周春霞，馮 瑞，李 婷，楊 萍，洪鵬志

低鹽條件下SDS對(duì)羅非魚(yú)肌球蛋白熱聚集的抑制及其機(jī)理

周春霞1,2，馮 瑞1，李 婷1，楊 萍1,2，洪鵬志1,2

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 // 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524088；2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江），廣東 湛江 524088）

【目的】探討十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）對(duì)低鹽條件下肌球蛋白熱聚集的抑制效果及機(jī)理。【方法】提取羅非魚(yú)（）肌球蛋白，比較精氨酸、蔗糖和SDS對(duì)肌球蛋白熱聚集的抑制效果，確定添加3 mmol/L的SDS，進(jìn)一步分析0 ~ 150 mmol/L KCl的低鹽條件下，熱處理（50 ℃，30 min）對(duì)肌球蛋白體系濁度、溶解度、分子結(jié)構(gòu)及粒度分布的影響。【結(jié)果】在實(shí)驗(yàn)鹽濃度范圍內(nèi)，肌球蛋白溶解性差，體系渾濁，經(jīng)熱處理后溶解度明顯下降（< 0.05），表面疏水性增大，α-螺旋含量減?。? 0.05），肌球蛋白分子熱變性聚集明顯；添加SDS后，表面疏水性增大（< 0.05），微量SDS與肌球蛋白產(chǎn)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致纖絲解離，分子間靜電斥力增加，平均粒徑減?。? 0.05），在1 ~ 100 mmol/L KCl范圍內(nèi)溶解度明顯增大（< 0.05），SDS對(duì)肌球蛋白的增溶效果明顯；SDS-肌球蛋白親水復(fù)合體經(jīng)熱處理后分子進(jìn)一步展開(kāi)，表面疏水性明顯增大（< 0.05），體系仍然澄清透明，分子間無(wú)明顯的熱聚集?！窘Y(jié)論】SDS可抑制肌球蛋白的熱聚集，其抑制機(jī)理與低離子強(qiáng)度下SDS與蛋白分子間通過(guò)靜電和疏水相互作用結(jié)合導(dǎo)致肌球蛋白纖絲解離有關(guān)。

羅非魚(yú)；肌球蛋白；SDS；低鹽濃度；熱聚集；靜電相互作用；疏水相互作用

肌球蛋白是水產(chǎn)和陸地動(dòng)物肉類(lèi)蛋白質(zhì)的重要成分，魚(yú)肌球蛋白占魚(yú)肌肉肌原纖維蛋白的55% ~ 60%[1]。肌球蛋白分子是長(zhǎng)型不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，由兩條重鏈和兩對(duì)輕鏈構(gòu)成，兩條重鏈的N-端區(qū)域與輕鏈結(jié)合形成球狀頭部，兩條重鏈的C-端折疊形成α-螺旋的長(zhǎng)桿狀尾部[2]。在體外低離子強(qiáng)度（< 0.2 mol/L KCl）條件下，肌球蛋白分子聚集成纖絲，呈不溶狀態(tài)[1, 3]，但與陸地動(dòng)物肉類(lèi)蛋白相比，魚(yú)肌球蛋白熱穩(wěn)定性差，熱處理極易導(dǎo)致聚集沉淀。通常，球蛋白熱變性過(guò)程涉及分子的展開(kāi)、內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露，分子間強(qiáng)的疏水相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集[4]。因此，如何提高肌球蛋白在低鹽條件下的溶解性，改善體系的熱穩(wěn)定性，是蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的問(wèn)題之一。目前，關(guān)于蛋白質(zhì)溶解性和熱穩(wěn)定性改善的研究較多，最常用的是添加小分子穩(wěn)定劑，如使用有機(jī)滲透劑[5]、氨基酸[6]、表面活性劑[7-15]等增加溶解性和抑制蛋白質(zhì)的熱變性聚集。

表面活性劑具有獨(dú)特的兩親性，可能通過(guò)靜電相互作用或疏水相互作用與蛋白質(zhì)分子側(cè)鏈氨基酸特異性結(jié)合，降低蛋白質(zhì)分子間的結(jié)合作用，改善蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[7-10]，但這種特異性結(jié)合作用與表面活性劑類(lèi)型、濃度和環(huán)境條件等密切相關(guān)。通常，非離子型表面活性劑與蛋白質(zhì)分子的相互作用較弱，而離子型表面活性劑與蛋白質(zhì)分子的相互作用較強(qiáng)，對(duì)蛋白質(zhì)熱變性聚集的抑制更為有效[9,11]。SDS是典型的陰離子表面活性劑，在極低濃度下不會(huì)形成膠束，以單體形式在牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）分子特定的非極性基團(tuán)和帶正電基團(tuán)之間形成橋鍵，在熱處理（65 ℃，30 min）中保護(hù)蛋白質(zhì)分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)[7]，且這種保護(hù)效應(yīng)在熱處理溫度達(dá)到85℃時(shí)仍起作用[8]，而相同熱處理?xiàng)l件下陽(yáng)離子表面活性劑對(duì)BSA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)保護(hù)作用[7]。SDS亦可提高牛乳清蛋白和酪蛋白的熱穩(wěn)定性[9]。少量SDS可誘導(dǎo)酪蛋白膠束解離和分子部分展開(kāi)，隨著SDS濃度的增加，展開(kāi)的多肽鏈重新折疊成新的小分子SDS-酪蛋白復(fù)合體，分子呈熔球態(tài)，由此抑制酪蛋白的熱變性自組裝[12]。此外，不同陰離子表面活性劑對(duì)蛋白質(zhì)熱變性的抑制效果不同，SDS、硬脂酰2-乳酸鈉和雙乙酰酒石酸單甘酯均可提高乳清蛋白的熱變性溫度，比較而言，SDS和硬脂酰2-乳酸鈉的抑制效果更佳[13]。在大量傳統(tǒng)表面活性劑研究的基礎(chǔ)上，也逐漸引入新型功能表面活性劑和生物表面活性劑等。與單鏈陽(yáng)離子表面活性劑相比，新型雙子表面活性劑與BSA的結(jié)合更強(qiáng)[14]。但相關(guān)研究主要集中在BSA[7-8,10,14]、乳蛋白[9,12-13,16]、雞蛋蛋白[11]和大豆蛋白[15]等，與水產(chǎn)蛋白相關(guān)的報(bào)道極少。因此，本研究在溶解性和熱穩(wěn)定性較差的低鹽濃度（≤0.15 mmol/L KCl）條件下，分析SDS對(duì)羅非魚(yú)肌球蛋白熱變聚集的影響及機(jī)理，為魚(yú)蛋白在低鹽條件下的增溶和穩(wěn)態(tài)化研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活羅非魚(yú)（）體質(zhì)量（900±100）g，購(gòu)自湛江當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，取背部白肉，分裝，?75 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫蝗u基甲基氨基甲烷 [tris-(hydroxymethyl)-aminomethane，Tris]、蔗糖，廣州化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、脲、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），廣東光華科技股份有限公司；氯化鉀、六水合氯化鎂、硫酸銨，購(gòu)于廣州化學(xué)試劑廠；5-腺苷三磷酸二鈉鹽（adenosine-5′-disodium triphosphate hydrate，ATP）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、馬來(lái)酸（maleic acid，MA），廣州齊云生物科技有限公司；乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸 [ethylene glycol-bis-(2-aminoethy lether)- N,N,N′,N′-tetraacetic acid，EGTA]，上海源葉生物科技有限公司；快速Lowry法蛋白含量測(cè)定試劑盒（2000T），上海荔達(dá)生物科技有限公司；精氨酸 [-(+)-arginine]，日本TCI公司；8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS），美國(guó)SIGMA公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C數(shù)顯pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；UV-2550型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Chirascan圓二色譜儀，英國(guó)應(yīng)用光物理公司；Zetasizer Nano納米粒度分析儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；RF-5301P熒光分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取 參照Hwang等[16]的方法并進(jìn)行了改進(jìn)。提取過(guò)程中所有操作均在4 ℃條件下進(jìn)行，所有溶液均預(yù)先配制并冷卻到4℃。取攪碎的魚(yú)肉500 g，加入2 500 mL磷酸鹽緩沖液A（20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，pH 7.0，0.2 g/L NaN3），高速勻漿（20 000 r/min，30 s），浸提15 min后離心（5 500，10 min），取沉淀重復(fù)上述過(guò)程2次。最后所得沉淀中加入3倍體積的提取液B（0.45 mol/L KCl，5 mmol/L ATP，7.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L DTT，pH 6.4），攪打15 min，離心（10 000，10 min）。用四層紗布過(guò)濾上清液，取濾液用9倍蒸餾水稀釋?zhuān)o置10 min后離心（6 000，10 min）得到沉淀。沉淀中加入1/5倍體積的緩沖液C（0.12 mol/L Tris-MA，3 mol/L KCl，0.6 mmol/L DTT，pH 7.5），混勻后放置2 h，混合體系中添加1/10倍體積的溶液D（0.11 mol/L ATP，55 mmol/L MgCl2，5.5 mmol/L EGTA，pH 7.5），攪拌1 h。加入硫酸銨至其飽和度40%時(shí)離心（10 000，15 min）取上清液，在上清液中繼續(xù)加硫酸銨至飽和度45%時(shí)離心（10 000，15 min）取沉淀。沉淀于透析液E（20 mmol/L PBS，0.6 mol/L KCl，0.1 mmol/L DTT，pH 7.0）中透析至無(wú)SO42-檢出，最后高速離心（50 000，60 min），所得上清液即為肌球蛋白溶液。采用Lowry法試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)計(jì)算蛋白質(zhì)純度為93%。

1.3.2 肌球蛋白溶液的制備及熱處理 將提取的肌球蛋白溶液分成5組，分別用含1、20、50、100、150 mmol/L KCl的緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.0）透析24 h（4 ℃），采用Lowry法試劑盒檢測(cè)其蛋白質(zhì)含量，并用對(duì)應(yīng)鹽濃度的透析液稀釋至2.0 mg/mL。在3種添加劑對(duì)熱聚集抑制的比較實(shí)驗(yàn)中，選取含1、150 mmol/L KCl的肌球蛋白溶液，分別加入0 ~ 10 mmol/L的精氨酸、蔗糖和SDS，根據(jù)低鹽條件下肌球蛋白的熱變性溫度選取50 ℃溫和熱處理，保溫30 min后迅速取出在冰水中冷卻至4 ℃?zhèn)溆谩Ｔ赟DS抑制效果及機(jī)理實(shí)驗(yàn)中，不同鹽濃度的蛋白溶液分成4組，分別進(jìn)行以下處理：1）對(duì)照組，未處理；2）熱處理組，50 ℃熱處理30 min；3）SDS組，添加3 mmol/L SDS；4）SDS-熱處理組，添加3 mmol/L SDS，50 ℃熱處理30 min。迅速取出在冰水中冷卻至4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 濁度和溶解度的測(cè)定 經(jīng)不同處理的蛋白溶液（2.0 mg/mL）室溫下拍攝實(shí)物圖。參照Hemung和Yongsawatdigul[17]的方法，另取適量蛋白樣液用對(duì)應(yīng)緩沖液稀釋至0.5 mg/mL，以溶液在350 nm波長(zhǎng)處的光密度（OD350nm）表示蛋白樣品的濁度。

取不同處理的肌球蛋白溶液離心（50 000，15 min，4 ℃）取上清液，采用Lowry法檢測(cè)其蛋白含量。溶解度按離心所得上清液蛋白濃度占未處理前溶液中總蛋白濃度的百分比計(jì)算。

1.3.4 表面疏水性的測(cè)定 用ANS熒光探針?lè)╗18]檢測(cè)可溶性肌球蛋白的表面疏水性。將不同方法處理的可溶性肌球蛋白溶液逐步稀釋?zhuān)?.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL），取不同濃度的溶液各4 mL，分別加入20 μL的ANS溶液（8.0 mmol/L ANS，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 7.0），混勻后靜置10 min（避光），測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度（FI）。實(shí)驗(yàn)中所用的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為374 nm和485 nm，狹縫寬為5 nm。樣品的FI值減去各樣品溶液未加探針時(shí)的FI值即為蛋白質(zhì)的相對(duì)熒光強(qiáng)度值（RFI）。以RFI值對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，其初始段的斜率作為蛋白質(zhì)的表面疏水性指標(biāo)（ANS-0）。

1.3.5 二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析 將不同處理前后的肌球蛋白溶液用對(duì)應(yīng)緩沖液稀釋至100 μg/mL，進(jìn)行圓二色譜測(cè)定。波長(zhǎng)掃描范圍為190 ~ 260 nm，樣品池光徑為1 mm，測(cè)量溫度為4 ℃，測(cè)定分辨率為0.5 mm，掃描速度為100 nm/min，靈敏度為 20 mdeg，響應(yīng)時(shí)間為0.25 s，以未添加肌球蛋白的緩沖液作空白，實(shí)驗(yàn)值為3次掃描的均值，α-螺旋含量（比例）計(jì)算[19]：

[]222= []obs× 1 000 ×w/(×)， （1）

α-螺旋比例(%) = []222× 100 / (?40 000)，（2）

式中，[]obs為222 nm處的橢圓率，mdeg；[]222為222 nm處的摩爾橢圓率，(°)·cm2·dmol-1；w為肌球蛋白的平均殘基分子質(zhì)量，取115 g/mol；為肌球蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL；為比色皿光程長(zhǎng)度，cm。

1.3.6 平均粒徑測(cè)定 采用Zetasizer Nano納米粒度分析儀，利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)（dynamic light scattering，DLS），采用He-Ne激光在633 nm下對(duì)不同處理的肌球蛋白（1.0 mg/mL）進(jìn)行平均粒徑測(cè)定，采用90°散射角對(duì)樣品進(jìn)行除塵。樣品注入樣品池中，穩(wěn)定1 min后在室溫下進(jìn)行測(cè)試。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)從肌球蛋白提取開(kāi)始重復(fù)3次，每個(gè)樣品測(cè)量也重復(fù)3次以上。使用JMP 7.0軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），并用新復(fù)極差法（shortest significant ranges，SSR）進(jìn)行多重比較；采用Origin 7.5軟件對(duì)各指標(biāo)變化趨勢(shì)作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 3種添加劑對(duì)肌球蛋白熱聚集的抑制效果比較

固定肌球蛋白濃度2.0 mg/mL，在兩種代表性的鹽濃度條件下，精氨酸、蔗糖和SDS的添加量（0 ~ 10 mmol/L）對(duì)熱誘導(dǎo)（50 ℃，30 min）肌球蛋白溶解度的影響結(jié)果如圖1。

由圖1可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，添加精氨酸和蔗糖的蛋白體系，隨著添加量的增大，熱處理后溶解度的增加不大，表明蔗糖和精氨酸對(duì)肌球蛋白熱聚集抑制作用不明顯，而添加SDS后溶解度明顯增大（< 0.05）。在1 mmol/L KCl溶液中，肌球蛋白分子聚集呈纖絲狀態(tài)[3]，體系的熱穩(wěn)定性差，熱處理后可溶性蛋白含量低于10%，而添加SDS后，溶解度迅速增大（< 0.05），當(dāng)添加量達(dá)3 mmol/L后變化趨于穩(wěn)定，表明SDS可明顯抑制低離子強(qiáng)度下肌球蛋白的熱聚集。SDS是陰離子表面活性劑，在濃度極低（如1 mmol/L）時(shí)不能形成膠束，也不能在蛋白質(zhì)分子表面形成聚集體[7-8,20]，而以單體形式在蛋白質(zhì)分子特定作用位點(diǎn)間形成橋鍵，即十二烷基硫酸根離子的頭部與蛋白質(zhì)分子表面帶正電基團(tuán)通過(guò)靜電作用結(jié)合，非極性尾部與蛋白質(zhì)分子表面特定的非極性基團(tuán)通過(guò)疏水作用結(jié)合，由此抑制分子間的聚集，在熱變性[7-8,13]和脲變性[10,20]中保護(hù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，但這種特異性結(jié)合作用與表面活性劑類(lèi)型、濃度和環(huán)境條件等密切相關(guān)。一方面，隨著濃度的增加，單體陰離子表面活性劑與蛋白質(zhì)分子的特異性結(jié)合可能轉(zhuǎn)變成表面聚集，甚至形成膠束，由此可能保護(hù)或破壞蛋白質(zhì)分子的穩(wěn)定性[13]；另一方面，隨著離子強(qiáng)度的增加，離子型表面活性劑與蛋白質(zhì)分子間的相互作用減弱[13]，SDS的電性和水化作用被破壞，反離子結(jié)合度增大，加劇了膠束的形成[21]。因此，本研究中，當(dāng)KCl濃度為150 mmol/L時(shí)，SDS的添加量對(duì)熱誘導(dǎo)肌球蛋白體系溶解度的影響與1 mmol/L KCl條件下的變化相似，但抑制效果明顯減弱。為此，選擇SDS添加量為3 mmol/L，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)其對(duì)低鹽條件（1～150 mmol/L KCl）下肌球蛋白熱聚集的抑制及機(jī)理。

2.2 SDS對(duì)熱處理前后肌球蛋白體系濁度和溶解度的影響

在不同鹽濃度的肌球蛋白溶液中添加3 mmol/L SDS，試驗(yàn)溫和熱處理（50℃，30 min）對(duì)肌球蛋白體系濁度和溶解度的影響如圖2所示。圖2可見(jiàn)，隨著鹽濃度的增加，體系濁度下降，可檢測(cè)的濁度值減?。? 0.05），但在實(shí)驗(yàn)KCl濃度范圍內(nèi)，肌球蛋白溶解度較低，體系渾濁；熱處理后濁度明顯增大，溶解度下降（<0.05），可溶性蛋白的含量低于10%，且伴隨有不透明弱凝膠形成的趨勢(shì)，表明在低離子強(qiáng)度下肌球蛋白分子發(fā)生了明顯的熱聚集；添加3 mmol/L SDS后，體系變得澄清，在1 ~ 100 mmol/L KCl范圍內(nèi)，濁度明顯下降，溶解度增加（< 0.05），表明SDS對(duì)肌球蛋白增溶效果明顯，少量陰離子表面活性劑與蛋白質(zhì)分子通過(guò)靜電作用和疏水作用產(chǎn)生特異性結(jié)合[7-8]，形成帶負(fù)電荷的親水復(fù)合體，分子間靜電斥力增加，抑制肌球蛋白纖絲的形成[1, 22]；SDS-肌球蛋白復(fù)合體經(jīng)熱處理后，體系仍然澄清透明，可溶性蛋白含量甚至高于對(duì)照組（1 ~ 100 mmol/L KCl），表明低鹽條件下SDS對(duì)肌球蛋白有增溶和抑制熱聚集的效果，與SDS對(duì)BSA[7-8]、乳清蛋白[9,13]、大豆11S蛋白[15]等熱穩(wěn)定性的影響類(lèi)似，微量陰離子表面活性劑可抑制蛋白分子間的熱聚集[7,10,13]，但抑制效果隨鹽濃度的增加而減弱[13]。當(dāng)KCl濃度增至150 mmol/L時(shí)，與熱處理組比較，添加SDS的熱處理組體系濁度明顯下降（< 0.05），溶解度增加（< 0.05），但溶液發(fā)生明顯的絮凝，且聚集的狀態(tài)與直接熱處理體系渾濁的狀態(tài)不同（圖2 a），由此表明，微量SDS可能導(dǎo)致肌球蛋白的熱聚集機(jī)制發(fā)生變化。因此，微量SDS與蛋白質(zhì)分子間的特異性結(jié)合對(duì)肌球蛋白體系有明顯的增溶和熱聚集抑制作用，這種增溶和保護(hù)效應(yīng)隨離子強(qiáng)度的增加而減弱。

圖（a）中的1、2、3、4分別為對(duì)照組、熱處理組、SDS組和SDS-熱處理組；圖（b）和（c）中不同大寫(xiě)字母表示同一鹽濃度樣品不同處理組間的比較，不同小寫(xiě)字母表示相同處理方式的不同鹽濃度樣品間的比較，凡含一個(gè)相同字母，則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.3 SDS對(duì)熱處理前后肌球蛋白疏水性的影響

8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）是一種帶負(fù)電荷的疏水探針，可通過(guò)疏水作用和靜電作用與蛋白質(zhì)表面疏水基團(tuán)結(jié)合，由此檢測(cè)蛋白質(zhì)分子表面疏水性的變化，探討可溶性肌球蛋白球狀頭部三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化[18]。如圖3所示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組可溶性肌球蛋白ANS0值均隨離子強(qiáng)度的增加而增大，分析可能與中性鹽的添加導(dǎo)致肌球蛋白表面疏水區(qū)域暴露[22-23]及不同離子強(qiáng)度下肌球蛋白分子的聚集狀態(tài)有關(guān)。在1 mmol/L KCl溶液中，肌球蛋白分子聚集呈纖絲[3]，溶解性較低，熱誘導(dǎo)不能充分展開(kāi)的肌球蛋白纖絲直接聚集[24]，表面疏水性下降；而隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)分子間靜電相互作用被破壞，肌球蛋白纖絲部分解離[1,3]，疏水基團(tuán)暴露，結(jié)合更多的ANS探針，當(dāng)體系KCl濃度為150 mmol/L時(shí)，肌球蛋白的溶解性和表面疏水性明顯增加（< 0.05），熱誘導(dǎo)分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，分子間強(qiáng)的疏水相互作用導(dǎo)致其聚集，溶解度下降（圖2 c），未沉淀的可溶性蛋白組分表面疏水性增加（< 0.05）。添加3 mmol/L的SDS后，可溶性肌球蛋白分子的表面疏水性較對(duì)照組明顯增大（<0.05），可能與SDS誘導(dǎo)的肌球蛋白纖絲解離及疏水基團(tuán)的暴露有關(guān)。SDS與蛋白質(zhì)分子特異性的結(jié)合可能導(dǎo)致多肽鏈升展[12, 23, 25]，疏水基團(tuán)暴露，肌球蛋白纖絲逐漸解離，溶解度增加（圖2 c），SDS-肌球蛋白親水復(fù)合體經(jīng)熱處理后，解離的肌球蛋白重鏈頭部進(jìn)一步展開(kāi)，更多的疏水基團(tuán)暴露于表面，導(dǎo)致可溶性蛋白（1 ~ 100 mmol/L KCl）的ANS-0值進(jìn)一步增大（< 0.05）。因此，蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)SDS的存在極為敏感，疏水基團(tuán)暴露，陰離子表面活性劑與肌球蛋白分子的特異性結(jié)合導(dǎo)致纖絲解離，肌球蛋白的溶解性和熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。

2.4 SDS對(duì)熱處理前后肌球蛋白α-螺旋含量的影響

肌球蛋白分子包含棒狀尾部和球狀頭部，棒狀尾部由α-螺旋構(gòu)成[1]。α-螺旋結(jié)構(gòu)主要靠多肽鏈上羰基（—CO）和氨基（—NH）之間的氫鍵維持[26]，其含量變化可反映肌球蛋白分子棒狀尾部的變化。由圖4可知，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著鹽濃度的增大，肌球蛋白α-螺旋含量增加；熱處理后，肌球蛋白分子尾部螺旋結(jié)構(gòu)展開(kāi)，α-螺旋含量減小（< 0.05）；添加SDS后，分子疏水基團(tuán)暴露，肌球蛋白與SDS因疏水相互作用和靜電相互作用形成表面帶負(fù)電荷的親水復(fù)合體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)部氫鍵斷裂[7,27]，二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，α-螺旋含量減少，且隨著離子強(qiáng)度的增加，SDS導(dǎo)致的肌球蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)損失更為明顯。但在1 mmol/L KCl溶液中，添加SDS后α-螺旋含量增加（< 0.05），可能與SDS導(dǎo)致的肌球蛋白纖絲解離和溶解度增加有關(guān)，也有報(bào)道SDS可使BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量增加[12,27]。在1～100 mmol/L KCl范圍內(nèi)，增溶后的SDS-肌球蛋白溶液經(jīng)熱處理后，α-螺旋含量下降，但與未添加SDS的熱處理組比較，α-螺旋含量明顯增加（< 0.05），表明熱處理過(guò)程中SDS可較好地保護(hù)肌球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，與SDS對(duì)BSA[7-8]、乳清蛋白[9]、大豆11S蛋白[15]等熱處理過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)的保護(hù)類(lèi)似，SDS以單體形式在蛋白質(zhì)分子特定作用位點(diǎn)間形成橋鍵[7-8,10]，抑制蛋白質(zhì)分子聚集，而150 mmol/L KCl下，SDS的添加對(duì)熱處理中肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)無(wú)保護(hù)作用。因此，SDS的添加可較好地保護(hù)低離子強(qiáng)度下肌球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但這種保護(hù)效果隨鹽濃度的增加而減弱。

不同大寫(xiě)字母表示同一鹽濃度樣品經(jīng)不同處理的差異顯著（P < 0.05），不同小寫(xiě)字母表示相同處理方式的不同鹽濃度樣品差異顯著（P < 0.05）。

不同大寫(xiě)字母表示同一鹽濃度樣品不同處理組間的比較，不同小寫(xiě)字母表示相同處理方式的不同鹽濃度樣品間的比較，凡含一個(gè)相同字母則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.5 SDS對(duì)熱處理前后肌球蛋白平均粒徑的影響

熱處理可誘導(dǎo)肌球蛋白分子聚集，因此可通過(guò)粒徑分布表示肌球蛋白在溶液中的分散和溶解[4]。SDS對(duì)熱處理前后肌球蛋白平均粒徑大小的影響如圖5所示。

不同大寫(xiě)字母表示同一鹽濃度樣品不同處理組間的比較，不同小寫(xiě)字母表示相同處理方式的不同鹽濃度樣品間的比較，凡含一個(gè)相同字母則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

圖5可見(jiàn)，在1 ~ 50 mmol/L KCl范圍內(nèi)，肌球蛋白分子聚集，呈纖絲[3]，粒徑較大，肌球蛋白纖絲熱處理過(guò)程中分子頭部不能充分展開(kāi)和相互作用[24]，分子表面疏水性增加不明顯（圖3），纖絲迅速聚集形成大的聚集體，平均粒徑顯著增大（< 0.05），體系明顯渾濁（圖1），且粒度分布曲線呈單峰（分布圖未列出）。而在高鹽條件（> 0.3 mol/L KCl）下，粒度分布曲線呈雙峰，肌球蛋白單體和纖絲共存，其比例取決于環(huán)境條件[28]。隨著離子強(qiáng)度的增加，鹽離子的作用導(dǎo)致肌球蛋白纖絲部分解離[1,3]，體系逐漸分散和溶解，分子粒徑及熱聚集體的粒徑也會(huì)相應(yīng)減小（< 0.05）。添加3 mmol/L SDS后，肌球蛋白溶液澄清透明，蛋白質(zhì)平均粒徑與對(duì)照組和熱處理組相比顯著降低（<0.05），且經(jīng)熱處理后體系仍然澄清，平均粒徑較熱處理前變化不明顯，但與未經(jīng)熱處理的對(duì)照組相比，平均粒徑較對(duì)照組明顯減?。?0.05），由此進(jìn)一步表明SDS的添加導(dǎo)致了低離子強(qiáng)度下的肌球蛋白纖絲解離，SDS-肌球蛋白分子間靜電斥力增加，明顯抑制了分子間的熱聚集。結(jié)合SDS對(duì)熱誘導(dǎo)肌球蛋白分子二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化分析，SDS的增溶及熱穩(wěn)定效應(yīng)與SDS和蛋白分子間的靜電作用與疏水作用導(dǎo)致纖絲解離及分子構(gòu)象的變化有關(guān)。

3 結(jié)論

在低鹽（≤150 mmol/L KCl）條件下，肌球蛋白分子熱變性聚集明顯，體系伴隨有弱熱凝膠形成的趨勢(shì)，肌球蛋白的溶解性和熱穩(wěn)定性極差。SDS的添加能有效抑制肌球蛋白的熱聚集，而蔗糖和精氨酸的添加對(duì)熱聚集的抑制效果不明顯。微量SDS以單體形式在蛋白分子特定作用位點(diǎn)間通過(guò)靜電和疏水相互作用結(jié)合形成橋鍵，導(dǎo)致肌球蛋白纖絲解離成單體，肌球蛋白分子三級(jí)結(jié)構(gòu)明顯改變，表面疏水基團(tuán)暴露，二級(jí)結(jié)構(gòu)保留較好，表面帶負(fù)電荷的SDS-肌球蛋白復(fù)合體形成，分子間靜電斥力增加，對(duì)體系有明顯的增溶和熱聚集抑制作用，但由于離子型表面活性劑本身性質(zhì)的影響，這種增溶和保護(hù)效應(yīng)隨離子強(qiáng)度的增加而減弱。研究結(jié)果為肌球蛋白的增溶和穩(wěn)態(tài)化提供了理論參考。

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Inhibition and Mechanism of SDS onThermalAggregation of Tilapia Myosinat Low Salt Concentrations

HOU Chun-xia1,2, FENG Rui1, LI Ting1, YANG Ping1,2, HONG Peng-zhi1,2

（1.,////,524088,; 2.(),524088,）

【Objective】To study the inhibitory effect and mechanism of sodium dodecyl sulfate (SDS) on the thermal aggregation of myosin under low salt condition.【Methods】Myosin was extracted from tilapia () muscle, and sucrose,-arginine, and SDS were added to the myosin dispersion followed by heating at 50 °C for 30 min, and the inhibitory effect on the thermal aggregation of myosin was compared. Comparative experiments determined that 3 mmol/L SDS was added in further study, and the effect of SDS on heat-induced aggregation of myosin was investigated in terms of turbidity, solubility, molecular structure and particle size distribution at lowKCl concentrations from 1 to 150 mmol/L.【Results】 In low salt concentrations, there was poor solubility and turbid solution of myosin. After heating at 50 °C for 30 min, the myosin dispersion exhibited significant thermal denaturation and aggregation as showed by a significant decrease in the solubility (< 0.05), and this was accompanied by an increase of surface hydrophobicity and loss of α-helix content (< 0.05). However, addition of 3 mmol/L SDS promoted a specific role between SDS and protein molecules, and resulted in the depolymerization of myosin filament, surface hydrophobicity of myosin monomer increased significantly (< 0.05) and electrostatic repulsion between molecules was enhanced. As compared to unheated myosin, the average particle size of myosin significantly decreased (< 0.05) and the solubility increased significantly (< 0.05), which indicated solubilization effect of myosin by SDS in 1?100 mmol/L KCl solution. Even after heat treatment, the hydrophilic SDS-myosin complex solution was still clear and transparent with further unfolding and increased surface hydrophobicity (<0.05), which indicated there was no significant thermal aggregation among the myosin molecules.【Conclusion】SDS can suppress the thermal aggregation of myosin at low salt concentrations, and the mechanism of the inhibitory is related to the depolymerization of myosin filament due to a specific role between SDS and protein molecules through electrostatic and hydrophobic interactions.

; myosin; SDS; low salt concentration; thermal aggregation; electrostatic interactions; hydrophobic interactions

Q51；TS254.1

A

1673-9159（2020）04-0082-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.012

2020-03-05

廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（2019KJ150）；南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（湛江）資助項(xiàng)目（ZJW-2019-07）

周春霞（1979―），女，副教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品高值化加工與利用。E-mail：zhoucx@gdou.edu.cn

洪鵬志（1966—），男，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品高值化加工與利用。E-mail：hongpz@gdou.edu.cn

周春霞，馮瑞，李婷，等. 低鹽條件下SDS對(duì)羅非魚(yú)肌球蛋白熱聚集的抑制及其機(jī)理[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（4）：82-89.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）