楊 培，周 琥，王麗韞，王永安

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

近年來，因廣譜殺蟲劑有機磷農(nóng)藥在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及家庭生活中的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致有機磷化合物的過量排放，并可通過食物鏈富集進(jìn)入人體，進(jìn)而給人體健康造成嚴(yán)重?fù)p害。敵敵畏（dimethyl-dichlorovinyl-phosphate，DDVP）是生產(chǎn)生活中最常見的有磷酸酯類化合物，神經(jīng)毒理學(xué)研究表明，DDVP中毒機制主要是抑制乙酰膽堿脂酶，使其失去水解乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）的能力，造成膽堿能神經(jīng)末梢釋放的ACh大量蓄積，可興奮ACh的毒蕈堿受體（膽堿能M受體），產(chǎn)生毒蕈堿樣作用及中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[1]。膽堿能M受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一，主要分為M1，M2，M3，M4和M5共5個受體亞型，其中，M1在大部分腦區(qū)廣泛分布及表達(dá)[2]。流行病學(xué)資料研究表明，長期接觸敵敵畏會引發(fā)潛在的神經(jīng)毒作用，影響機體運動、認(rèn)知及記憶功能[3-4]。目前DDVP誘發(fā)的繼發(fā)性和遲發(fā)性神經(jīng)損傷尚無有效治療手段。

細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶5（cyclin-dependent kinase 5，Cdk5）作為一種廣泛表達(dá)的多功能絲氨酸/蘇氨酸激酶，在神經(jīng)元發(fā)育、遷移、細(xì)胞骨架蛋白磷酸化和突觸可塑性中起重要作用[5-6]。Cdk5廣泛參與神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能調(diào)控與病理過程。生理條件下，Cdk5可磷酸化許多細(xì)胞骨架蛋白（tau、神經(jīng)絲和巢蛋白等）、突觸蛋白（突觸后致密蛋白95，突觸蛋白I和E-鈣黏蛋白）和有絲分裂神經(jīng)元中的轉(zhuǎn)錄因子，從而使細(xì)胞神經(jīng)元發(fā)生遷移、神經(jīng)突向外生長、軸突導(dǎo)向正常以及突觸形成等功能[5]。但在病理條件下，Cdk5與其伴侶分子P25結(jié)合，可增加Cdk5激酶穩(wěn)定性導(dǎo)致Cdk5持續(xù)激活。Cdk5的過度激活、活性失調(diào)及其亞細(xì)胞分布改變均不同程度的誘導(dǎo)神經(jīng)元的凋亡或死亡，如過度活躍的Cdk5/P25過度磷酸化tau，tau異常聚集形成在阿爾茨海默病中觀察到的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[7]。在許多神經(jīng)退行性疾病中，如帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化和缺血性卒中，均發(fā)現(xiàn)Cdk5異常過度活化，誘導(dǎo)神經(jīng)的凋亡損傷，致使神經(jīng)元走向死亡[8-9]。此外眾多文獻(xiàn)表明，阻斷Cdk5的活性具有一定的神經(jīng)元保護(hù)作用[10-12]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，原代大鼠紋狀體中等棘狀神經(jīng)元中膽堿能M受體的激活可誘導(dǎo)神經(jīng)元Cdk5活化，DDVP中毒機制與ACh興奮膽堿能M受體有關(guān)，推測Cdk5可能在DDVP引發(fā)的神經(jīng)毒性損傷發(fā)揮著重要的作用[11]。分化良好的SH-SY5Y細(xì)胞系具有成熟神經(jīng)元的特征，具有突觸結(jié)構(gòu)、功能軸突囊泡運輸，并表達(dá)特異性神經(jīng)元蛋白，同時也是模擬神經(jīng)細(xì)胞損傷常用的細(xì)胞模型[13]。本研究采用內(nèi)源性表達(dá)Cdk5激酶的SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建DDVP誘導(dǎo)神經(jīng)毒性損傷模型，首先確定膽堿能M受體對SH-SY5Y細(xì)胞Cdk5的調(diào)控作用，隨后探討Cdk5參與DDVP誘發(fā)神經(jīng)元毒性損傷作用，為DDVP致神經(jīng)毒性損傷及救治提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物和主要試劑

SH-SY5Y細(xì)胞購于武漢Procell生命科技有限公司。DDVP為本實驗室儲存液體（純度≥95%）；氧化震顫素（oxotremorine，Oxo-M）購于美國Cayman公司；羅考唯亭（roscovitine，Rosc）購于美國Targetmol公司；MTT和胰蛋白酶購于美國Sigma公司；胎牛血清、MEM/F12培養(yǎng)購于美國Gibco公司；青鏈霉素購于北京中生奧邦公司；小鼠抗人Cdk5多克隆抗體和兔抗人M1單克隆抗體均購于美國Abcam公司；兔抗小鼠β肌動蛋白單克隆抗體購于武漢賽維爾公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、封閉用標(biāo)準(zhǔn)山羊血清、TRITC標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（二抗）和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗）購于中杉金橋；Western印跡法檢測試劑盒購于康為世紀(jì)生物科技有限公司；山羊抗兔IgG H&L（IRDye?680CW）抗體（二抗）和山羊抗小鼠IgG H&L（IRDye?800CW）抗體（二抗）購于美國LI-COR公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于上海愛必信公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 主要儀器

酶標(biāo)儀（Bio-Tek，美國）；光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）；穩(wěn)壓恒流電泳儀DYC-4C和半干式轉(zhuǎn)移槽DYY-8 B（北京六一儀器廠，中國）；SIGMA1-13臺式高速離心機（SIGMA，德國）；LSM 880 META 激光共聚焦顯微鏡（ZEISS，德國）；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（LI-COR，美國）；ULTRALAB超純水儀器（Millipore，美國）；TS-100水平搖床（金壇市泰納儀器廠，中國）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清及1%青、鏈霉素的MEM/F12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%CO2，每2天半量換液1次，待細(xì)胞生長融合度約80%～90%時，使用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3比例傳代，周期為4～7 d，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗研究。

1.4 細(xì)胞免疫熒光法檢測細(xì)胞Cdk5和M1蛋白表達(dá)

將對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，接種到共聚焦小皿中，調(diào)整密度為1.0×105L-1。于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育第4天更換新鮮培養(yǎng)基后進(jìn)行處理。使用PBS清洗3次，每次5 min。4%多聚甲醛溶液室溫固定15 min，無水甲醇于-20℃透膜10 min，山羊血清室溫封閉1 h。加入小鼠抗人Cdk5多克隆抗體、兔抗人M1單克隆抗體（稀釋比例為1∶120）4℃孵育過夜，復(fù)溫20 min后加入TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體（二抗）（稀釋比例為1∶150），室溫避光孵育1 h，DAPI室溫避光孵育15 min。于LSM880 META激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，用于FITC的激發(fā)波長為488 nm，用于TRITC的激發(fā)波長為568 nm。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞存活率

將對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，接種到96孔板中，調(diào)整密度為1.0×105L-1。于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育第4天更換新鮮培養(yǎng)基后給藥處理，分為：① Oxo-M（0，1×10-8，1×10-6，1×10-4和1×10-2mol·L-1）培養(yǎng)48 h；② Oxo-M 1×10-4mol·L-1培養(yǎng)0，24，48和72 h；③ 細(xì)胞對照組、Oxo-M組（1×10-4mol·L-1作用48 h）、Rosc組（培養(yǎng)結(jié)束前1 h 1×10-4mol·L-1）和 Rosc+Oxo-M 組（Rosc 1×10-4mol·L-1預(yù)處理 1 h后，再加入 Oxo-M 1×10-4mol·L-1作用至48 h）組；④ DDVP（0，1×10-6，1×10-5，1×10-4和1×10-3mol·L-1）培養(yǎng)48 h；⑤ 細(xì)胞對照組、DDVP組（1×10-5mol·L-1作用48 h）、Rosc組（培養(yǎng)結(jié)束前1 h加入1×10-4mol·L-1）和Rosc+DDVP組（Rosc 1×10-4mol·L-1預(yù)處理1 h后，加入DDVP 1×10-5mol·L-1作用至48 h）。在96孔板中每孔加入MTT溶液（5 g·L-1）20 μL于培養(yǎng)箱中孵育4 h。孵育結(jié)束后吸出原有培養(yǎng)基終止培養(yǎng)，每孔加入二甲亞砜150 μL，室溫下充分振蕩20 min，使紫色結(jié)晶物溶解。設(shè)定波長為570 nm，在酶標(biāo)儀上檢測樣本的吸光度（A570nm）值。設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)基的空白對照孔調(diào)零，每組設(shè)6復(fù)孔。細(xì)胞存活率（%）=（實驗組A570nm-空白組A570nm）（/對照組A570nm-空白組A570nm）×100%。

1.6 AnnexinⅤ-FlTC/Pl雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

將對數(shù)生長期SHSY-5Y細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，換用無血清MEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。分組按1.5中⑤給藥。每組設(shè)3復(fù)孔，使用PBS清洗3次，每次5 min，按照說明書加入AnnexinⅤ試劑各5 μL，混勻避光孵育15 min，上機前5 min再加入碘化丙啶（PI）染液各5 μL?；靹?，流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長535 nm。AnnexinⅤ+PI+為晚期凋亡細(xì)胞，AnnexinⅤ+PI-為早期凋亡細(xì)胞。

1.7 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡

將對數(shù)生長期SHSY-5Y細(xì)胞均勻接種于含蓋玻片的35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，待細(xì)胞生長到融合度為70%～80%時，換用無血清MEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。分組按1.5中⑤給藥。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照并記錄。棕色為TUNEL染色陽性凋亡細(xì)胞。

1.8 Western印跡法檢測Cdk5的表達(dá)

將對數(shù)生長期SHSY-5Y細(xì)胞取接種于6孔板內(nèi)，分為① Oxo-M（0，1×10-8，1×10-6和1×10-4mol·L-1）培養(yǎng)48 h組；② Rosc 1×10-4mol·L-1培養(yǎng)0，10，30和60 min組；③ 細(xì)胞對照組、Oxo-M組（Oxo-M 1×10-4mol·L-1作用48 h）、Rosc組（培養(yǎng)結(jié)束前1 h給予 1×10-4mol·L-1）、Rosc+Oxo-M 組（Rosc 1×10-4mol·L-1預(yù)處理1 h后，再加入Oxo-M 1×10-4mol·L-1作用 47 h）；④ DDVP（0，1×10-6，1×10-5，1×10-4和1×10-3mol·L-1）培養(yǎng)48 h；⑤ 細(xì)胞對照組、DDVP組（1×10-5mol·L-1作用48 h）、Rosc組（培養(yǎng)結(jié)束前1 h加入1×10-4mol·L-1）和Rosc+DDVP組（Rosc 1×10-4mol·L-1預(yù)處理1 h后，加入DDVP 1×10-5mol·L-1作用47 h）組。培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，使用預(yù)熱PBS清洗細(xì)胞，每孔加入80 μL的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。于冰上裂解10 min后，采用細(xì)胞刮片收集細(xì)胞。于4℃，16 000×g離心30 min。離心后收集上清蛋白液，BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。每泳道以50 μg蛋白上樣。經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)至醋酸纖維膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入小鼠抗人Cdk5多克隆抗體、兔抗小鼠β肌動蛋白單克隆抗體（1∶1000，TBST稀釋），4℃孵育過夜。再加IRDye 680RD熒光標(biāo)記的山羊抗兔和IRDye800CW熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（二抗，1∶2500，TBST稀釋），室溫孵育1 h，最后使用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描顯影。用吸光度分析軟件Image J軟件對條帶的積分吸光度（integrated absorbance，IA）值進(jìn)行計算，以IA目的蛋白/IAβ肌動蛋白比值代表目的蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，采用GraphPad Prism 7 Project軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，多組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析以及單因素方差分析中Dunnettt檢驗進(jìn)行分析處理，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽堿能M受體和Cdk5均在SH-SY5Y細(xì)胞中表達(dá)

通過免疫熒光和激光共聚焦實驗檢測SH-SY5Y細(xì)胞中乙酰膽堿能M1受體與Cdk5的分布與表達(dá)，F(xiàn)ITC（綠色熒光）標(biāo)記為M1受體，TRITC（紅色熒光）標(biāo)記為Cdk5激酶。如圖1免疫熒光結(jié)果顯示，M1受體和Cdk5均在SH-SY5Y細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)。

2.2 Oxo-M過度激活膽堿能M受體誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷

2.2.1 Oxo-M對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

如表1結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，當(dāng)Oxo-M濃度為1×10-8和1×10-6mol·L-1時，細(xì)胞存活率無明顯變化，濃度升高至1×10-4和1×10-2mol·L-1時細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）。表2結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)Oxo-M 1×10-4mol·L-1處理24 h，細(xì)胞存活率無明顯變化；處理48 h細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）；處理72 h時細(xì)胞存活率僅為（27.6±4.6）%（P＜0.01）。為此，為滿足正常細(xì)胞實驗，確定后續(xù)研究給藥時間為48 h。

Fig.1 Expression of muscarinic receptor 1（M1 receptor）and cyclin-dependent kinase 5（Cdk5）in SH-SY5Y cells.The immunoreaction labeling of M1 and Cdk5 was determined by using confocal microscopy analysis.The green represents the M1 receptor，red represents Cdk5，and blue represents the nucleus.

Tab.1 Effect of different concentrations of oxotremorine（Oxo-M）for 48 h on SH-SY5Y cell viability

Tab.2 Time-effects of Oxo-M 1×10-4mol·L-1on SH-SY5Y cell viability

2.2.2 Oxo-M對SH-SY5Y細(xì)胞Cdk5表達(dá)的影響

如圖2結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，Oxo-M 1×10-8和1×10-6mol·L-1處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，Cdk5表達(dá)無明顯變化。當(dāng)Oxo-M濃度升高為1×10-4mol·L-1時，Cdk5表達(dá)明顯增強（P＜0.05）。

2.3 Rosc減輕Oxo-M誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷

2.3.1 Rosc對SH-SY5Y細(xì)胞Cdk5表達(dá)的影響

Rosc是一種高活性Cdk5激酶抑制劑，可有效抑制胞內(nèi)Cdk5激酶活性。如圖3顯示，與細(xì)胞對照組相比，Rosc 1×10-4mol·L-1作用10和30 min，Cdk5表達(dá)無明顯改變。當(dāng)Rosc作用60 min時，Cdk5表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。故選擇Rosc 1×10-4mol·L-1預(yù)處理細(xì)胞1 h，觀察Rosc對Oxo-M誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響。

Fig.2 Effect of Oxo-M for 48 h on Cdk5 expression of SH-SY5Y cells detected by Western blotting.IA：integrated absorbance.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

Fig.3 Time-effects of roscovitine（Rosc）on Cdk5 expression of SH-SY5Y cells detected by Western blotting.SH-SY5Y cells were treated with Rosc 1×10-4mol·L-1for 0，10，30 and 60 min，respectively.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

2.3.2 Rosc對Oxo-M誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的影響

由表3結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，Oxo-M組細(xì)胞存活率明顯減少（P＜0.05），Rosc和Rosc+Oxo-M組無明顯改變。與Oxo-M組相比，Rosc+Oxo-M組細(xì)胞存活率明顯增加（P＜0.05）。表明Cdk5抑制劑Rosc可顯著減輕Oxo-M誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。

Tab.3 Effect of Rosc on Oxo-M-induced injury in SH-SY5Y cells

2.3.3 Rosc對Oxo-M誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Cdk5表達(dá)的影響

如圖4顯示，與細(xì)胞對照組相比，Oxo-M組Cdk5表達(dá)明顯升高，Rosc組明顯降低（P＜0.05）。與Oxo-M組相比，Rosc+Oxo-M組Cdk5表達(dá)明顯被抑制（P＜0.05），表明Rosc顯著抑制Oxo-M誘導(dǎo)的Cdk5表達(dá)。提示抑制Cdk5表達(dá)可減輕Oxo-M過度激活膽堿能受體誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。

Fig.4 Effect of Rosc on Oxo-M induced Cdk5 expression combined with injury of SH-SY5Y cells detected by Western blotting.See Tab.3 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05；compared with Oxo-M group.

2.4 DDVP誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷并上調(diào)Cdk5表達(dá)

2.4.1 DDVP對SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

由表4結(jié)果可知，與細(xì)胞對照組相比，DDVP 1×10-6mol·L-1組細(xì)胞存活率無明顯變化，DDVP 1×10-5和1×10-4mol·L-1組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），DDVP 1×10-3mol·L-1組細(xì)胞存活率僅為（10.0±5.5）%（P＜0.01）。故選擇DDVP 1×10-5mol·L-1作用SH-SY5Y細(xì)胞48 h進(jìn)行后續(xù)實驗。

Tab.4 Effect of dimethyl-dichlorovinyl-phosphate（DDVP）for 48 h on SH-SY5Y cell viability

2.4.2 DDVP對SH-SY5Y細(xì)胞Cdk5表達(dá)的影響

圖5結(jié)果顯示，與細(xì)胞對照組相比，DDVP濃度為 1×10-6mol·L-1時Cdk5表達(dá)無明顯變化，1×10-5和1×10-4mol·L-1時Cdk5表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。表明DDVP1×10-5和1×10-4mol·L-1作用SH-SY5Y細(xì)胞48 h可引起Cdk5表達(dá)增強。

Fig.5 Effect of DDVP for 48 h on Cdk5 expression in SH-SY5Y cells detected by Western blotting.See Tab.4 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group.

2.5 Rosc可降低DDVP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷

2.5.1 Rosc對DDVP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的影響

結(jié)果如表5所示，與細(xì)胞對照組相比，DDVP組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），Rosc組和Rosc+DDVP組無明顯變化。與DDVP組相比，Rosc+DDVP組細(xì)胞存活率明顯升高（P＜0.05）。提示Rosc可顯著減輕DDVP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。

Tab.5 Effect of Rosc on DDVP-induced injury in SH-SY5Y cells

2.5.2 Rosc對DDVP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Cdk5表達(dá)的影響

如圖6所示，與細(xì)胞對照組相比，DDVP組Cdk5表達(dá)顯著升高（P＜0.05），Rosc組和Rosc+DDVP可顯著抑制Cdk5活性（P＜0.05）。與DDVP組相比，Rosc+DDVP組Cdk5表達(dá)顯著降低（P＜0.05），表明Rosc可顯著抑制DDVP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Cdk5表達(dá)上調(diào)。

Fig.6 Effect of Rosc on DDVP-induced Cdk5 expression in SH-SY5Y cells detected by Western blotting.See Tab.5 for the cell treatment.B was the semi-quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with DDVP group.

2.6 Rosc減輕DDVP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

如圖7顯示，與細(xì)胞對照組相比，DDVP組細(xì)胞凋亡率為（64.1±8.4）%，顯著升高（P＜0.05），Rosc組和Rosc+DDVP組無明顯改變。與DDVP組相比，Rosc+DDVP組細(xì)胞凋亡率為（34.4±9.5）%，明顯降低（P＜0.05）。如圖8顯示，細(xì)胞對照組SHSY5Y細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整。DDVP組貼壁細(xì)胞表現(xiàn)出皺縮、變圓、染色質(zhì)濃縮、凋亡小體出現(xiàn)，TUNNEL陽性細(xì)胞增多。Rosc組與細(xì)胞對照組相比無明顯區(qū)別。而Rosc+DDVP組TUNNEL陽性細(xì)胞顯著減少，大部分細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)較完整。與此提示，Cdk5抑制劑Rosc可以減輕DDVP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。

Fig.7 lnhibition of Rosc on DDVP-induced SH-SY5Y cell apoptosis detected by flow cytometry.See Tab.5 for the cell treatment.B was the quantitative result of A.±s，n=3.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05，compared with DDVP group.

Fig.8 lnhibition of Rosc on DDVP-induced apoptosis of SH-SY5Y cells detected by TUNNEL assay.See Tab.5 for the cell treatment.The black arrows indicate apoptotic cells.

3 討論

前期研究發(fā)現(xiàn)，膽堿能M受體對Cdk5活化存在調(diào)控作用[14]，但是以原代大鼠紋狀體中等棘狀神經(jīng)元為研究載體。本研究選擇具有成熟神經(jīng)元特征、突觸結(jié)構(gòu)及軸突囊泡運輸功能、分化良好的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞為模型，研究不同劑量非選擇性乙酰膽堿能受體激動劑Oxo-M對Cdk5激酶的表達(dá)及SH-SY5Y細(xì)胞活性的影響，考察膽堿能M受體長時間激活對SH-SY5Y細(xì)胞毒性作用及與Cdk5激酶活性改變的影響，并觀察膽堿酯酶抑制劑DDVP對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性，及伴隨Cdk5激酶的表達(dá)變化。探討膽堿能M受體對Cdk5活化是否參與介導(dǎo)DDVP誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷過程。

首先，在本研究應(yīng)用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦技術(shù)可檢測到SH-SY5Y細(xì)胞中不僅有M1受體表達(dá)，而且Cdk5蛋白在SH-SY5Y細(xì)胞中大量分布，為實驗進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。非選擇性乙酰膽堿能受體激動劑Oxo-M可有效激活膽堿能M受體，給予不同濃度的Oxo-M處理SH-SY5Y細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Oxo-M 1×10-8和1×10-6mol·L-1的作用48 h對SH-SY5Y細(xì)胞活性無作用，而Oxo-M 1×10-4和1×10-2mol·L-1作用48 h可誘導(dǎo)SH-SY5Y 細(xì)胞活性顯著降低，結(jié)合Western印跡結(jié)果表明，Oxo-M 1×10-4mol·L-1可誘導(dǎo)Cdk5蛋白表達(dá)增加，同時通過MTT法與Western印跡法結(jié)合發(fā)現(xiàn)，加入Cdk5激酶抑制劑Rosc后再與Oxo-M共孵育48 h，可抑制Cdk5活性，表明通過降低Cdk5活性可改善Oxo-M抑制細(xì)胞活性的作用。綜上結(jié)果表明，Oxo-M可以激活膽堿能M受體使Cdk5活化，抑制Cdk5活性可改善Oxo-M抑制細(xì)胞活性作用。

DDVP是生活、生產(chǎn)中常用有機磷農(nóng)藥，對人中樞神經(jīng)毒性引發(fā)的遲發(fā)性損傷更是受到高度重視，其治療手段有限[15-16]。DDVP及其代謝物中樞中毒機制是通過抑制乙酰膽堿酯酶活性，導(dǎo)致乙酰膽堿無法被分解而大量蓄積于中樞神經(jīng)而引起的一系列繼發(fā)性神經(jīng)損傷。本研究中表明，高濃度Oxo-M對膽堿能M受體的活化作用能誘導(dǎo)Cdk5表達(dá)顯著升高，從而誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，推測膽堿酯酶抑制劑DDVP對細(xì)胞毒性損傷作用也存在相似致毒機制。使用不同濃度（1×10-6，1×10-5，1×10-4和1×10-3mol·L-1）的DDVP處理SH-SY5Y細(xì)胞，隨著DDVP濃度升高，細(xì)胞毒性呈濃度依賴性增加，其誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的LD50為（1.62±1.88）×10-5mol·L-1。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，DDVP 1×10-5mol·L-1處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h引起細(xì)胞凋亡的同時，同樣上調(diào)Cdk5表達(dá)，提示Cdk5參與DDVP誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。進(jìn)而通過流式細(xì)胞技術(shù)和TUNEL檢測細(xì)胞凋亡，觀察Cdk5抑制劑Rosc對DDVP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，Rosc與DDVP同時作用后，Cdk5活性被顯著抑制，同時DDVP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡顯著改善，提示Cdk5介導(dǎo)DDVP的細(xì)胞毒性作用。

綜上表明，高濃度Oxo-M模擬膽堿能M受體過度激活引發(fā)的毒性蓄積作用，使用Cdk5抑制劑Rosc對Cdk5活性抑制后，高濃度Oxo-M對細(xì)胞的毒性損傷作用得到緩解，表明Cdk5介導(dǎo)高濃度Oxo-M的細(xì)胞毒性作用。膽堿酯酶抑制劑DDVP造成SH-SY5Y細(xì)胞染毒模型后，伴發(fā)Cdk5活性增加，且細(xì)胞凋亡率顯著升高。Cdk5抑制劑Rosc顯著抑制DDVP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡，表明抑制Cdk5活性可緩解DDVP所致神經(jīng)細(xì)胞毒性損傷，并對神經(jīng)元起到一定的保護(hù)作用。本研究為探討救治DDVP中毒作用機制提供了新的思路。