靳馥源，潘澤民，辛慧珍，者湘漪，張春賀，李洪濤，潘貞貞，李冬妹，鄭威楠

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002;2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室，新疆 石河子 832002;3 成都醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室/發(fā)育與再生四川省重點實驗室,四川 成都 610500)

在世界范圍內(nèi)，宮頸癌是女性常見的癌癥[1]，宮頸癌在發(fā)展中國家尤為普遍，超過80%的宮頸癌病例發(fā)生在低收入和中等收入國家，因獲得一級和二級預(yù)防機會有限[2]。宮頸癌在女性惡性腫瘤中發(fā)病率居第二位，死亡率居第三位[3]。宮頸癌的發(fā)生涉及諸多因素，其中持續(xù)性感染高危型人乳頭瘤病毒HPV16，已被公認為是引起宮頸癌，以及發(fā)展成為浸潤性宮頸癌最主要的因素[4]。腫瘤轉(zhuǎn)移是粘連，遷移和侵襲的過程[5]，宮頸癌與其他惡性腫瘤一樣，晚期預(yù)后不良以及晚期腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移對患者的生存率有很大影響，侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生，導(dǎo)致治療失敗，并且是大多數(shù)宮頸癌患者死亡的主要原因。

前期研究發(fā)現(xiàn)真核翻譯延伸因子1 A2(eukaryotie translation elongation factor 1 alpha 2,eEFlA2)基因在宮頸癌組織中mRNA表達水平增高[6]。真核延伸因子1 A(eEF1A)蛋白質(zhì)已成為人類許多實體腫瘤和血液癌發(fā)生和發(fā)展的潛在預(yù)測因子。eEF1A2是eEF1A蛋白質(zhì)家族(eEF1A1和eEF1A2)的兩個成員之一，eEF1A1基因位于6q13，eEF1A2基因位于染色體20q13.3上，eEF1A同源物的差異表達在胚胎發(fā)生過程中受到調(diào)節(jié)，其中在最初描述的細胞類型中，首先實現(xiàn)了eEF1A1表達，但一旦達到終末分化，其表達就會被eEF1A2取代[7]。它們結(jié)合氨基酰tRNA并促進它們在翻譯延伸期間募集到核糖體A位點，主要在腦，心臟和骨骼肌中表達，參與蛋白質(zhì)翻譯過程中的肽鏈延伸，因此在蛋白質(zhì)合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。eEF1A蛋白質(zhì)具有與翻譯無關(guān)的其他功能，如誘導(dǎo)肌動蛋白和微管蛋白細胞骨架后移，eEF1A2通過與鋅指蛋白1的相互作用以及隨后與具有酪氨酸激酶能力的一組受體相互作用將信號從細胞質(zhì)傳遞至細胞核，從而促進有效的細胞增殖。除細胞增殖和細胞凋亡調(diào)節(jié)外，eEF1A2還參與細胞骨架重排，與Factin相互作用，縮短微管，從而在腫瘤侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用[8]。為了進一步探討eEF1A2在宮頸癌細胞發(fā)生和發(fā)展的作用，我們通過RNA干擾實驗將eEF1A2基因表達水平降低，分析對細胞增殖、侵襲和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑

宮頸癌SiHa、HeLa和C33 A細胞株由本實驗室保存提供。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司；FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑購自美國Promege公司；transwell聚碳酸酯膜嵌套購自美國Corning公司；兔單克隆抗體E-cadherin購自美國Cell Signaling公司。

1.2 siRNA干擾片段來源

eEF1A2基因的siRNA干擾片段由上海吉瑪基因公司設(shè)計合成，詳細信息見表1。

表1 siRNA引物設(shè)計

1.3 宮頸癌細胞的培養(yǎng)及siRNA干擾

宮頸癌SiHa、HeLa和C33 A細胞在5% CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，待細胞融合度達85%左右時胰酶消化離心。待轉(zhuǎn)染的細胞接種至6孔板中，6孔板接種密度控制在5×105個細胞/孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，約60%～80%融合度時采用FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑進行轉(zhuǎn)染。待轉(zhuǎn)染的細胞共分4組：空白組為常規(guī)培養(yǎng)的宮頸癌細胞；陰性對照(negative control，NC)組為轉(zhuǎn)染Si-NC的宮頸癌細胞；轉(zhuǎn)染Si-eEF1A2-1和Si-eEF1A2-2的實驗組。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

1.4 Western blot 實驗

細胞轉(zhuǎn)染48～96 h內(nèi)提取細胞總蛋白，上樣SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)好的PVDF膜移至含有5%脫脂奶粉中封閉2 h，然后分別移至單克隆兔抗人E-cadherin抗體和小鼠多克隆抗GAPDH抗體中4 ℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H + L)及辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H + L)室溫下孵育2 h?；瘜W(xué)發(fā)光儀拍照或暗室曝光檢測蛋白質(zhì)表達量。

1.5 劃痕實驗

用記號筆在6孔板背面橫向劃線(轉(zhuǎn)染前一天細胞接種時用空的6孔板操作)，橫線間隔約1 cm左右，至少保證5條線過6孔板背面。用200 μL無菌移液吸頭垂直培養(yǎng)皿劃線，不能傾斜，用力要輕，用1×PBS洗細胞3次，去除劃掉的細胞，計為0 h并拍照記錄。更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在24、48 h拍照，拍照時做好相關(guān)記錄。

1.6 細胞遷移實驗

Transwell小室(24孔Transwell小室，8.0 μm孔徑;Corning)用于遷移測定。待細胞長至對數(shù)期，消化離心細胞，用1×PBS和無血清培養(yǎng)基先后洗滌細胞，計數(shù)并調(diào)整細胞密度至2×105/mL。在下室(24孔板底部)加入600 μL含10%血清的培養(yǎng)基，上室加入100～150 μL細胞懸液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用鑷子小心取出小室，吸干上室液體，移至4%多聚甲醛中，室溫固定30 min，然后移至0.1%結(jié)晶紫染液中，室溫30 min。清水沖洗浸泡數(shù)次，棉棒小心擦去上室底部膜表面上的液體。顯微鏡拍照，每個小室隨機取5個視野，計數(shù)細胞數(shù)量。

1.7 平板克隆

在6孔板中每孔接種3 000個細胞，將細胞置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～5 d換液1次，培養(yǎng)2周。當皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止細胞培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷1×PBS洗2～3次，用4%多聚甲醛固定液，4 ℃固定20 min。0.1%結(jié)晶紫染色15 min。用蒸餾水緩慢清洗細胞，將染液洗除，自然干燥。將顯微鏡調(diào)節(jié)至低倍鏡，對大于50個細胞的克隆進行計數(shù)。

1.8 CCK8實驗

細胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化離心后制成細胞懸液，接種時細胞懸液混勻，避免細胞沉淀，導(dǎo)致盤孔的細胞數(shù)量不等，用細胞計數(shù)板計數(shù)，計數(shù)后按2～3×103個細胞/孔100 μL接種至96孔板中，培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)，待細胞貼壁后分別在0、24、48、72 h時間點，每孔加入10 μL CCK8試劑(CCK-8的量按每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入)，傾斜貼壁加CCK-8試劑，避免插入培養(yǎng)基液面下，否則容易產(chǎn)生氣泡，干擾OD值讀數(shù)。加CCK-8的速度要快，減少試劑在移液器上殘留。加入CCK8后，左右輕輕晃動培養(yǎng)板數(shù)次，使培養(yǎng)基和CCK8試劑充分混勻，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光值，注意避光。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，每個實驗重復(fù)3次，組間比較均采用t檢驗，計量資料用均數(shù)±標準差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。劃痕實驗結(jié)果計算分析采用：24 h值=0 h寬度-24 h寬度/0 h寬度，即0 h與24 h的寬度差值比上0 h寬度所得的結(jié)果；48 h值=0 h寬度-48 h寬度/0 h寬度，即0 h寬度與48 h寬度的差值比上0 h寬度所得的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Western blot實驗分析eEF1A2和E-cadherin蛋白質(zhì)的表達

通過RNA干擾eEF1A2基因，eEF1A2基因的蛋白質(zhì)表達水平明顯降低。同時，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變的相關(guān)分子E-cadherin蛋白質(zhì)表達水平明顯升高，提示由于eEF1A2基因表達水平降低，而使上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變降低，降低細胞侵襲和遷移(圖1)。

NC:陰性對照;Si-1:Si- eEF1A2-1;Si-2:Si- eEF1A2-2*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。圖1 eEF1A2在宮頸癌SiHa細胞蛋白質(zhì)表達

2.2 劃痕實驗檢測宮頸癌細胞侵襲

RNA干擾eEF1A2基因的細胞培養(yǎng)24 h后劃痕，分別在劃痕后的0、24、48 h后拍照，與未做任何處理的空白組和陰性對照組相比，干擾后的宮頸癌細胞之間的間隙明顯比對照組寬，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。提示通過RNA干擾實驗使eEF1A2基因表達水平降低，從而減小宮頸癌細胞侵襲和遷移能力。

NC:陰性對照;Si-1:Si- eEF1A2-1;Si-2:Si- eEF1A2-2*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001。圖2 細胞劃痕實驗檢測eEF1A2基因?qū)m頸癌細胞侵襲的影響

2.3 Transwell

宮頸癌細胞轉(zhuǎn)染24 h后消化離心，制成細胞懸液后計數(shù)，傳至24板孔上室，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～36 h，固定、染色后在顯微鏡下拍照。如圖所示，與對照組相比，實驗組穿過24孔板小室底部膜的細胞明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

2.4 CCK8增殖實驗分析RNA干擾eEF1A2基因后細胞的增殖

RNA干擾eEF1A2基因后，SiHa、HeLa細胞的增殖能力明顯低于對照組(圖4)。

圖4 CCK8實驗檢測宮頸癌SiHa和HeLa細胞增殖能力

2.5 細胞集落形成實驗分析RNA干擾后細胞克隆生長

SiHa和HeLa細胞RNA干擾eEF1A2基因后，實驗組細胞克隆數(shù)明顯低于對照組(圖5)。

圖5 RNA干擾eEF1A2基因?qū)m頸癌SiHa和HeLa細胞集落形成的影響

3 討論

通過實驗可以證明eEF1A2基因在宮頸癌增殖、侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用，降低eEF1A2基因表達顯著抑制宮頸癌細胞增殖。RNA干擾eEF1A2基因后，通過Western blot實驗驗證了eEF1A2在宮頸癌細胞中表達下調(diào)，EMT標志蛋白質(zhì)E-cadherin在宮頸癌SiHa細胞中顯著上調(diào)。通過劃痕實驗發(fā)現(xiàn)eEF1A2基因表達降低后可以顯著降低SiHa和HeLa細胞的侵襲。Trnswell實驗結(jié)果表明eEF1A2基因表達降低后宮頸癌細胞遷移能力降低。在不同的癌中，轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的典型特征[9]，轉(zhuǎn)移性癌難于治療，癌細胞轉(zhuǎn)移過程包括局部浸潤、血管內(nèi)移植、血液循環(huán)轉(zhuǎn)移、外滲和定植[10]。盡管宮頸癌診斷和治療策略有所改善，但晚期宮頸癌患者的5年生存率仍然很低[11]。因此，全面了解影響宮頸癌侵襲和遷移的相關(guān)分子可能有助于發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者的有效治療方式。

eEF1A2蛋白質(zhì)有利于腫瘤發(fā)生，對于很多人類腫瘤，eEF1A2因其異常表達而確定為癌基因。eEF1A2基因在癌癥發(fā)展中發(fā)揮促增殖、抗凋亡和促轉(zhuǎn)移的功能，eEF1A2在哺乳動物細胞中的表達增加了細胞的生長速度，促使細胞在軟瓊脂中生長，并增強細胞在異種移植瘤模型中的致瘤性[12]。eEF1A2在多發(fā)性骨髓瘤的某些病例中也高表達，有助于小鼠和人類漿細胞腫瘤的誘發(fā)[13]。eEF1A2基因作為不同癌的癌基因引起了研究者的關(guān)注[14]。2002年Anand等人證實在30%的卵巢腫瘤中eEF1A2基因高表達[15]。eEF1A2基因在正常人乳腺組織中幾乎檢測不到，但eEF1A2基因的表達在大多數(shù)乳腺腫瘤中明顯上調(diào)，在60%的原發(fā)性乳腺腫瘤和轉(zhuǎn)移灶中檢測到高水平的eEF1A2表達，但在正常上皮中未檢測到,eEF1A2的表達足以刺激BT549人乳腺癌細胞和未轉(zhuǎn)化的Rat2細胞中膜蛋白的形成，在乳腺癌細胞系BT549中，eEF1A2表達大部分以PI3K和Akt依賴性方式刺激細胞遷移和侵襲，表明eEF1A2基因通過Akt和PI3K依賴性細胞骨架重塑來調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生[16]，高表達eEF1A2基因可誘導(dǎo)乳腺癌細胞產(chǎn)生絲狀偽足，增強其遷移和侵襲能力[17]。侵襲性和轉(zhuǎn)移性是癌癥死亡的主要原因，特別是在胰腺癌中顯著，顯示出驚人的高侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，最近的一項研究表明，eEF1A2基因通過Akt活化上調(diào)MMP-9的表達促進了胰腺癌細胞的侵襲[18]。本研究發(fā)現(xiàn)eEF1A2基因在宮頸癌細胞中表達水平增高，與癌的增殖、侵襲和遷移相關(guān)，通過RNA干擾實驗使eEF1A2基因表達水平降低，可以降低宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，提示eEF1A2基因可能作為一個潛在的靶標，用于宮頸癌的治療。