黃思嘉，祝夢(mèng)琦，李鵬程，張智英，魏澤輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

產(chǎn)蛋性狀是家禽生產(chǎn)的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，產(chǎn)蛋性能的高低主要取決于雞卵泡發(fā)育過(guò)程中的卵泡選擇和優(yōu)先等級(jí)建立[1]。雞的卵泡選擇主要通過(guò)下丘腦-垂體-卵巢軸(hypothalamic-pituitary-ovarianaxis, HPOA)與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)作用，并由生殖激素和一系列功能基因調(diào)控。抗繆勒氏管激素(anti-müllerian hormone, AMH)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factor-β, TGF-β)超家族BMP/GDF/AMH亞家族的成員之一[2]，在雞的卵泡發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。

禽類(lèi)的AMH在雌性胚胎和雄性胚胎的性腺中均有表達(dá)，但在雄性胚胎中AMH的表達(dá)量更高，主要起到使雄禽雙側(cè)繆勒氏管和雌禽右側(cè)繆勒氏管退化的作用[3-4]。有研究表明，在雞的卵泡發(fā)育過(guò)程中，AMH的表達(dá)量隨著卵泡發(fā)育而降低，尤其是在卵泡選擇后AMH的表達(dá)量顯著下調(diào)，直至在F1的顆粒細(xì)胞中幾乎不表達(dá)[5]，這表明AMH與卵泡選擇密切相關(guān)。然而，目前還沒(méi)有研究能夠清楚地解釋AMH在調(diào)控雞卵泡選擇過(guò)程中的具體分子機(jī)制。

TGF-β家族成員主要通過(guò)兩個(gè)相關(guān)的Ser/Thr激酶Ⅰ型受體和Ⅱ型受體結(jié)合生成異二聚體復(fù)合物進(jìn)行胞外至胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在配體與跨膜Ⅱ型受體結(jié)合后，Ⅰ型受體被募集與Ⅱ型受體形成受體復(fù)合物，激活下游Smad蛋白進(jìn)而調(diào)控目的基因的表達(dá)[6]。作為T(mén)GF-β家族的成員之一，AMH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與其他成員相似，其Ⅱ型受體(anti-müllerian hormone type Ⅱ receptor, AMHR2)是AMH目前唯一已知的Ser/Thr激酶Ⅱ型受體，在剛出生的雌性胎兒卵巢中即有表達(dá)并貫穿卵泡發(fā)育的整個(gè)過(guò)程[7-8]。近年來(lái)，已有學(xué)者對(duì)雞的AMHR2基因結(jié)構(gòu)及功能展開(kāi)了研究。Ayers[9]通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從頭組裝并與其他物種的基因組序列進(jìn)行校準(zhǔn)得到了雞的AMHR2基因序列。Cutting[10]通過(guò)比對(duì)雞AMHR2基因與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中其他物種AMHR2基因的對(duì)應(yīng)區(qū)域，鑒定了雞AMHR2基因中配體結(jié)合、跨膜、激酶、磷酸化受體和DNA結(jié)合區(qū)域的序列。其中，配體結(jié)合域包含幾個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，符合TGF-β家族受體的特征。AMHR2在未進(jìn)行性別分化和正在分化的雌性和雄性雞胚的性腺和繆勒氏管中均有表達(dá)，在鳥(niǎo)類(lèi)性別分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。Mishina[7]通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏AMHR2表達(dá)的雄性小鼠繆勒氏管的退化程度相對(duì)于正常雄性小鼠減弱。另外，Imbeaud[11]發(fā)現(xiàn)AMHR2基因突變可能會(huì)導(dǎo)致持久性繆勒氏管綜合癥。以上試驗(yàn)均驗(yàn)證了AMHR2在A(yíng)MH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要性，因此敲除AMHR2基因能夠阻礙AMH的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而影響AMH在雞卵泡發(fā)育和卵泡選擇中的作用。

近年來(lái)，CRISPR/Cas9技術(shù)逐漸發(fā)展成熟，已在禽類(lèi)基因組的特異性敲除試驗(yàn)中成功應(yīng)用[12-13]。本研究通過(guò)構(gòu)建靶向雞AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除載體，在雞的基因組上對(duì)AMHR2基因進(jìn)行精確敲除，為研究雞AMHR2基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞系與載體 本試驗(yàn)使用的DH5α、JM109感受態(tài)細(xì)胞基于Inoue方法制備[14]；HEK293T細(xì)胞、雞DF-1細(xì)胞、敲除載體原質(zhì)粒pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9和SSA-RPG雙熒光報(bào)告載體原質(zhì)粒pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200bp repeat.Puro-T2A-GFP保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物基因組編輯實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑 瓊脂糖凝膠回收試劑盒與質(zhì)粒提取試劑盒(Omega)，T4DNA連接酶與限制性?xún)?nèi)切酶(BsaI、BamH I和NotI)(NEB)，血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑(上海翊圣生物科技有限公司)，Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(Life Technologies)，Puromycin(Sigma-Aldrich)，pMD19-T載體(TaKaRa)，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gibco)，Opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrigen)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞AMHR2基因靶位點(diǎn)的選擇 通過(guò)crispr.mit.edu:807網(wǎng)站對(duì)雞AMHR2基因的特異CDs區(qū)序列進(jìn)行CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)，根據(jù)PAM和得分，選擇位于第二外顯子上相距14 bp、GC含量分別為80%和75%(sg2-1: CTTCAGGCTGCGGCGCGCGCTGG；sg2-4: GTGGTGCGACTCCACGCCGCCGG)的成對(duì)靶位點(diǎn)。

1.2.2 雞AMHR2基因CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建 通過(guò)Annealing PCR擬合得到靶位點(diǎn)序列，引物序列見(jiàn)表1。對(duì)pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9原載體(圖1)和靶位點(diǎn)擬合產(chǎn)物用BsaI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行單酶雙切，37 ℃酶切4 h后進(jìn)行膠回收純化。將純化的載體骨架與AMHR2靶位點(diǎn)通過(guò)T4連接酶在16℃下過(guò)夜連接。利用DH5α感受態(tài)細(xì)胞對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在有Amp抗性的LB培養(yǎng)板上37 ℃培養(yǎng)10 h左右。用無(wú)菌10 μL透明吸頭挑取成型菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定陽(yáng)性的菌落加入2 mL有Amp抗性的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)10～16 h。通過(guò)質(zhì)粒小提試劑盒提取菌液質(zhì)粒，最終獲得雞AMHR2基因的敲除載體。提取的質(zhì)粒送至生工公司進(jìn)行測(cè)序分析，鑒定正確后保存于-20 ℃。

1.2.3 SSA-RPG雙熒光報(bào)告載體的構(gòu)建 利用Primer Premier 6根據(jù)靶位點(diǎn)在雞基因組上的位置設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)，以雞的基因組DNA為模板擴(kuò)增出包含成對(duì)靶位點(diǎn)的DNA序列。用NotI和BamH I分別對(duì)pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP原載體(圖2)和AMHR2靶位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙位點(diǎn)酶切，37 ℃酶切4 h后分別進(jìn)行膠回收和溶液回收純化。后續(xù)載體構(gòu)建及鑒定過(guò)程同1.2.2。

表1 載體構(gòu)建引物序列Table 1 Primers for vector construction

注：小寫(xiě)字母.BsaI、NotI和BamH I酶切位點(diǎn)；.終止密碼子。

Note: Lowercase letters.BsaI,NotI &BamH I Restriction enzyme site;.Termination codon.

1.2.4 HEK293T細(xì)胞與雞DF-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 本試驗(yàn)中HEK293T細(xì)胞采用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加10% FBS和1% Anti-Anti，在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前將HEK293T細(xì)胞傳代至24孔板中，接種密度為每孔1×105個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%左右時(shí)參照Hieff TransTM脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染后在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)48 h，通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞熒光。

DF-1細(xì)胞的培養(yǎng)條件與HEK293T細(xì)胞相同，轉(zhuǎn)染前將DF-1細(xì)胞傳代至12孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%時(shí)用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。轉(zhuǎn)染后在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)48 h，通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞熒光后，將培養(yǎng)基置換為含有3 μg/mL Puromycin的藥物篩選培養(yǎng)基，對(duì)敲除AMHR2基因的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行篩選，每天更換Puromycin藥物篩選培養(yǎng)基并觀(guān)察細(xì)胞狀態(tài)，藥物篩選140 h后陰性對(duì)照組DF-1細(xì)胞幾乎全部死亡而試驗(yàn)組有少部分陽(yáng)性細(xì)胞存活。將培養(yǎng)基統(tǒng)一更換為不含Puromycin的培養(yǎng)基，當(dāng)DF-1細(xì)胞增殖到密度接近90%時(shí)收集細(xì)胞。利用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒分別提取試驗(yàn)組的DF-1細(xì)胞基因組DNA，用Nanodrop2000微量檢測(cè)儀測(cè)定濃度后于-20 ℃保存。

1.2.5 TA克隆檢測(cè) 以試驗(yàn)組的DF-1細(xì)胞基因組DNA(見(jiàn)1.2.4)為模板，用AMHR2e2-TA-F/R引物(見(jiàn)表1)擴(kuò)增第二外顯子上包含靶位點(diǎn)的564 bp片段，PCR產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后膠回收純化。

根據(jù)pMDTM19-T Vector Cloning Kit說(shuō)明書(shū)將純化的PCR產(chǎn)物整合到pMD19-T載體上。用JM109感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，37 ℃培養(yǎng)12 h后，挑20個(gè)單克隆利用引物AMHR2e2-TA-F/R與pMD19-T載體上的通用引物M13-R進(jìn)行菌落PCR，初步鑒定為陽(yáng)性后用含有2 mL Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌培養(yǎng)至渾濁，送至公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞AMHR2基因CRISPR/Cas9敲除載體的構(gòu)建

通過(guò)網(wǎng)站預(yù)測(cè)得到位于第二外顯子上的成對(duì)雞AMHR2基因CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)，相距14 bp，將退火擬合得到的2個(gè)靶位點(diǎn)片段分別與pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9骨架連接，構(gòu)建出成對(duì)的雞AMHR2基因敲除表達(dá)載體。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖3，表明2個(gè)雞AMHR2基因敲除表達(dá)載體均構(gòu)建成功。

2.2 SSA-RPG雙熒光報(bào)告載體的構(gòu)建

以pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP為骨架構(gòu)建與AMHR2敲除表達(dá)載體對(duì)應(yīng)的SSA-RPG雙熒光報(bào)告載體。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖4，表明SSA-RPG雙熒光報(bào)告載體構(gòu)建成功。

2.3 報(bào)告載體水平AMHR2基因敲除表達(dá)載體的工作效率

轉(zhuǎn)染后48 h的HEK293T細(xì)胞熒光觀(guān)察結(jié)果如圖5，紅光代表轉(zhuǎn)染效率，綠光代表敲除載體工作效率。陰性對(duì)照組由于敲除載體只表達(dá)Cas9而沒(méi)有引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別靶位點(diǎn)的sgRNA，因此無(wú)法進(jìn)行靶位點(diǎn)的特異切割，被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞只有紅色熒光而沒(méi)有綠色熒光。3個(gè)試驗(yàn)組相比，試驗(yàn)組A的

轉(zhuǎn)染效率和靶位點(diǎn)敲除效率均高于試驗(yàn)組B和試驗(yàn)組C。因此，從報(bào)告載體水平來(lái)看成對(duì)靶位點(diǎn)打靶的AMHR2基因敲除效率要高于單一靶位點(diǎn)打靶的敲除效率，將成對(duì)敲除載體與其對(duì)應(yīng)的雙熒光報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染可以最大限度提高轉(zhuǎn)染效率和敲除載體的工作效率。

為了確定構(gòu)建的敲除載體是否可以在雞的基因組上進(jìn)行打靶，本試驗(yàn)利用雞AMHR2基因敲除表達(dá)系統(tǒng)對(duì)雞DF-1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。由于在HEK293T細(xì)胞上的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果顯示成對(duì)敲除載體與對(duì)應(yīng)的報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染可以最大限度提高轉(zhuǎn)染和敲除效率，本試驗(yàn)設(shè)置了共轉(zhuǎn)染成對(duì)敲除載體和報(bào)告載體的試驗(yàn)組與共轉(zhuǎn)染野生型原載體和報(bào)告載體的陰性對(duì)照組。轉(zhuǎn)染后48 h與Puromycin藥物篩選后140 h時(shí)對(duì)DF-1細(xì)胞觀(guān)察結(jié)果如圖6：試驗(yàn)組被轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞有綠色熒光，且經(jīng)過(guò)140 h的藥物篩選后，陰性對(duì)照組的細(xì)胞幾乎全部死亡，試驗(yàn)組的轉(zhuǎn)染效率和敲除效率均有提高。

2.4 TA克隆檢測(cè)基因組水平敲除載體的工作效率

3 討 論

基因編輯是研究基因功能的重要方法之一，CRISPR/Cas9技術(shù)相較于ZFN和TALEN技術(shù)具有簡(jiǎn)單高效的特點(diǎn)，自發(fā)現(xiàn)以來(lái)在哺乳動(dòng)物上有廣泛應(yīng)用[15-17]。CRISPR/Cas9技術(shù)在雞中也有成功應(yīng)用但仍處于初步階段。2015年，Véron[12]對(duì)雞胚的PAX7基因進(jìn)行了敲除，首次實(shí)現(xiàn)了在雞基因組上的編輯應(yīng)用。然而，CRISPR/Cas9在雞細(xì)胞中的應(yīng)用存在著靶位點(diǎn)突變效率低的問(wèn)題[18]。Cas9核酸酶對(duì)靶位點(diǎn)的特異切割是基于sgRNA能夠準(zhǔn)確識(shí)別目的基因的靶位點(diǎn)，但由于生物體的基因組極為復(fù)雜，sgRNA可能會(huì)與非靶位點(diǎn)進(jìn)行錯(cuò)配，導(dǎo)致脫靶效應(yīng)[19]。因此CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶位點(diǎn)的設(shè)計(jì)非常重要，有研究表明sgRNA的GC含量越高，對(duì)靶位點(diǎn)的切割效率越高[20]。為了利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)雞的AMHR2基因進(jìn)行特異敲除，首先應(yīng)構(gòu)建高效特異的Cas9敲除表達(dá)載體。不同于之前研究中對(duì)單一靶位點(diǎn)進(jìn)行打靶的敲除系統(tǒng)，本研究通過(guò)crispr.mit.edu:807網(wǎng)站設(shè)計(jì)了位于雞AMHR2基因第二外顯子上的成對(duì)sgRNA靶位點(diǎn)，以期提高對(duì)AMHR2基因的打靶效率。

圖7 菌落PCR鑒定陽(yáng)性TA克隆
1～20. PRC產(chǎn)物；M.DNA Marker DL2000;圖片中間的虛線(xiàn)表示圖片經(jīng)裁剪后拼接
Fig.7 Colony PCR identified Positive TA clones
1～20. Products of PRC；M.DNA Marker DL2000;The dotted lines between lanes represent cropped images

除了選擇合適的靶位點(diǎn)以外，通過(guò)Puromycin藥物篩選的方式也可以大大提高經(jīng)過(guò)編輯的陽(yáng)性細(xì)胞率[21]。本實(shí)驗(yàn)室于2016年利用自己構(gòu)建的SSA-RPG雙熒光報(bào)告載體系統(tǒng)與stCRISPR/Cas9系統(tǒng)在雞DF-1細(xì)胞上實(shí)現(xiàn)了PPAR、ATP5E和OVA基因的成功敲除，經(jīng)過(guò)Puromycin篩選后基因編輯的陽(yáng)性細(xì)胞率可達(dá)95%[13]。雙熒光報(bào)告載體的工作原理如圖9所示[22]：由于靶位點(diǎn)的插入，Puro基因被打斷，CAG啟動(dòng)子無(wú)法啟動(dòng)Puro基因以及通過(guò)T2A剪切肽與其融合表達(dá)的eGFP基因，報(bào)告載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后只有由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)的DsRed基因表達(dá)，此時(shí)被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞發(fā)出紅色熒光而沒(méi)有綠色熒光。當(dāng)CRISPR/Cas9敲除載體工作后，對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割敲除，靶位點(diǎn)兩端的200 bp重復(fù)序列利用SSA機(jī)制對(duì)DSB進(jìn)行修復(fù)，使Puro基因以及通過(guò)T2A剪切肽與其融合表達(dá)的eGFP基因能夠重新表達(dá)，此時(shí)可以觀(guān)察到細(xì)胞既有紅色熒光也有綠色熒光。因此紅色熒光即代表細(xì)胞被轉(zhuǎn)染的效率，綠色熒光代表成功敲除靶位點(diǎn)的效率，成功被敲除靶位點(diǎn)的細(xì)胞具有Puro抗性，可利用Puromycin篩選出陽(yáng)性細(xì)胞。

本研究首先在報(bào)告載體水平上比較了單一靶位點(diǎn)敲除系統(tǒng)和成對(duì)靶位點(diǎn)敲除系統(tǒng)的工作效率，AMHR2基因敲除系統(tǒng)被分為3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)陰性對(duì)照組分別對(duì)HEK293T進(jìn)行轉(zhuǎn)染。結(jié)果表明，成對(duì)靶位點(diǎn)敲除系統(tǒng)的工作效率高于單一靶位點(diǎn)敲除系統(tǒng)。為了更準(zhǔn)確地檢測(cè)CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)在雞的基因組水平上對(duì)AMHR2基因的敲除效率，后續(xù)試驗(yàn)采用成對(duì)雞AMHR2基因敲除表達(dá)載體和對(duì)應(yīng)SSA-RPG報(bào)告載體對(duì)DF-1細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后添加Puromycin進(jìn)行藥物篩選富集陽(yáng)性細(xì)胞并提取基因組DNA。為了進(jìn)一步檢測(cè)CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)的工作效率，本研究進(jìn)行了TA克隆并挑取陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果表明，DF-1細(xì)胞基因組中AMHR2基因的突變率為60.0%，基因突變類(lèi)型為堿基缺失，表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)能夠成功對(duì)雞基因組上的AMHR2基因進(jìn)行特異敲除，但工作效率不高仍需進(jìn)行試驗(yàn)改進(jìn)。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了靶向雞AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系統(tǒng)，在雞DF-1細(xì)胞的基因組上對(duì)AMHR2基因進(jìn)行了成功敲除(約60%)，為雞AMHR2基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。