吳 楠 張寧波 鄭巧玲 陳衛(wèi)平 徐偉榮

(1寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021；2葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心,寧夏 銀川 750021；3寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏 銀川 750021；4寧夏葡萄與葡萄酒研究院,寧夏 銀川 750021；5寧夏農(nóng)林科學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

葡萄(Vitisspp.)是多年生落葉藤本果樹類作物,被廣泛用于釀酒、鮮食、制汁、制干、制罐。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization,FAO)統(tǒng)計(jì),截至2016年,我國(guó)葡萄栽培面積為84 萬hm2,居世界第2 位；產(chǎn)量約1 500 萬t,居世界首位。目前,在世界范圍內(nèi)廣泛種植的葡萄多數(shù)為歐亞種葡萄(V.viniferaL.),其品質(zhì)優(yōu),但抗逆性普遍較差。低溫對(duì)葡萄的傷害是葡萄栽培中常遇到的問題,嚴(yán)重限制了葡萄的栽培區(qū)域。我國(guó)北方葡萄栽培地區(qū),如西北、華北和東北地區(qū)均屬于埋土防寒栽培區(qū),由于低溫、空氣干燥、多風(fēng)等氣象因子,導(dǎo)致凍旱時(shí)有發(fā)生。因此,培育在我國(guó)北方地區(qū)免埋土即可安全越冬的抗寒旱優(yōu)質(zhì)葡萄新品系是發(fā)展高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)寒地葡萄的有效途徑,也是葡萄育種中亟待解決的問題。

在低溫脅迫下,植物通過信號(hào)感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等激活在冷脅迫下信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá),引發(fā)相應(yīng)的生理生化反應(yīng),對(duì)冷脅迫做出相關(guān)抗逆響應(yīng)。其中,Ca2＋作為第二信使感應(yīng)脅迫信號(hào),當(dāng)植物受到冷脅迫時(shí),細(xì)胞Ca2＋濃度增大[1]。Ca2＋信號(hào)可通過激酶的磷酸化作用[2]或轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控影響細(xì)胞的生理生化反應(yīng)[3-4]。在高等植物中已發(fā)現(xiàn)4 個(gè)主要的鈣感受器蛋白家族：鈣依賴性蛋白激酶(calciumdependent protein kinases,CDPKs)、鈣調(diào)素(calmodulins,CaMs)、類鈣調(diào)素蛋白(calmodulin-like proteins,CMLs)和類鈣調(diào)磷酸酶B 蛋白(calcineurin Blike proteins,CBLs),其中CBLs 必須與CIPKs 互作才能完成Ca2＋的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[5]。CIPK 蛋白激酶普遍存在于陸生植物基因組中[5],如擬南芥[6]、水稻[7]、高粱[8-9]、木薯[10]、白楊[11]、蘋果[12]和葡萄[13]等。研究表明,CBL-CIPK 復(fù)合物參與大范圍逆境脅迫條件下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),如低溫、造傷、干旱和高鹽等[14]。然而,前期報(bào)道多通過目標(biāo)基因在模式植物中的異源表達(dá)研究其功能,有關(guān)其調(diào)控逆境脅迫的具體機(jī)制研究較少。

有關(guān)CIPKs參與低溫脅迫的研究主要集中在模式植物擬南芥與水稻中。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中,AtCIPK3 受低溫誘導(dǎo)表達(dá),且調(diào)控CBF/DREB靶基因如RD29A和KIN1/KIN2 的表達(dá)[15]。AtCIPK7 通過與負(fù)調(diào)控因子AtCBL1 相互作用參與植物對(duì)低溫刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16]。水稻(Oryza sativa)OsCIPK3 受低溫脅迫上調(diào)表達(dá),而過表達(dá)OsCIPK3 增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的抗寒性[17]。小麥(Triticum aestivum)TaCIPK14 響應(yīng)低溫誘導(dǎo)表達(dá),在煙草中過量表達(dá)TaCIPK14 增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株的抗鹽堿和抗寒性[18]。在水稻中過量表達(dá)蕪菁(Brassica rapa)BrCIPK1 與OsCIPK7 均能增強(qiáng)低溫的耐受性[19-20]。然而,有關(guān)葡萄屬植物CIPK 蛋白激酶基因參與低溫脅迫響應(yīng)的調(diào)控機(jī)理尚不清楚。

山葡萄(Vitis amurensis)是葡萄屬植物中最抗寒的一個(gè)種,挖掘野生葡萄種質(zhì)抗寒基因資源,開展低溫脅迫應(yīng)答機(jī)制的解析,是通過分子手段實(shí)現(xiàn)栽培葡萄抗寒性改良的有效途徑。Xu 等[21]對(duì)中國(guó)野生抗寒材料山葡萄進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)參與低溫脅迫引發(fā)的早期傷害及感知階段的激酶基因中,涉及CBL-CIPK信號(hào)通路的7 個(gè)CIPK成員(CIPK3、CIPK12、CIPK13、CIPK14、CIPK17、CIPK18 與CIPK19),均參與低溫脅迫誘導(dǎo),其中VaCIPK18 基因受低溫脅迫呈明顯上調(diào)表達(dá)。本研究通過生物信息學(xué)分析獲取VaCIPK18 胞外結(jié)構(gòu)域中抗原表位豐富的肽段,利用基因工程手段將編碼該蛋白C 端230～439 aa 的基因片段構(gòu)建至原核表達(dá)載體pET28a-VaCIPK18230-439,并誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,免疫實(shí)驗(yàn)級(jí)大耳白兔制備高效價(jià)特異性抗血清,并利用該抗血清分析低溫脅迫對(duì)VaCIPK18 在葡萄葉片內(nèi)的表達(dá)量的影響,旨在為進(jìn)一步從蛋白水平解析VaCIPK18 參與葡萄低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為兩年生盆栽扦插的山葡萄左山-1(V.amurensiscv.Zuoshan-1),于自然光照條件下溫室進(jìn)行培養(yǎng)。4℃低溫培養(yǎng)箱[LT-BIX120L,立德泰克力(上海)科學(xué)儀器有限公司]處理2 d 后采集葉片組織,以室溫條件下的葉片組織作為對(duì)照(CK),液氮速凍,置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA Marker、pMD19-T Vector、PrimeSTAR? Max DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白定量試劑盒均購(gòu)自寶日醫(yī)生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)自北京天根公司；ClonExpress? ⅡOne Step Cloning Kit 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；植物蛋白抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；辣根過氧化物酶HRP 標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司。引物合成和測(cè)序由北京奧科生物公司完成。

1.2 目的基因克隆

以歐洲葡萄VvCIPK18(VIT_06s0009g01840)為參考序列,設(shè)計(jì)特異引物VaCIPK18-F(ATGAATCCACCT AAAGTCAAGCGTCG)和VaCIPK18-R(CTGAGGATGA CATGCAAGAAACGAAATAA)。以山葡萄葉片cDNA 為模板,通過PCR 擴(kuò)增獲得目的片段,建立25 μL PCR反應(yīng)體系：ddH2O 9.5 μL,cDNA 模板1 μL,上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,PrimSTAR Max Premix(2×)12.5 μL；離心混勻后,進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)程序：98℃變性10 s,55℃退火15 s,72℃延伸10 s,35 個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,膠回收目的片段與pMD19-T 載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)Top10,菌液PCR 鑒定后,陽性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

山葡萄VaCIPK18 基因序列經(jīng)北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序后,提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫。采用ExPASy(https：//www.expasy.org/)在線分析氨基酸的理化性質(zhì)；MEGA7.0 軟件中的鄰接(Neighbor-Joining)法構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。運(yùn)用SMART：Main page(http：//smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析；通過IEDB analysis Resource(http：//tools.immuneepitope.org/main/)進(jìn)行線性表位預(yù)測(cè)。運(yùn)用TMHMM Server v.2.0(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。通過SignalP 4.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

1.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)線性表位預(yù)測(cè)結(jié)果,選擇山葡萄VaCIPK18蛋白230～439 aa 相應(yīng)的區(qū)段,設(shè)計(jì)特異引物,VaCIPK18-SUMO-F：GAACAGATTGGTGGATCCGAATT TACTTGCCCACCTTGGCTCT 與VaCIPK18-SUMO-R：T GCGGCCGCAAGCTTTTTCGTTTCTTGCATGT,以VaCIPK18 重組克隆質(zhì)粒為模板,通過PCR 擴(kuò)增獲得目的片段。同時(shí)使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/HindⅢ雙酶切原核表達(dá)載體pET28a-SUMO,通過ClonExpress? ⅡOne Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技有限公司)進(jìn)行同源重組,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliTop10 感受態(tài)細(xì)胞,涂板,挑取單菌落,搖菌14 h 后,進(jìn)行菌液PCR 與酶切鑒定。測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pET28a-VaCIPK18230-439。

1.5 重組蛋白原核表達(dá)及可溶性分析

將pET28a-VaCIPK18230-439重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliRosetta 菌株,挑取單菌落接種培養(yǎng)12 h,進(jìn)行菌液PCR 鑒定,正確的菌株用于原核誘導(dǎo)表達(dá)。37℃、200 r·min-1培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8 時(shí),加 入0.8 mmol·L-1異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-dthiogalactoside,IPTG),誘導(dǎo)4 h 后,取1 mL 菌液,經(jīng)細(xì)菌裂解液處理30 min 后離心,對(duì)全菌體蛋白、菌體上清、裂解上清、裂解后的沉淀以及未誘導(dǎo)重組菌和誘導(dǎo)的pET28a 空載體菌,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析,確定重組蛋白的表達(dá)形式。

1.6 包涵體蛋白的處理

VaCIPK18230-439重組蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)大量誘導(dǎo)表達(dá)后,5 500 r·min-1離心20 min 收集菌體,取50 mL 的1×PBS 緩沖液,重懸菌體,轉(zhuǎn)入50 mL 燒杯中,并加入50 μL β-巰基乙醇。冰浴超聲破碎細(xì)胞,9 000 r·min-1離心10 min,獲得上清液Ⅰ和沉淀；上清Ⅰ轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中,4℃保存。沉淀用8 mol·L-1尿素進(jìn)行二次破菌；9 000 r·min-1離心10 min得到上清液Ⅱ和沉淀,上清液Ⅱ裝于50 mL 離心管中,4℃保存。沉淀先用去離子水洗滌2 遍,再加入6 mL ddH2O,懸浮后平均分裝到4 個(gè)2 mL 的離心管中,12 000 r·min-1離心2 min,棄上清液。向管中加入1.5 mL 8 mol·L-1尿素溶解沉淀,12 000 r·min-1離心1 min,上清液移入到新的2 mL 離心管中,采用BCA法[22]檢測(cè)洗脫液中蛋白濃度,進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳鑒定。

1.7 融合蛋白的抗血清的制備、效價(jià)測(cè)定

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,將符合免疫要求濃度的VaCIPK18230-439融合蛋白乳化后,多點(diǎn)注射2 只實(shí)驗(yàn)級(jí)大耳白兔背部皮下,按照每kg 體重1 mg 的劑量,分別在第1、第12、第26、第40 天注射一次,共免疫4 次,第4 次注射7 d 后靜脈少量采血樣,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定抗體效價(jià)[23],經(jīng)檢測(cè)合格后,于第52 天后動(dòng)脈一次性采血。

1.8 免疫親和層析柱的制備、兔抗血清的純化與特異性檢測(cè)

取8 mg 多肽,用2 mL 偶聯(lián)緩沖液(50 mmol·L-1Tris,5 mmol·L-1EDTA-NA,pH 值8.5)溶 解；將Sulfolink 偶聯(lián)凝膠平衡至室溫,取2 mL 加入層析柱中,旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2 h。將層析柱靜置于層析架,連接恒流泵,分別用40 mL 1×PBS、30 mL 1×Gly、30 mL 1×PBS平衡柱子。將獲得的兔抗血清加入1/20 4 mol·L-1NaCl 溶液,過柱2 次,然后加入40 mL 洗脫緩沖液(1×PBS,320 mmol·L-1NaCl)洗脫,再加入1×Gly 收集樣品,最后向樣品中加入過量的Gly(pH 值2.2)洗脫抗體,并用1×PBS 平衡。將收集的抗體置于透析袋,混勻之后取30 μL 用于抗體濃度測(cè)定,其余抗體置于1×PBS 的甘油中透析濃縮過夜,-20℃保存。將不同劑量重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 電泳,并凝膠濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(NC)上,以純化的兔血清為一抗(1∶1 000),以熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗,進(jìn)行蛋白印跡(Western Blot)檢測(cè),使用Azure 蛋白成像C400 系統(tǒng)(Azure Biosystems,美國(guó))掃描NC 膜,進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescence,ECL)染色,采用電泳系統(tǒng)對(duì)電泳圖像分析。

1.9 Western Blot 分析

將盆栽山葡萄轉(zhuǎn)移至4℃處理2 d,收集的葉片組織樣品為試驗(yàn)組,以室溫條件下的葉片組織作為對(duì)照(CK),于液氮中進(jìn)行研磨。取200 mg 粉末,加入300 μL 蛋白提取液[100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 值6.8)、2%SDS、10%甘油和0.5% β-巰基乙醇],4℃、10 000 r·min-1離心10 min,收集上清液,進(jìn)行12% SDSPAGE 電泳及Western Blot 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山葡萄VaCIPK18 克隆與生物信息學(xué)分析

本研究克隆獲得的山葡萄左山-1VaCIPK18 基因序列全長(zhǎng)1 320 bp,編碼439 個(gè)氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明,該蛋白激酶包括2 個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域,分別為N 端的S_TKc 激酶結(jié)構(gòu)域(kinase domain)和C端的調(diào)控結(jié)構(gòu)域(junction regulatory domain)(圖1)。聚類分析表明,源于植物中與山葡萄VaCIPK18 同源的蛋白可聚為雙子葉植物與單子葉植物兩類(其中人HsAMPKalpha-2 蛋白為外群)；VaCIPK18 與歐洲葡萄VvCIPK18 親緣關(guān)系最近(相似性為99.8%),并與碧桃、甜櫻桃、大豆與擬南芥聚為一類；同時(shí)發(fā)現(xiàn)二穗短柄草、山羊草、日本稻、高粱與谷子聚集在單子葉植物類(圖2)。經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),VaCIPK18 信號(hào)肽分值S 平均值(mean S-score)＜0.5,表明其不存在信號(hào)肽片段,不是分泌蛋白。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明,VaCIPK18不存在跨膜區(qū)域。線性表位、親水性、免疫原性和表位暴露性預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)表明,C 端氨基酸抗原表位、暴露性及性質(zhì)優(yōu)于N 端氨基酸區(qū)域,因此,選擇230～439 aa 抗原區(qū)進(jìn)行抗體制備(圖1)。

圖1 山葡萄VaCIPK18 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.1 Prediction of VaCIPK18 protein domain from V.amurensis

圖2 山葡萄CIPK18 與其他植物CIPK 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of CIPK18 amino acid sequence of V.amurensis and other related plant species

2.2 VaCIPK18原核表達(dá)載體構(gòu)建

以pMD-19-T-VaCIPK18 質(zhì)粒為模板,PCR 擴(kuò)增出630 bp 的目標(biāo)片段。使用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切原核表達(dá)載體pET28a-SUMO,通過同源重組獲得pET28a-VaCIPK18230-439(圖3)。經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測(cè)序,正確的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta菌株。

2.3 VaCIPK18 激酶融合蛋白原核表達(dá)以及可溶性分析

將含重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-VaCIPK18230-439的大腸桿菌Rosetta進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng),并在37℃條件下,經(jīng)0.8 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)4 h 后,離心取菌體裂解液,進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。結(jié)果表明,空載體與未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒 pET28a-VaCIPK18230-439的Rosetta 菌體中均未檢測(cè)到目標(biāo)條帶,而經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后的菌體中在42 kDa 左右處出現(xiàn)目標(biāo)條帶,同預(yù)測(cè)的VaCIPK18230-439肽段分子量24 kDa 與His-T7-SUMO 分子量18 kDa 之和大小一致(圖4),表明在IPTG 誘導(dǎo)下重組蛋白進(jìn)行了表達(dá)。

取重組菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),收集菌體經(jīng)超聲波破碎、離心后,取上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE 鑒定。結(jié)果表明,重組蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在于破菌沉淀中,而上清中未檢測(cè)到重組蛋白條帶(圖5)。

2.4 抗血清ELISA 檢測(cè)

將包涵體溶解后經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè),包涵體蛋白純度達(dá)到90%,目標(biāo)帶清晰,但仍有少量雜帶(圖6-A)。經(jīng)檢測(cè),獲得重組蛋白包涵體濃度為10 mg·mL-1,純度達(dá)到免疫要求。免疫大耳兔后,制備抗血清,通過ELISA 競(jìng)爭(zhēng)性抑制法檢測(cè)純化血清和效價(jià),結(jié)果顯示,當(dāng)抗原稀釋比例為4 K 和512 K 倍時(shí),純化血清抗體效價(jià)和零標(biāo)準(zhǔn)OD 值為1.983 5 與0.040 7,非純化血清抗體效價(jià)0.034 1,說明被免疫的兔子產(chǎn)生了抗體,效價(jià)最高可達(dá)到1∶512 000,其抗血清中抗體濃度能滿足Western Blot 的效價(jià)值(圖6-B)。

將重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的不同劑量蛋白經(jīng)12% SDSPAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜,以制備的兔抗血清為一抗,進(jìn)行Western Blot 分析檢測(cè),10、5、1、0.5 ng 的抗原均可檢測(cè)到1 條特異性條帶,且大小與預(yù)期結(jié)果相符(42 kDa),表明抗原與anti-VaCIPK18 抗體特異性結(jié)合(圖7)。

圖3 融合蛋白原核表達(dá)載體pET28a-SUMO-VaCIPK18構(gòu)建過程示意圖Fig.3 The construction process of fusion protein prokaryotic expression vector pET28a-SUMO-VaCIPK18

圖4 VaCIPK18230－439原核蛋白誘導(dǎo)表達(dá)Fig.4 Prokaryotic protein induced expression of VaCIPK18230－439

圖5 VaCIPK18230－439融合蛋白可溶性分析Fig.5 Analysis of the solubility of VaCIPK18230－439fusion protein

2.5 anti-VaCIPK18 多克隆抗體的檢測(cè)

為明確山葡萄VaCIPK18 參與低溫脅迫的表達(dá)模式,提取山葡萄葉片組織在室溫與低溫脅迫下的葉片總蛋白,進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳,用制備的anti-VaCIPK18 抗血清進(jìn)行Western Blot 分析。結(jié)果表明,在室溫與低溫條件下,均能雜交出與預(yù)期大小一致的條帶(50 kDa)；與室溫相比,低溫誘導(dǎo)對(duì)VaCIPK18 蛋白表達(dá)無顯著差異。除了50 kDa 的特異條帶外,還發(fā)現(xiàn)在該特異條帶上下共3 條弱的條帶(圖8),推測(cè)可能與VaCIPK18 蛋白自磷酸化、蛋白間的磷酸化或泛素化降解有關(guān)[24-25]。

3 討論

植物為了適應(yīng)環(huán)境脅迫,進(jìn)化出精細(xì)的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行信號(hào)識(shí)別與轉(zhuǎn)導(dǎo),從而對(duì)非生物脅迫做出一系列的響應(yīng),以緩解對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生的不良影響[26]。CBL-CIPK系統(tǒng)是陸生植物特有的Ca2＋介導(dǎo)響應(yīng)非生物脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[27-28]。作為感受器,CBLs 識(shí)別并結(jié)合Ca2＋,激活后的CBLs 與特異的CIPKs 激酶互作形成復(fù)合物[29],該復(fù)合物磷酸化其下游靶蛋白,如PP2C 磷酸酶[30]、離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[31]、轉(zhuǎn)錄因子[32]以及NADPH 氧化酶RBOHF[33]等,繼而調(diào)控植物響應(yīng)逆境脅迫。然而,有關(guān)葡萄屬植物CBL-CIPK 網(wǎng)絡(luò)中成員參與冷脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的功能尚鮮見報(bào)道。

圖7 制備的anti-VaCIPK18230－439多克隆抗體Western Blot 分析Fig.7 Western Blot analysis of anti-VaCIPK18230－439polyclonal antibody

圖8 anti-VaCIPK18 在山葡萄葉片中Western 的檢測(cè)Fig.8 Detection of anti-VaCIPK18 in V.amurensis

本研究從抗寒山葡萄種質(zhì)中克隆獲得一個(gè)類鈣調(diào)素B 亞基蛋白的互作蛋白VaCIPK18,其與已報(bào)道的擬南芥逆境脅迫基因AtCIPK3 蛋白高度同源,表明其可能在低溫脅迫中發(fā)揮重要的作用。為了深入了解VaCIPK18 在細(xì)胞中的功能以及響應(yīng)逆境過程中的作用特點(diǎn),本研究首先通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè),綜合分析了該蛋白的跨膜區(qū)、信號(hào)肽、線性表位、親水性、免疫原性和表位暴露性數(shù)據(jù),選擇該蛋白230～439 aa 區(qū)間,采取原核表達(dá)方法制備了抗血清。在原核表達(dá)載體構(gòu)建中,考慮到小泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-like modifier-1,SUMO)標(biāo)簽具有抗蛋白水解,顯著增加重組蛋白表達(dá)量以及消化后無氨基酸殘留等優(yōu)勢(shì)[34],選擇pET28a-SUMO 載體進(jìn)行原核表達(dá)。本研究結(jié)果表明,在37℃條件下,經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)獲得了不溶性的包涵體蛋白。研究表明,通過原核系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)通常會(huì)產(chǎn)生天然的可溶性蛋白與非天然的包涵體形式[35-36]。推測(cè)VaCIPK18230-439包涵體蛋白的形成,可能由于該蛋白折疊過程中缺乏所需要的酶和輔助因子,或環(huán)境不適,無法形成正確的次級(jí)鍵[37-38]。由于包涵體蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體,不具有生物學(xué)活性,但對(duì)后續(xù)免疫檢測(cè)反應(yīng)影響不大。因此,本研究對(duì)重組融合蛋白包涵體8 mol·L-1尿素與6 mol·L-1的鹽酸胍溶解包涵體進(jìn)行變性,經(jīng)檢測(cè)獲得了較高純度的重組蛋白,從而用于后續(xù)免疫。本研究制備的anti-VaCIPK18 多克隆抗體與菌體總蛋白雜交后,目標(biāo)條帶清晰,背景低；ELISA檢測(cè)表明,其效價(jià)達(dá)到1∶512 000,滿足抗血清制備要求。

泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與眾多蛋白的降解,對(duì)眾多細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。泛素依賴性蛋白水解酶在植物激素的形成、感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與輸出的調(diào)節(jié)中起著不可或缺的作用[39]。有研究報(bào)道,擬南芥CIPK26 是ABA 信號(hào)通路中Ring-type E3 泛素連接酶KEG(Keep on Going)的泛素化底物,KEG 靶向CIPK26 激酶與下游轉(zhuǎn)錄因子ABI5的結(jié)合[40]。同時(shí),CIPK26可在體外磷酸化KEG,活化的CIPK26 增強(qiáng)了KEG 的降解[41]。也有研究表明,未知激酶激活環(huán)磷酸化可能是CIPK 激活的替代機(jī)制,其獨(dú)立于與CBL 的互作[42]。本研究在山葡萄葉片蛋白檢測(cè)的Western Blot 分析中發(fā)現(xiàn),除了與預(yù)期大小一致的內(nèi)源特異條帶(50 kDa)外,在30～60 kDa 范圍內(nèi)還存在其他條帶。一種可能是葡萄CIPK18 蛋白的泛素化修飾,出現(xiàn)了在30～45 kDa 區(qū)間的兩條帶,推測(cè)可能與VaCIPK18 作為某種泛素連接酶的底物被蛋白酶體降解有關(guān)；另一種是CIPK18激酶自身磷酸化或未知蛋白對(duì)CIPK18 的磷酸化,出現(xiàn)在目標(biāo)條帶上方(50～60 kDa)的蛋白條帶,這與已報(bào)道的激酶BRI1[43-44]、BAK1[45]、激酶抑制劑BES1[46]以及泛素連接酶PUB13[47-48]等蛋白都有磷酸化現(xiàn)象一致。CIPK18 蛋白是否以二聚體或者多聚體的形式存在于葡萄中也需要進(jìn)一步研究。在本研究中的原核表達(dá)系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)有類似磷酸化條帶的現(xiàn)象,進(jìn)一步表明該蛋白在植物與細(xì)菌中具有保守的功能。因此,VaCIPK18 在植物中所存在的功能形式還需進(jìn)一步通過構(gòu)建敲除株系,結(jié)合質(zhì)譜分析或泛素化/磷酸化抗體孵育研究確定。

4 結(jié)論

本研究克隆了抗寒山葡萄VaCIPK18 基因,經(jīng)生物信息學(xué)分析,獲取胞外結(jié)構(gòu)域中抗原表位豐富的肽段,并將其C 端調(diào)控結(jié)構(gòu)域(230～439 aa)構(gòu)建到pET28a-SUMO 原核表達(dá)載體,在大腸桿菌Rosetta 中,經(jīng)37℃、0.8 mmol·L-1IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),獲得與預(yù)期相符的42 kDa 的重組蛋白,經(jīng)純化后獲得 anti-VaCIPK18 多克隆抗體。Western Blot 結(jié)果表明,該抗體可以特異識(shí)別葡萄內(nèi)源的CIPK18 激酶,同時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白存在可能的磷酸化與泛素化修飾。本研究為進(jìn)一步從蛋白水平研究VaCIPK18 蛋白激酶參與低溫脅迫中的功能提供了依據(jù)。