集性發(fā)病；（2）發(fā)熱，肺部影像學檢查結(jié)果異常（呈斑片狀、亞段或節(jié)段性磨玻璃影或病灶實變，磨玻璃影與實變影或條索影共存，累及多個肺葉；或雙肺彌漫性病變，少數(shù)呈“白肺”表現(xiàn)），初期血象白細胞、淋巴細胞降低等；（3）痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等樣本SARSCoV-2核酸檢測陽性；滿足（3）以及（1）或（2）中的任意一條即可確診。選取同期湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院排除COVID-19的疑似患者101例（對照組），其中男59例、女42例，年齡（57.9±14.7）歲。對照組均有發(fā)熱、咳嗽等癥狀，但痰液、咽拭子、下呼吸道分泌物等樣本多次SARS-CoV-2核酸檢測為陰性，血象和肺部影像學特征不符，伴或不伴甲型/乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等陽性。本研究經(jīng)湖北醫(yī)藥學院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院倫理委員會審查批準（批件號：2020GCP018），并通過知情同意的豁免申請。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采用含分離膠的黃頭真空采血管采集所有對象空腹靜脈血5 mL，室溫下靜置，待血液完全凝固后1 260×g離心5 min，分離血清，2～8 ℃保存，5 d內(nèi)完成檢測。如5 d內(nèi)無法完成，則需將樣本-20 ℃保存，凍融不超過3次。含懸浮纖維蛋白或聚合物的血清樣本離心后取上清液進行檢測，溶血及其他微生物污染樣本不可進行檢測。依據(jù)標準操作程序采集所有對象的鼻咽拭子樣本，用于SARS-CoV-2核酸檢測。所有樣本均用密封袋單個密封，并使用帶有醒目生物危害標識的專業(yè)轉(zhuǎn)運箱轉(zhuǎn)運，從密封袋取出樣本進行操作前須用75%乙醇噴霧消毒采樣容器外壁。

1.2.2 SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測 采用CGIA檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體，試劑盒由北京新興四寰生物技術有限公司生產(chǎn)，嚴格按試劑說明書操作。基本原理：IgM抗體檢測卡在金標墊上包被膠體金標記的鼠抗人IgM單克隆抗體膠體金標記物，在硝酸纖維素膜上檢測線（T線）位置包被重組SARS-CoV-2 Np抗原，質(zhì)控線（C線）位置包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗體；IgG抗體檢測卡在金標墊上包被膠體金標記的鼠抗人IgG（γ鏈）單克隆抗體，在硝酸纖維素膜上檢測線（T線）位置包被重組SARSCoV-2 S蛋白抗原，質(zhì)控線（C線）位置包被山羊抗小鼠IgG多克隆抗體。將適量的待檢血清樣本加入檢測卡的加樣孔，血清會在層析作用下向前移動，當血清中含有SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體時，該抗體就會與相應的金標抗體結(jié)合，形成金標抗體+抗體免疫復合物，該免疫復合物在層析作用下繼續(xù)在硝酸纖維素膜上向前流動。當該免疫復合物經(jīng)過T線時與包被的重組SARSCoV-2 Np抗原/S蛋白抗原結(jié)合，形成復合物而凝集顯色，游離的金標鼠抗人IgM單克隆抗體/IgG（γ鏈）抗體則與C線處包被的羊抗鼠IgG多克隆抗體結(jié)合而凝集顯色。判斷標準：T線和C線處均顯色判定為陽性，僅C線處顯色判定為陰性。如C線未顯色，則表明檢測結(jié)果無效。

1.2.3 SARS-CoV-2核酸檢測 選取SARSCoV-2 RNA基因序列中開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）作為擴增靶區(qū)域，采用熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）進行檢測。SMART32自動核酸提取儀、AGS4800型熒光PCR儀、SARS-CoV-2ORF1ab/N基因雙重核酸檢測試劑盒均購自中山大學達安基因股份有限公司。循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct）的判讀標準參照試劑盒說明書，出現(xiàn)可疑結(jié)果重新采樣復查。以同一份樣本中SARS-CoV-2的ORF1ab和N基因至少1個靶標檢測結(jié)果陽性判定為SARS-CoV-2核酸陽性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，多組間比較采用非參數(shù)Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用Dunn's檢驗。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用配對資料McNemarχ2檢驗。采用kappa一致性檢驗評估核酸檢測結(jié)果與抗體檢測結(jié)果的一致性。以臨床診斷結(jié)果為金標準，計算SARS-CoV-2抗體診斷COVID-19的敏感性、特異性、臨床總符合率等指標。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估SARSCoV-2抗體診斷COVID-19的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SARS-CoV-2 IgM抗體診斷COVID-19的準確性

SARS-CoV-2 IgM抗體診斷COVID-19的敏感性為76.9%，漏診率（假陰性率）為23.1%；特異性為94.0%，誤診率（假陽性率）為6.0%；臨床總符合率為83.2%（表1）。SARS-CoV-2 IgM抗體診斷COVID-19的結(jié)果與臨床診斷（金標準）比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 23.67，P＜0.000 1）。SARS-CoV-2 IgM抗體與臨床診斷的kappa值[95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）]為0.663（0.577～0.749）。

表1 SARS-CoV-2 IgM抗體與臨床診斷的比較

2.2 SARS-CoV-2 IgG抗體診斷COVID-19的準確性

SARS-CoV-2 IgG抗體診斷COVID-19的敏感性為74.6%，漏診率（假陰性率）為25.4%；特異性為95.1%，誤診率（假陽性率）為4.9%；臨床總符合率為82.1%（表2）。SARS-CoV-2 IgG抗體診斷COVID-19的結(jié)果與臨床診斷（金標準）比較，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=29.47，P＜0.000 1）。SARS-CoV-2 IgM抗體與臨床診斷的kappa值（95%CI）為0.664（0.558～0.731）。

表2 SARS-CoV-2 IgG抗體與臨床診斷的比較

2.3 SARS-CoV-2 IgM抗體和IgG抗體診斷COVID-19的效能

ROC曲線分析結(jié)果顯示，SARS-CoV-2 IgM抗體和IgG抗體診斷COVID-19 的曲線下面積（area under curve，AUC）（95%CI）分別為0.855（0.807～0.894）、0.848（0.800～0.888），二者比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 SARS-CoV-2 IgM抗體和IgG抗體診斷COVID-19的ROC曲線

2.4 20例SARS-CoV-2核酸檢測陰轉(zhuǎn)陽患者的抗體檢測追蹤結(jié)果

對20例首次SARS-CoV-2核酸檢測為陰性者，每隔1 d進行核酸、IgG抗體和IgM抗體的檢測，直至所有指標均呈陽性為止。如始終為陰性，最長觀察時限為25 d。首次SARS-CoV-2核酸檢測結(jié)果呈陽性的時間為9.5（6.3～12.8）d，IgM抗體首次呈陽性的時間為6.0（5.0～8.0）d，IgG抗體首次呈陽性的時間為11.0（9.5～15.0）d。所有患者IgM抗體均為陽性，有3例患者IgG抗體始終為陰性。SARSCoV-2核酸、IgG抗體和IgM抗體的陽性檢測時間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 20例首次SARS-CoV-2核酸檢測陰性患者血清SARS-CoV-2核酸、IgG抗體、IgM抗體陽性檢出時間

3 討論

SARS-CoV-2屬于冠狀病毒β屬的單鏈RNA病毒，有蛋白質(zhì)包膜，其顆粒呈圓形或橢圓形，直徑為60～140 nm，是冠狀病毒家族中第7個能夠感染人類的成員，其家族成員還包括可引起嚴重呼吸道疾病的嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome-related coronavirus，SARSr-CoV）和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（middle east respiratory syndrome-related coronavirus，MERSr-CoV）[8]。SARS-CoV-2具有極強的人際傳播能力，致死率為3.4%[9]，僅次于MERSr-CoV和SARSr-CoV。應對COVID-19最好的策略是“早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療”，但疫情初期，SARS-CoV-2核酸檢測存在采樣風險高、檢測時間長、檢測能力不足、檢測敏感性不高等問題，以致“三早”策略較難實施。本研究使用的基于CGIA開發(fā)的SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測試劑盒具有操作簡便、無需設備，對人員和環(huán)境無特殊要求等優(yōu)點，已成為診斷COVID-19的重要補充方法[2]。

有研究結(jié)果顯示，試劑盒參次不齊的質(zhì)量、不合格的采樣管、有問題的取材、不同的RNA提取技術、患者用藥情況等均會導致SARS-CoV-2核酸檢測出現(xiàn)假陰性結(jié)果[3]，與本研究SARS-CoV-2核酸檢測情況（假陰性率為19%）相符。因此，對于高度疑似患者，應進行多次核酸檢測予以確認。SARS-CoV-2抗體檢測不受樣本取材、采樣管、臨床用藥等因素的干擾，在一定程度上可規(guī)避核酸檢測的固有缺陷。本研究結(jié)果顯示，SARS-CoV-2抗體檢測的臨床符合度較高。對首次核酸陰性而后轉(zhuǎn)為陽性的20例患者進行追蹤觀察，結(jié)果顯示，有8例患者SARS-CoV-2 IgM抗體在5 d內(nèi)轉(zhuǎn)為陽性，另12例患者IgM在25 d內(nèi)全部轉(zhuǎn)為陽性，陽性率達100%；SARS-CoV-2 IgM抗體的陽性中位檢出時間為6.0 d，比核酸陽性時間早3.5 d（核酸陽性中位檢出時間為9.5 d），提示IgM抗體作為初次體液免疫應答中最早出現(xiàn)的抗體，在用于COVID-19早期診斷時可較好地彌補SARS-CoV-2核酸檢測的不足。20例患者中有17例（85.0%）SARS-CoV-2 IgG抗體在5 d后才出現(xiàn)陽性，有3例患者25 d的追蹤期內(nèi)IgG抗體始終呈陰性；SARS-CoV-2 IgG抗體的陽性中位檢出時間為11.0 d，比核酸陽性時間晚1.5 d，這說明IgG抗體一般只在感染后期或恢復期出現(xiàn)，可用于SARS-CoV-2既往感染情況的調(diào)查，也可用于患者康復后再次感染風險的評估[10-11]。值得一提的是，本研究中3例IgG抗體始終為陰性的患者均出現(xiàn)呼吸衰竭，需要機械通氣，屬于危重癥患者，可能其病情較重，病毒感染對機體免疫系統(tǒng)的損傷和抑制作用導致機體遲遲無法產(chǎn)生保護性IgG抗體。

本研究采用CGIA檢測SARS-CoV-2抗體的敏感性低于徐萬洲等[12]的化學發(fā)光免疫分析法的敏感性，原因可能為本研究采用的是入院時的單次檢測數(shù)據(jù)，而血清學抗體檢測存在窗口期、個體免疫應答差異等固有缺陷；也可能與檢測原理及金標試劑盒本身的檢測性能有關。另外，有研究結(jié)果顯示，血清中較高的類風濕因子水平會對GICA和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測SARS-CoV-2 IgM抗體產(chǎn)生干擾，導致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性[13]。因此，臨床上采用SARS-CoV-2抗體檢測結(jié)果進行疾病評估時，應充分考慮假陰性和假陽性的情況，并結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、影像學檢查結(jié)果、疫區(qū)接觸史、核酸檢測結(jié)果等因素進行綜合考慮。

綜上所述，SARS-CoV-2抗體檢測具有較高的敏感性、特異性和臨床符合率，可彌補SARSCoV-2核酸檢測的不足，為COVID-19的診斷、治療監(jiān)測和預后等方面提供更多的實驗室依據(jù)。