蘇海容 袁秋虹 歐陽(yáng)菁 鄧偉民

1南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內(nèi)六科（廣州510010）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510405）

隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）已成為我國(guó)面臨的重要公共健康問(wèn)題，嚴(yán)重威脅人們的健康及生活質(zhì)量。前期研究發(fā)現(xiàn)老年男性的骨密度（bone mineral density，BMD）與總脂肪含量（total fat mass，TFM）和總肌肉含量（total lean mass，TLM）呈正相關(guān)［1］。老年人常有肌無(wú)力、骨骼肌含量減少、腹部脂肪增加、運(yùn)動(dòng)能力減退和骨密度降低等表現(xiàn)，這些與增齡引起生長(zhǎng)激素（human growth hormone，GH）分泌不足有關(guān)，生長(zhǎng)激素替代治療可以提高肌肉含量及肌肉力量、減少脂肪含量和增加骨密度［2-3］，骨密度的增加可能與GH 治療調(diào)節(jié)體質(zhì)成分有關(guān)。但重組人生長(zhǎng)激素（recombinant human growth hormone，rhGH）替代治療仍有很多問(wèn)題有待探討：治療的最佳劑量、是否引發(fā)惡性腫瘤及不良反應(yīng)等［4-5］。補(bǔ)腎壯骨顆粒治療骨質(zhì)疏松癥的療效已得到證實(shí)［6］。本試驗(yàn)以快速老化雄性小鼠（senescence acceleratedmale mice，SAMP6，P6）為研究對(duì)象，采用皮下注射rhGH 及補(bǔ)腎壯骨顆粒灌胃治療進(jìn)行研究，再次驗(yàn)證補(bǔ)腎壯骨顆粒對(duì)老年男性骨質(zhì)疏松癥骨密度提高的有效性，探討其對(duì)骨密度作用機(jī)理是否與調(diào)節(jié)體質(zhì)成分有關(guān)，為臨床應(yīng)用提供更多的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物3月齡雄性SAMP6 品系小鼠共40只，正常老化同源對(duì)照小鼠SAMR1 共10 只，均由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（批號(hào)：No.12002900000012，清潔級(jí)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物補(bǔ)腎壯骨顆粒（10 g/袋，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，批號(hào)15K04001），主要由龜板膠、鹿角膠、生地、山藥、骨碎補(bǔ)、淫羊藿、水蛭等組成。尤得盼注射用rhGH（1.33 mg/瓶，（株）LG 生命科學(xué)，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)S20140029，生產(chǎn)批號(hào)UTR15020）。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材雙能X 線（DEXA）骨密度儀（生產(chǎn)廠家：美國(guó)GE 公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)方法10 只3 個(gè)月齡雄性SAMR1 小鼠作為同源對(duì)照組。3月齡雄性SAMP6品系小鼠共40 只，分為4 組，每組各10 只。具體分組及干預(yù)情況見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)情況Tab.1 Grouping and intervention of experimental animals

所有小鼠在完全相同的條件下飼養(yǎng)，自由采食飲水。小鼠用藥劑量根據(jù)人和動(dòng)物體表面積與劑量換算比計(jì)算所得［7］，給藥后每周稱量體質(zhì)量1 次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整受試藥物劑量。干預(yù)3 個(gè)月后每組隨機(jī)選取5 只進(jìn)行測(cè)量骨密度及體質(zhì)成分測(cè)量，剩下的再繼續(xù)前方式干預(yù)，3 個(gè)月后采取同樣的方法測(cè)量。

1.4.2 觀察指標(biāo)分別于干預(yù)3 個(gè)月和6 個(gè)月后，用雙能X 線骨密度測(cè)量?jī)x測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行活體骨密度（BMD）、骨礦含量（BMC）、全身肌肉含量（TLM）、全身脂肪含量（TFM）及全身脂肪百分比（FM）檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以（）表示；多組間比較采用單因素方差分析，聯(lián)合用藥組的比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析，Boferoni 法校正，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量增長(zhǎng)結(jié)果各組體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)期間均隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加：（1）干預(yù)3 個(gè)月后，空白對(duì)照組較同源對(duì)照組體質(zhì)量高（P＜0.05）；干預(yù)6 個(gè)月后，聯(lián)合用藥組較同源對(duì)照組體質(zhì)量高（P＜0.05）。（2）兩階段干預(yù)后，P6 品系各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），P6 品系組間具有齊同可比性。見表2。

表2 干預(yù)3 個(gè)月組及6 個(gè)月后體質(zhì)量比較Tab.2 Comparison of Weight after 3 Months and 6 MonthsIntervention ±s，g

表2 干預(yù)3 個(gè)月組及6 個(gè)月后體質(zhì)量比較Tab.2 Comparison of Weight after 3 Months and 6 MonthsIntervention ±s，g

注：與同源對(duì)照組相比，*P ＜0.05；與空白對(duì)照組相比，△P ＜0.05；與補(bǔ)腎壯骨組比，#P ＜0.05；與rhGH 組相比，□P ＜0.05

組別同源對(duì)照組空白對(duì)照組補(bǔ)腎壯骨組rhGH 組聯(lián)合用藥組例數(shù)5 5 5 5 5干預(yù)3 個(gè)月25.80±1.92 29.60±1.95*31.00±0.71*29.6±1.82*30.80±1.30*干預(yù)6 個(gè)月26.40±0.89 30.80±2.50*31.80±2.59*30.60±2.88 30.20±1.48

2.2 TLM、TFM 和FM 比較TLM 比較：兩階段干預(yù)后均表現(xiàn)為：（1）同源對(duì)照組低于空白對(duì)照組（P＜0.05）；（2）rhGH 組、補(bǔ)腎壯骨組及聯(lián)合用藥組高于空白對(duì)照及同源對(duì)照組（P＜0.05）；3 組藥物干預(yù)組比較差異差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

TFM 比較：兩階段干預(yù)后均表現(xiàn)為：（1）同源對(duì)照組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；（2）與空白對(duì)照組相比，rhGH 組、補(bǔ)腎壯骨組及聯(lián)合用藥組有所下降（P＜0.05）；但3 組用藥藥物干預(yù)組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

FM 比較：（1）3 個(gè)月干預(yù)后，同源對(duì)照組較空白對(duì)照組高（P＜0.05），干預(yù)6 個(gè)月后，此兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；（2）兩階段干預(yù)后，均表現(xiàn)為與空白對(duì)照組比較，rhGH 組、補(bǔ)腎壯骨組及聯(lián)合用藥組有所下降，3 組藥物干預(yù)組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

各藥物干預(yù)組小鼠的TLM、TFM 和FM（%）組間比較經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析處理：總的校正模型均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），干預(yù)3 個(gè)月及6 個(gè)月后發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎壯骨顆粒與rhGH 間均存在負(fù)交互作用（F=5.521、7.118、13.697、9.484、10.667、27.334，均P＜0.05）。見表4 和圖1。

表4 TLM、TFM 和FM 析因設(shè)計(jì)的方差分析Tab.4 Factorial design analysis of variance of TLM，TFM and FM

圖1 兩種藥物對(duì)TLM、TFM 和FM 影響的交互作用示意圖Fig.1 Factorial design analysis of variance of TLM，TFM and FM

表3 各組TLM、TFM 和FM 比較Tab.3 The Comparison of TLM，TFM and FM in each group ±s，g

表3 各組TLM、TFM 和FM 比較Tab.3 The Comparison of TLM，TFM and FM in each group ±s，g

注：與同源對(duì)照組相比，*P ＜0.05；與空白對(duì)照相比，△P ＜0.05；與補(bǔ)腎壯骨組相比，#P ＜0.05

組別同源對(duì)照組空白對(duì)照組補(bǔ)腎壯骨組rhGH 組聯(lián)合用藥組干預(yù)3 個(gè)月TLM 17.6±1.51 22.6±1.14*26.2±0.84*△25.6±1.95*△26.4±1.14*△TFM 7.4±1.52 6.2±1.30 4.2±0.84*3.2±0.84*△3.4±0.55*△FM（%）29.86±4.75 20.82±2.95*13.72±2.44△10.82±2.12△11.26±1.27△干預(yù)6 個(gè)月TLM 17.4±1.14 20.4±0.90*24.0±2.00*△24.2±1.92*△23.6±0.89*△TFM 8.2±1.30 9.6±1.52 6.8±0.84△5.6±0.90*△6.0±1.00△FM（%）31.34±4.30 31.20±2.92 21.34±1.67△18.74±1.87△19.48±2.40△

2.3 骨密度和骨礦含量比較BMD 比較：（1）兩階段干預(yù)后，同源對(duì)照組均較空白對(duì)照組（P＜0.05）；（2）3 個(gè)月干預(yù)后，與空白對(duì)照組比較，rhGH組及聯(lián)合用藥組未見明顯變化（P＞0.05），補(bǔ)腎壯骨組有所上升（P＜0.05）；（3）6 個(gè)月干預(yù)組后，與空白對(duì)照組比較，rhGH 組、補(bǔ)腎壯骨組及聯(lián)合用藥組均有上升（P＜0.05），3 組藥物干預(yù)組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

BMC 比較：（1）兩階段干預(yù)后，同源對(duì)照組均比空白對(duì)照組高（均P＜0.05）；（2）與空白對(duì)照組相比較，rhGH 組及聯(lián)合用藥組未見明顯變化（P＞0.05），補(bǔ)腎壯骨組有所上升（P＜0.05）；補(bǔ)腎壯骨組高于rhGH 組及聯(lián)合用藥組（P＜0.05）；（3）6 個(gè)月干預(yù)后，與空白對(duì)照組相比較，rhGH組、補(bǔ)腎壯骨及聯(lián)合用藥組均有所上升（P＜0.05）；補(bǔ)腎壯骨組高于rhGH 組及聯(lián)合用藥組（P＜0.05）。見表5。

表5 各組BMD 及BMC 比較Tab.5 Comparison of BMD and BMC in each group ±s

表5 各組BMD 及BMC 比較Tab.5 Comparison of BMD and BMC in each group ±s

注：與同源對(duì)照組組相比，*P ＜0.05；與空白對(duì)照相比，△P ＜0.05，與補(bǔ)腎壯骨相比，#P ＜0.05

組別同源對(duì)照組空白對(duì)照組補(bǔ)腎壯骨組rhGH 組聯(lián)合用藥組干預(yù)3 個(gè)月BMD（g/cm2）0.070±0.004 0.064±0.002*0.069±0.002△0.062±0.003*#0.066±0.004 BMC（g）0.598±0.013 0.534±0.030*0.634±0.050△0.542±0.008#0.566±0.034#干預(yù)6 個(gè)月BMD（g/cm2）0.071±0.003 0.061±0.001*0.072±0.004△0.070±0.002△0.071±0.002△BMC（g）0.600±0.049 0.510±0.039*0.702±0.029*△0.592±0.033△#0.606±0.050△#

各藥物干預(yù)組小鼠的BMD 和BMC 組間比較經(jīng)析因設(shè)計(jì)的方差分析處理：總的校正模型差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），干預(yù)3個(gè)月及6個(gè)月后，補(bǔ)腎壯骨組與rhGH 組間對(duì)小鼠BMC 的影響均存在負(fù)交互作用（F= 6.265，26.536，均P＜0.05）。干預(yù)3 個(gè)月后，補(bǔ)腎壯骨顆粒與rhGH 對(duì)小鼠BMD的影響不存在交互作用（F= 0.441，P= 0.516）。干預(yù)6 個(gè)月后，補(bǔ)腎壯骨顆粒與rhGH 對(duì)小鼠BMD的影響存在負(fù)交互作用。見表6 和圖2。

表6 BMD 及BMC 的析因方差分析Tab.6 Factorial design analysis of variance of BMD and BMC

3 討論

老年性骨質(zhì)疏松癥的出現(xiàn)與多種因素相關(guān)，隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸降低的GH 是其中的一個(gè)重要原因。伴隨著GH 下降，肌肉含量減少及脂肪組織增加［8］，從而導(dǎo)致機(jī)體活動(dòng)功能減退，最終出現(xiàn)老年性骨質(zhì)疏松。有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)成人GH 缺乏患者采用rhGH 替代治療可增加瘦體質(zhì)量、降低脂肪含量、增加脊柱BMD 及提高等距屈膝力量，另外可阻止由正常老化導(dǎo)致的肌肉性能和神經(jīng)肌肉功能減退［9-12］。但也有研究發(fā)現(xiàn)成年人GH 替代治療可以延緩肌肉力量的下降，運(yùn)動(dòng)能力未發(fā)現(xiàn)提高［13-14］，這可能除了肌肉本身的影響外，關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能的好壞和神經(jīng)信號(hào)的強(qiáng)弱也與活動(dòng)能力有關(guān)。血清IGF-1 濃度與BMD、BMC、脂肪含量和瘦體質(zhì)量呈正相關(guān)［15］，肌肉特定部位的IGF-1 表達(dá)可提高肌肉的再生能力和防治肌纖維化［16］?？梢?，GH/IGF-1 軸本身除了直接影響成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞外［17］，還可能影響體質(zhì)成分進(jìn)而間接對(duì)BMD 產(chǎn)生影響。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎壯骨顆粒對(duì)快速老化雄性小鼠BMD 的影響可能通過(guò)調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸的功能實(shí)現(xiàn)，因此，筆者猜想補(bǔ)腎壯骨顆粒提高BMD 的作用與rhGH 替代治療相似，同樣對(duì)體質(zhì)成分有影響。因此，本研究試圖從調(diào)節(jié)體質(zhì)成分方面進(jìn)一步比較二者的作用，為在骨質(zhì)疏松癥治療中以補(bǔ)腎壯骨顆粒替代rhGH 提供更多的依據(jù)。

圖2 兩種藥物對(duì)BMC 和BMD 影響的交互作用示意圖Fig.2 Factorial design analysis of variance of BMD and BMC

快速老化小鼠SAM（Senescence accelerated mouse），是日本京都大學(xué)培育繁殖的快速老化動(dòng)物模型，分為兩個(gè)品系：一為正常老化的R 品系，二為快速老化的P 品系。R 品系的各項(xiàng)老化速度、生理指標(biāo)和正常小鼠類似，而SAMR1 通常被用作正常老化對(duì)照組。P品系老化速度加快，在4 ～6個(gè)月齡時(shí)就已經(jīng)迅速出現(xiàn)老化病理現(xiàn)象［18］。其中SAMP6 是唯一一種已經(jīng)被證實(shí)可隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)脆性骨折的動(dòng)物模型［19］，常被用為老年性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。本研究發(fā)現(xiàn)同源對(duì)照組小鼠的BMD較P6 空白對(duì)照組小鼠高，采用P6 小鼠作為老年性骨質(zhì)疏松模型進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)研究，具有一定意義。

骨質(zhì)疏松屬于中醫(yī)“骨枯”、“骨萎”、“骨痹”和“腰背痛”等范圍，致病因素多為腎虛、脾虛、肝郁、血瘀。在老年性骨質(zhì)疏松的發(fā)病過(guò)程中，骨質(zhì)疏松癥主要病機(jī)為脾腎兩虛，肝郁血瘀。補(bǔ)腎壯骨顆粒是鄧偉民教授治療骨質(zhì)疏松癥的驗(yàn)方，此方正是針對(duì)這些病因病機(jī)，從補(bǔ)腎健脾和化瘀方面著手治療。近年臨床研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎壯骨顆粒在老年男性骨質(zhì)疏松癥患者的治療中療效確切，可改善骨代謝、增加BMD、降低骨折率及緩解骨痛［20-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)3 個(gè)月及6 個(gè)月后，補(bǔ)腎壯骨顆粒干預(yù)組BMD 均有提高，再次驗(yàn)證了補(bǔ)腎壯骨顆粒治療老年男性骨質(zhì)疏松癥的療效。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干預(yù)3 個(gè)月后，3 組藥物干預(yù)組TLM 提高及FM 下降，補(bǔ)腎壯骨顆粒組的BMD 及BMC 均有所上升，但rhGH 及聯(lián)合用藥組BMD 和BMC 未見明顯變化。干預(yù)6 個(gè)月時(shí)后，3 組藥物干預(yù)的TFM 及FM（%）均有所下降、TLM 及BMD 和BMC 均有所上升，但補(bǔ)腎壯骨顆粒組的BMC 較rhGH 組及聯(lián)合用藥組高。表明rhGH 替代治療要獲得與補(bǔ)腎壯骨顆粒組同樣的BMD 變化需要延長(zhǎng)治療時(shí)間，本研究中rhGH 治療可降低TFM 和增加TLM 及BMD 的結(jié)果與前研究一致。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，聯(lián)合用藥組和單獨(dú)用藥組未見明顯優(yōu)勢(shì)，通過(guò)析因方差分析發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎壯骨顆粒與rhGH 存在拮抗作用，結(jié)合前期研究，考慮兩種藥物對(duì)體質(zhì)成分的影響均可能通過(guò)GH/IGF-1 共同信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，因此，兩種藥物在治療骨質(zhì)疏松時(shí)不宜聯(lián)合使用。

本研究存在一定的局限性，肌肉對(duì)骨的影響主要是通過(guò)肌肉收縮的力量及機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力實(shí)現(xiàn)，而本實(shí)驗(yàn)中對(duì)肌肉的評(píng)估主要依靠DXA 進(jìn)行，未能對(duì)肌肉功能如肌肉強(qiáng)度及運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)估。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎壯骨顆?？山档蚑FM 及FM（%）和提高TLM 及BMD，3 個(gè)月治療效果較rhGH 佳，6 個(gè)月治療效果與rhGH 相當(dāng)。結(jié)合前期研究，補(bǔ)腎壯骨顆粒在老年性骨質(zhì)疏松治療方面可能可替代rhGH。下一步實(shí)驗(yàn)將采取措施對(duì)肌肉功能和運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行評(píng)估。