孫晶晶，吳錦艷，曹小安，陳 妍，尹雙輝，周建華，蘭 喜，李學瑞，劉永生，尚佑軍

（中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室，甘肅 蘭州 730046）

布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌（Brucella）引起的以家畜為主的多種動物互為傳染源的一種嚴重的人畜共患傳染病[1]。臨床特征是生殖系統(tǒng)受到嚴重侵害，在雌性動物中常導致流產(chǎn)和繁殖生育力下降，在雄性動物中會導致睪丸炎和附睪炎并常發(fā)展為不育癥。在家畜中羊、牛和豬最易感染發(fā)生布魯氏菌病，其中羊種的致病力最強。對人也具有高度感染性和致病性，患病癥狀常表現(xiàn)為持續(xù)性感染、間歇性流感樣癥狀，稱作“波狀熱”，嚴重者失去勞動力[2]。人感染該病還表現(xiàn)為長期發(fā)熱、多汗、關節(jié)痛、神經(jīng)痛及肝臟、脾臟腫大等癥狀，嚴重威脅著人的生命健康[3]。OIE 將其列為B 類動物疫病，該病流行范圍廣泛，遍及世界各地。據(jù)報道家畜中存在該病的國家和地區(qū)有170 多個，其中123 個國家和地區(qū)的人有該病感染發(fā)生，布魯氏菌病是一種世界各地廣泛流行的人獸共患慢性細菌傳染病[4]。近年來，我國布魯氏菌病疫情強勢走高，患病人數(shù)逐年上升，每年約有50 萬人受到感染，嚴重危害人類健康[5]。近年我國動物布魯氏菌病出現(xiàn)新的流行趨勢，即疫區(qū)從牧區(qū)向農(nóng)區(qū)及城市蔓延，以點狀散發(fā)或點狀暴發(fā)流行[6]，因此加強該病的防控勢在必行。

我國常用的布魯氏菌疫苗主要有3 種，分別是豬種S2、牛種A19 和羊種M5 疫苗。牛種A19 疫苗在國外使用廣泛并取得良好的免疫效果，如免疫保護率達65%～75%且菌株穩(wěn)定、病原性低、免疫原性較高和不易引起懷孕母牛流產(chǎn)等優(yōu)點。羊種M5 疫苗的免疫原性好，氣霧免疫是其免疫的最佳選擇方式，免疫保護期可達一年，但該疫苗是我國目前使用的疫苗中毒力最強的毒株，易引起動物體內(nèi)毒力過高，造成懷孕動物大批流產(chǎn)而導致嚴重的經(jīng)濟損失[7]。豬種布魯氏菌S2 株是目前已知毒力最弱的光滑型布魯氏菌疫苗株，其LPS 中的O 抗原刺激機體產(chǎn)生的抗體會干擾常規(guī)血清學診斷，無法鑒別疫苗接種動物和自然野毒感染動物[8]，只能通過疫苗存續(xù)時間來鑒別。由于其毒力較弱，可以通過口服和肌肉注射等方式進行免疫，且不會導致母畜流產(chǎn)，因此S2疫苗在我國使用比較廣泛[9]。目前，我國牛羊布魯氏菌病防控工作不容樂觀，疫苗在使用過程中存在各種問題，防控工作難以順利實施。此外，缺少成熟的定性檢測方法鑒別疫苗免疫動物和自然感染動物，當前僅可通過疫苗免疫動物和感染強毒菌動物抗體的存續(xù)時間進行鑒別，關于疫苗免疫綿羊后的抗體消長規(guī)律缺乏系統(tǒng)的數(shù)據(jù)支撐。因此，本實驗通過對這3 種商品化布魯氏菌疫苗和不同免疫方式對羊群產(chǎn)生的免疫效果進行了初步研究，為布魯氏菌病防控尋找一種免疫效果穩(wěn)定、方法簡便、經(jīng)濟成本低的合理的疫苗免疫程序提供科學依據(jù)。通過對羊免疫后的抗體進行系統(tǒng)全面檢測，不僅可以全面分析不同疫苗免疫機體后的抗體消長規(guī)律，還可以更清晰的反映出布魯氏菌病防控工作中存在的問題及現(xiàn)有工作中起突出作用的防控措施，為未來制定布魯氏菌病防控策略和綜合防控措施提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 疫苗、血清及主要試劑 S2 凍干活疫苗購自金宇保靈生物藥品有限公司（批號4393039）；A19 凍干活疫苗購自重慶澳龍生物制品有限公司（批號20141001）；M5 凍干活疫苗購自青海生物藥品廠（批號YW201503）；均在有效期內(nèi)使用。布魯氏菌SAT抗原及標準陰、陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（批號201501）；布魯氏菌RBPT 抗原購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（批號201503）；布魯氏菌IgM 抗體ELISA檢測試劑盒、布魯氏菌IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒和布魯氏菌總抗體ELISA 檢測試劑盒由中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所提供，由于目前，國內(nèi)沒有針對布魯氏菌IgM 和IgG 抗體的ELISA 檢測試劑盒，所以使用本實驗室研發(fā)的布魯氏菌IgM 和IgG 抗體定量檢測ELISA 試劑盒。

1.2 實驗動物 小尾寒羊是由內(nèi)蒙古臨河區(qū)某羊場提供，選取3 月齡～6 月齡隔離飼養(yǎng)身體健康的羔羊，在免疫前采血分離血清經(jīng)虎紅平板凝集試驗（RBPT）和試管凝集試驗（SAT）檢測結果均為陰性。實驗羊群除接種本實驗中所需的疫苗外，不接種其它任何疫苗。

1.3 實驗設計 將270 只小尾寒羊羔羊隨機分為5個組，分別是M5 疫苗皮下注射組（70 只）、M5 疫苗口服組（70 只）、S2 疫苗口服組（70 只）、A19 疫苗皮下注射組（30 只）和對照組（30 只）。設計A19 疫苗皮下注射組是因為A19 疫苗通常用于牛布魯氏菌病的預防，通過采用皮下注射途徑免疫，本實驗采用皮下注射A19 疫苗免疫羊，研究該免疫方式對預防羊布魯氏菌病的可行性。設計S2 疫苗口服組是因為該疫苗的說明書介紹對小尾寒羊不能采用注射方式免疫，因此本實驗采用口服S2 疫苗免疫羊，研究該免疫方式對預防羊布魯氏菌病的免疫效果。本實驗組疫苗免疫的劑量嚴格按照說明書進行操作，對照組采用相同劑量的生理鹽水進行免疫。實驗羊免疫程序見表1。

表1 實驗設計Table 1 Experimental design

1.4 疫苗免疫后IgM抗體消長規(guī)律測定 對羔羊采用不同的疫苗免疫接種，分別在免疫后0、7 d、14 d、21 d、28 d、45 d 和60 d 采血分離血清，并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。實驗結束后采用夾心ELISA 方法[10]同時檢測所有血清樣品中IgM 抗體水平并繪制其抗體消長曲線。

1.5 疫苗免疫后IgG 抗體消長規(guī)律測定 按照實驗設計表1 的免疫程序，在免疫羔羊后0、7 d、14 d、21 d、28 d、45 d和60 d采血分離血清，并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。實驗結束后采用競爭ELISA 方法[11]同時檢測所有血清樣品中IgG 抗體水平并繪制其抗體消長曲線。

1.6 疫苗免疫后抗體持續(xù)期測定 將4 組實驗組于免疫羔羊后0、7 d、14 d、21 d、28 d、45 d、60 d、75 d、90 d、110 d 和150 d 采血分離血清，并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩嶒灲Y束后采用RBPT 和阻斷ELISA 方法[12]同時檢測所有血清樣品中抗體轉陽率并繪制其變化曲線。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 采用SPSS17.0 軟件進行分析和處理數(shù)據(jù)，對各組間平均IgM 和IgG 抗體水平采用非參數(shù)檢驗法（Nonparametric tests）進行顯著性差異分析。

2 結 果

2.1 疫苗免疫后IgM 抗體消長規(guī)律 羔羊接種疫苗前檢測不到相應IgM 抗體。不同疫苗免疫羔羊經(jīng)夾心ELISA 方法檢測后4 組實驗組IgM 抗體水平呈逐漸上升的趨勢，但各組之間IgM 抗體水平上升速度與峰值之間存在顯著差異（p＜0.01）。A19 皮下注射組和M5 皮下注射組在免疫7 d 時IgM 抗體水平均達到峰值后逐漸下降，S2 口服組和M5 口服組則在免疫14 d 時IgM 抗體水平均達到峰值后逐漸下降，A19 皮下注射組在60 d 時還可以檢測IgM 抗體，而M5 皮下注射組、S2 口服組和M5 口服組則在60 d 時已經(jīng)檢測不到IgM 抗體（圖1）。統(tǒng)計學分析結果顯示，疫苗免疫后，M5 皮下注射組、A19 皮下注射組、S2 口服組與對照組間抗體水平差異顯著（p＜0.05），但M5 口服組與對照組間差異不顯著（p＞0.05）。M5 皮下注射組與M5 口服組間抗體含量差異顯著（p＜0.05），M5 皮下注射組、A19 皮下注射組和S2 口服組間差異不顯著（p＞0.05）。表明IgM 抗體水平最高的是A19 皮下注射組，其次是M5 皮下注射組，M5 口服組抗體水平最低。

圖1 不同組羔羊疫苗免疫后布魯氏菌IgM 抗體消長規(guī)律檢測結果Fig.1 Growth and decline of IgM antibody agains Brucella after immunization with different groups of lamb vaccines

2.2 疫苗免疫后IgG 抗體消長規(guī)律 羔羊接種疫苗前測不到相應IgG 抗體。不同疫苗免疫羔羊后經(jīng)競爭ELISA 方法檢測結果顯示，實驗組IgG 抗體水平呈逐漸上升的趨勢，但各組之間IgG 抗體水平上升速度與峰值之間存在顯著差異（p＜0.01）。M5 皮下注射組和S2 口服組在免疫7 d 時IgG 抗體水平均達到峰值，且M5 疫苗產(chǎn)生IgG 抗體水平高于S2 疫苗，在28 d 時M5 疫苗產(chǎn)生IgG 抗體水平又逐漸上升，S2疫苗產(chǎn)生的IgG 抗體則持續(xù)降低。A19 皮下注射組于免疫14 d 時IgG 抗體水平達到峰值約800 μg/mL，之后IgG 抗體水平逐漸下降，在免疫21 d 時A19 皮下注射組IgG 抗體水平又逐漸上升，在28 d 時達到高峰約700 μg/mL，然后逐漸下降。M5 口服組疫苗免疫后IgG 抗體水平逐漸上升，在28 d 時達到峰值約370 μg/mL，然后IgG 抗體水平逐漸下降，在60 d時IgG 抗體水平下降到約100 μg/mL（圖2）。統(tǒng)計學分析結果顯示，疫苗免疫后，M5 皮下注射組、M5口服組、A19 皮下注射組、S2 口服組與對照組間抗體含量差異顯著（p＜0.05），M5 皮下注射組、A19 皮下注射組、S2 口服組與M5 口服組間抗體含量差異顯著（p＜0.05），但M5 皮下注射組、A19 皮下注射組和S2 口服組間差異不顯著（p＞0.05）。表明IgG 抗體水平最高的是M5 皮下注射組，其次是S2 口服組，M5 口服組抗體水平最低。

圖2 不同組羔羊疫苗免疫后布魯氏菌IgG 抗體消長規(guī)律檢測結果Fig.2 Growth and decline of IgG antibody against Brucella after immunization with different groups of lamb vaccines

2.3 疫苗免疫后抗體持續(xù)期試驗結果 不同疫苗免疫羔羊后經(jīng)RBPT 和阻斷ELISA 方法檢測結果顯示，不同疫苗免疫組抗體轉陽率逐漸升高后，隨時間延長抗體轉陽率呈逐漸下降的趨勢。M5 皮下注射組采用RBPT 檢測則在免疫14 d 時抗體轉陽率達到峰值為67%，采用阻斷ELISA 方法檢測在免疫7 d 時抗體轉陽率達到峰值為71%（圖3A），而M5口服組采用RBPT 檢測則在免疫14 d 時抗體轉陽率達到峰值為41%，采用阻斷ELISA 方法檢測在免疫21 d 時抗體轉陽率達到峰值為37%（圖3C），表明M5 疫苗皮下注射抗體轉陽率高于M5 口服組。A19 皮下注射組在免疫14 d 時經(jīng)RBPT 和阻斷ELISA方法檢測抗體轉陽率達到峰值均為56%（圖3B），A19 皮下注射組在免疫14 d～60 d 內(nèi)抗體都維持在較高的水平，表明A19 疫苗可以用于預防羊布魯氏菌病。S2 口服組在免疫14 d 時經(jīng)RBPT 和阻斷ELISA 方法檢測抗體轉陽率均達到峰值分別為45%和38%（圖3D），表明S2 口服組抗體轉陽率明顯高于M5 口服組。M5 皮下注射組、M5 口服組、A19 皮下注射組和S2 口服組在免疫150 d 時部分個體還可以檢測抗體水平，則表明4 組實驗組抗體水平持續(xù)期大約為150 d。

圖3 不同組羔羊疫苗免疫后布魯氏菌抗體轉陽率變化檢測結果Fig.3 Changes of the transformation rate of Brucella antibodies after immunization with different groups of lamb vaccines

3 討 論

布魯氏菌是革蘭氏陰性菌兼性細胞內(nèi)寄生的細菌，具有獨特的細胞內(nèi)生存和免疫的機制，是一種自然疫源性疾病。根據(jù)免疫學理論，布魯氏菌自然感染或人工免疫后，在動物體內(nèi)首先產(chǎn)生IgM 抗體，隨后IgG 抗體水平逐步升高達到較高的水平并維持整個感染的過程。

已有研究證實，RBPT 主要檢測IgG 類抗體，具有較高的敏感性，適用于大規(guī)模普查。SAT 是以檢測IgM 類抗體為主，對IgG 類抗體幾乎不敏感，因此可以作為早期診斷[13]，羊在感染布魯氏菌后，會刺激機體產(chǎn)生免疫應答反應，從而激發(fā)體液免疫和細胞免疫。體液免疫是機體適應性免疫應答中的重要組成部分，在防御外來病原入侵方面發(fā)揮著重要的作用，而細胞免疫對于胞內(nèi)寄生菌的清除起著主要作用[14]。目前認為，在布魯氏菌疫苗免疫預防中，疫苗接種后通過特異性抗體檢測評價免疫效果，但是布魯氏菌病的免疫保護主要體現(xiàn)在細胞免疫水平，免疫抗體水平的檢測只是對疫苗是否免疫成功的一個反應指標，因此抗體水平與畜群機體保護力不呈正相關[15]。弄清不同布魯氏菌疫苗其抗體的消長規(guī)律及疫苗本身特性，可為制定合理的免疫程序提供重要依據(jù)，也為疫苗生產(chǎn)以及致病機制研究提供參考依據(jù)。

本研究采用不同的布魯氏菌疫苗對小尾寒羊進行免疫試驗，通過分析免疫抗體水平表明，羔羊皮下注射法免疫M5 疫苗后產(chǎn)生IgM 抗體、IgG 抗體及抗體轉陽率明顯高于口服法，其抗體維持時間明顯長于口服法，發(fā)現(xiàn)M5 疫苗皮下注射比口服要更早產(chǎn)生IgM 和IgG 抗體，刺激機體更早產(chǎn)生免疫應答，表現(xiàn)出良好的抗原性和免疫效果。與魯志平等報道羊經(jīng)M5 疫苗口服免疫后，在第7 d 平均效價達到最高并達到峰值的研究成果有所差異。這可能與羊的品種和地域不同有關，需要進一步驗證。本實驗采用皮下注射A19 疫苗免疫羊，研究該免疫方式對預防羊布魯氏菌病的可行性。根據(jù)對羔羊使用A19 疫苗的免疫效果監(jiān)測分析表明，A19 疫苗在免疫7 d～14 d 時IgM 和IgG 抗體水平快速達到峰值，其抗體轉陽率在免疫14 d～60 d 內(nèi)都維持在較高的水平，可以刺激機體更早產(chǎn)生免疫應答，可以廣泛用于羊的布魯氏菌病免疫預防。這與馮宇研究A19 疫苗注射奶牛后在免疫15 d 時IgM 和IgG 抗體水平達到峰值的研究結果相似。羔羊口服免疫S2 疫苗后產(chǎn)生IgM 抗體、IgG 抗體及抗體轉陽率明顯高于口服M5 疫苗，其對小尾寒羊的抗體持續(xù)期約為5 個月，發(fā)現(xiàn)口服S2 疫苗比口服M5 疫苗要更早產(chǎn)生IgM 和IgG 抗體，刺激機體更早產(chǎn)生免疫應答，表現(xiàn)出良好的抗原性和免疫效果。本研究結果中，S2 疫苗免疫羊后在14 d 血清抗體水平達到峰值。根據(jù)抗體水平初步證明，A19 疫苗可以用于羊布魯氏菌病的免疫，皮下注射M5 疫苗的免疫效果最好，口服S2 疫苗免疫效果優(yōu)于口服M5 疫苗。結果提示在臨床免疫工作中應根據(jù)疫苗本身的特性及流行特點，選擇具有良好免疫原性的疫苗及合適的免疫途徑。從檢測方法來看，RBPT 和ELISA 方法檢測抗體陽性率曲線基本一致，但ELISA 檢出的陽性數(shù)高于RBPT。原因可能與ELISA 是以檢測血清抗體總抗體為主，而RBPT 則以IgG 抗體為主有關。因此，建議在大量樣本檢測時首先使用RBPT 進行初檢，對疑似陽性的用ELISA 進行復檢以保證檢測結果準確可靠。

綜上所述，A19 疫苗能夠有效刺激機體產(chǎn)生較高的抗體，M5 疫苗皮下注射免疫效果明顯優(yōu)于口服免疫，S2 株疫苗因免疫方式的局限，所以抗體水平明顯低于前兩者，但因其適用宿主廣泛、毒力弱，所以在我國預防動物布魯氏菌病時廣泛使用的布魯氏菌疫苗主要為S2 株。由于活疫苗主要產(chǎn)生細胞免疫，口服免疫主要產(chǎn)生黏膜免疫和細胞免疫，血清抗體水平不是判斷疫苗保護效率的唯一因素，所以肌肉注射的實際免疫效果是否優(yōu)于口服免疫尚不確定。而3 種疫苗單次免疫雖然抗體產(chǎn)生很快，但抗體存續(xù)時間較短，須經(jīng)過加強免疫才能達到較好的免疫保護力。在布魯氏菌病控制和防控工作中，選擇具備良好免疫原性的疫苗接種易感動物，根據(jù)疫苗的特性及本研究中不同種疫苗接種動物后的抗體消長情況制定合理的免疫程序，推廣快速、敏感、簡便的檢測方法，對于盡快控制布魯氏菌病的流行，減少因布魯氏菌病對畜牧業(yè)、旅游業(yè)及貿(mào)易中導致的經(jīng)濟損失，降低對人類的感染風險起至關重要的作用。