鄭燕菲 張 強(qiáng) 藍(lán)亮美許建本 黃秋萍 林依娜

(1. 廣西民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，廣西 崇左 532200；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530022； 3. 柳州城市職業(yè)學(xué)院機(jī)電與汽車(chē)工程系，廣西 柳州 545036)

單性木蘭又名廣西木蘭，花單性、雄雌異株[1]。目前，單性木蘭的有效成分研究主要集中在揮發(fā)油、脂肪酸、多糖、多酚及其生物活性[2-4][5]63-90。黃品鮮等[3]采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)單性木蘭種皮的揮發(fā)組分中的油層精油和溶解在水中的化學(xué)成分分別進(jìn)行了定性定量分析；課題組前期曾對(duì)單性木蘭的新鮮雄花、雌花、葉、果皮和果肉的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，并研究了單性木蘭葉多糖提取工藝及其抗腫瘤活性[4][5]15-37；還優(yōu)化了單性木蘭葉多酚的微波輔助提取工藝，最高提取率為(2.44±0.02)%，并評(píng)價(jià)得知單性木蘭葉多酚具有良好的抗氧化性[6]。但對(duì)單性木蘭枝中多酚的研究未見(jiàn)報(bào)道，若能將修剪丟棄的單性木蘭枝作為原料提取多酚類(lèi)化合物，并將其應(yīng)用于開(kāi)發(fā)保健藥品及功能食品，有利于擴(kuò)大其應(yīng)用價(jià)值。植物多酚是具有抗氧化[7]、抗菌[8]、抗腫瘤[9-10]等活性的一種可再生綠色資源，其常見(jiàn)的提取方法有溶劑法、微波輔助法、超聲輔助法和酶解法等[11]，其中超聲輔助法因簡(jiǎn)單易行、溶劑消耗少、提取率高等而被廣泛使用[12]。

為了全面構(gòu)建單性木蘭化學(xué)成分庫(kù)，完善開(kāi)發(fā)單性木蘭的綜合利用，試驗(yàn)擬以單性木蘭枝為原料，采用超聲波輔助法提取多酚，通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)確定最佳提取工藝，并研究單性木蘭枝多酚的總抗氧化性、對(duì)DPPH·和·OH的清除作用，以期擴(kuò)展單性木蘭該資源化學(xué)成分研究的數(shù)據(jù)資源以及為單性木蘭作為功能性食品、天然抗氧劑品的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

單性木蘭枝：采摘于廣西南寧武鳴；

福林酚：分析純，上海寶曼生物科技有限公司；

丙酮：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

單寧酸、結(jié)晶紫：分析純，成都市科龍化工試劑廠(chǎng)；

DPPH：分析純，阿拉丁工業(yè)公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗儀：KQ-300DB型，上海越眾儀器設(shè)備有限公司；

分析天平：AR224CN型，上海奧豪斯儀器有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：AOE型，翱藝儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 單性木蘭枝于50 ℃烘干，粉碎，過(guò)40目篩。以石油醚為溶劑，按4∶1 (mL/g)液固比，于70 ℃油浴回流4 h，趁熱抽濾，55 ℃烘干3 h，得單性木蘭枝脫脂原料，密封保存以備用。

1.2.2 單性木蘭枝多酚的定性分析 分別往單性木蘭枝多酚提取液中加入少量的0.3% FeCl3溶液、1%明膠溶液，搖勻，觀(guān)察試驗(yàn)現(xiàn)象；向10 mL單性木蘭枝多酚提取液中依次加入1 mL 36%甲醛和2 mL濃鹽酸，煮沸，回流30 min，觀(guān)察試驗(yàn)現(xiàn)象；取單性木蘭枝多酚提取液0.1 mL，進(jìn)行Folin-Ciocalteaus顯色，用紫外分光光度計(jì)掃描[5]68。以單寧酸作為對(duì)照。

1.2.3 單性木蘭枝多酚的定量分析 以蒸餾水為溶劑，配制質(zhì)量濃度為105 μg/mL的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確移取0.3，0.5，0.8，1.0，1.3 mL的單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于5個(gè)25 mL的棕色容量瓶中，加入1.3 mL的福林酚溶液，搖勻靜置6 min，加入5 mL的飽和碳酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，定容至刻度線(xiàn)，搖勻避光靜置30 min[13]。以單寧酸溶液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)，繪制出單寧酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，擬合回歸方程為：y=0.106 4x+0.090 7，R2=0.999 2。說(shuō)明在1.00～6.00 μg/mL范圍內(nèi)，單寧酸呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

準(zhǔn)確量取一定體積的樣品提取液，用上述方法顯色后測(cè)定吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算相關(guān)濃度，根據(jù)式(1)計(jì)算單性木蘭枝多酚的得率。

(1)

式中：

Y——單性木蘭枝多酚的得率，%；

WR——脫脂原料的質(zhì)量，g；

C——通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程求出的濃度，μg/mL；

V1——提取液的總體積，mL；

V2——測(cè)定時(shí)量取的提取液體積，mL。

1.2.4 單性木蘭枝多酚提取工藝優(yōu)化 稱(chēng)取10.00 g單性木蘭枝脫脂原料，在溫度65 ℃下進(jìn)行超聲輔助提取，研究不同提取劑、丙酮濃度、液固比、提取時(shí)間對(duì)單性木蘭枝多酚得率的影響。

(1) 提取劑：采用液固比20∶1 (mL/g)，提取時(shí)間為10 min，提取劑分別為70%丙酮，70%乙醇，70%乙醇(1%鹽酸)酸性溶液，蒸餾水，考察單性木蘭枝多酚的得率。

(2) 丙酮濃度：采用液固比20∶1 (mL/g)，提取時(shí)間為10 min，丙酮溶度分別為50%，60%，70%，80%，90%，考察單性木蘭枝多酚的得率。

(3) 液固比：采用丙酮濃度70%，提取時(shí)間為10 min，液固比分別為10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1 (mL/g)，考察單性木蘭枝多酚的得率。

(4) 提取時(shí)間：采用丙酮濃度70%，液固比為20∶1 (mL/g)，提取時(shí)間分別為5，10，15，20，25 min，考察單性木蘭枝多酚的得率。

(5) 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)后，對(duì)丙酮濃度、液固比、提取時(shí)間進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以單性木蘭枝多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化單性木蘭枝多酚提取工藝條件。

1.2.5 單性木蘭枝多酚的分離 將單性木蘭枝多酚提取液在40 ℃下減壓濃縮，于50 ℃烘干得多酚粗提物。將單性木蘭枝多酚提取液在40 ℃下減壓濃縮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯層和水層于50 ℃下濃縮干燥，分別得到乙酸乙酯層樣和水層樣。

1.2.6 單性木蘭枝多酚抗氧化性的測(cè)定 試驗(yàn)取單性木蘭枝多酚粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣為研究對(duì)象，對(duì)其總抗氧化性、DPPH·清除能力和·OH清除能力進(jìn)行抗氧化性測(cè)定。

(1) 總抗氧化性：分別取質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06，0.07 mg/mL的單性木蘭枝多酚的粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣溶液各1 mL，依次加入0.6 mol/L濃硫酸1 mL、28 mmol/L磷酸鈉溶液1 mL、4 mmol/L鉬酸銨溶液1 mL，于95 ℃的水浴中恒溫1.5 h，在695 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度[14]，用VC溶液作對(duì)照。試驗(yàn)平行3次，取平均值。

(2) DPPH·清除作用：分別取質(zhì)量濃度為0.000 1，0.000 5，0.001 3，0.001 7，0.002 3，0.003 5，0.005 0 mg/mL的單性木蘭枝多酚的粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣溶液2 mL，分別加入0.004 mg/mL的DPPH·乙醇溶液2 mL，搖勻，避光放置0.5 h，在514 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度Ai[5]71[15]，其中不加DPPH·乙醇溶液時(shí)的吸光度為Aj，在加入DPPH·乙醇溶液前用蒸餾水代替多酚樣品溶液作空白，測(cè)定吸光度A0，用VC溶液作對(duì)照。試驗(yàn)平行3次，取平均值。按式(2)計(jì)算單性木蘭枝多酚對(duì)DPPH·的清除率。

(2)

式中：

S——多酚對(duì)DPPH·的清除率，%；

A0——水與DPPH·混合溶液的吸光度；

Ai——樣品溶液與DPPH·混合反應(yīng)后的吸光度；

Aj——樣品溶液與無(wú)水乙醇混合溶液的吸光度。

(3) ·OH清除作用：分別取質(zhì)量濃度為0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40 mg/mL的單性木蘭枝多酚的粗取物、乙酸乙酯層樣、水層樣溶液1 mL于10 mL刻度試管中，依次加入0.4 mmol/L結(jié)晶紫0.3 mL、1.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.2 mL、2.0 mmol/L過(guò)氧化氫溶液0.6 mL，用pH 4.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸的緩沖溶液定容到刻度線(xiàn)，混勻，避光靜置0.5 h，在580 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度As[16]，其中不加過(guò)氧化氫溶液時(shí)的吸光度為A0，在加入過(guò)氧化氫溶液前用蒸餾水代替多酚樣品溶液作空白，測(cè)定吸光度Ab，用VC溶液作對(duì)照。試驗(yàn)平行3次，取平均值。按式(3)計(jì)算單性木蘭枝多酚對(duì)·OH的清除率。

(3)

式中：

S——多酚對(duì)·OH的清除率，%；

A0——體系中不加過(guò)氧化氫溶液的吸光度；

As——加入樣品溶液的吸光度；

Ab——不加樣品溶液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單性木蘭枝多酚的定性分析

2.1.1 顏色反應(yīng)對(duì)比 用單性木蘭枝的多酚提取液的顏色反應(yīng)進(jìn)行定性分析，用單寧酸溶液作對(duì)比，結(jié)果如表1所示。由表1可知，單性木蘭枝的提取液中含有多酚類(lèi)物質(zhì)——單寧。

2.1.2 紫外可見(jiàn)光譜分析 經(jīng)福林酚顯色，單性木蘭枝

表1 提取液和單寧酸的對(duì)比

多酚提取液和單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外可見(jiàn)光譜如圖1所示。由圖1可知，單性木蘭枝多酚提取液和單寧酸標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)，均顯示在760 nm處，故選擇760 nm作為測(cè)定的吸收波長(zhǎng)。

圖1 單性木蘭枝多酚的紫外可見(jiàn)光譜圖

Figure 1 UV spectra ofM.kwangsiensisbranch polyphenols

圖2 提取劑對(duì)單性木蘭枝多酚得率的影響

Figure 2 Effect of different solvent on yieldM.kwangsiensisbranch polyphenols

2.2 單性木蘭枝多酚提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 提取劑的影響 由圖2可知，提取劑對(duì)單性木蘭枝多酚得率影響的次序?yàn)椋?0%丙酮>70%乙醇>70%乙醇(1%鹽酸)酸性溶液>蒸餾水。根據(jù)相似相溶原理可知，丙酮溶液與多酚物質(zhì)的極性相近，確定丙酮溶液為單性木蘭枝多酚的最佳提取溶劑。

2.2.2 丙酮濃度的影響 由圖3可知，隨著丙酮濃度的增大，單性木蘭枝多酚的得率呈先增大后降低的趨勢(shì)，當(dāng)丙酮濃度為70%時(shí)得率最高，原因可能是丙酮濃度過(guò)大，脂溶性物質(zhì)溶出增加，從而多酚得率降低[17]。故選擇60%，70%，80% 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.3 液固比的影響 由圖4可知，隨著液固比的增大，單性木蘭枝多酚的得率呈先增大后趨于平緩的趨勢(shì)，在液固比>20∶1 (mL/g)時(shí)，單性木蘭枝多酚得率幾乎保持不變。適當(dāng)增大液固比有利于多酚溶出，但液固比過(guò)大，會(huì)消耗大量溶劑、增大后續(xù)濃縮的操作難度[18]。故選擇15∶1，20∶1，25∶1 (mL/g)3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.4 提取時(shí)間的影響 由圖5可知，隨著提取時(shí)間的增加，單性木蘭枝多酚的得率呈先增大后減少的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為15 min時(shí)得率最大，這是因?yàn)閯傞_(kāi)始超聲輔助提取時(shí)，單性木蘭枝粉末細(xì)胞破碎度逐漸增加，但超聲提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，多酚雖已基本溶出，但部分多酚已被氧化分解[19]。故選擇10，15，20 min 3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖3 丙酮濃度對(duì)單性木蘭枝多酚得率的影響

Figure 3 Impact of acetone concentration on yield ofM.kwangsiensisbranch polyphenols

圖4 液固比對(duì)單性木蘭枝多酚得率的影響

Figure 4 Impact of ratio of solvent to materials on yield ofM.kwangsiensisbranch polyphenols

圖5 提取時(shí)間對(duì)單性木蘭枝多酚得率的影響

Figure 5 Impact of extraction time on yield ofM.kwangsiensisbranch polyphenols

2.2.5 提取條件的優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇丙酮濃度、液固比、提取時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)選取的因素與水平見(jiàn)表2，試驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表3。

表2響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素和水平表

Table 2 Independent variables and their levels in the response surface methodology test

水平X1 丙酮濃度/%X2 液固比(mL/g)X3 提取時(shí)間/min-16015∶11007020∶11518025∶120

表3響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案及結(jié)果

Table 3 The experimental design and results for yield of polyphenols in the response surface methodology test

序號(hào)X1X2X3多酚得率/%1-1-100.9321-100.953-1101.1841101.165-10-11.11610-11.247-1011.3181011.1190-1-11.161001-11.09110-111.05120111.39130001.46140001.47150001.40160001.38170001.40

對(duì)表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，將各個(gè)數(shù)值與對(duì)應(yīng)的各因素之間的關(guān)系進(jìn)行二元回歸擬合，可以得到單性木蘭枝多酚的得率(Y)對(duì)丙酮濃度(X1)、液固比(X2)、提取時(shí)間(X3)的回歸方程為：

Y=-11.86+0.270 8X1+0.280 4X2+0.107 2X3-0.000 2X1X2-0.001 7X1X3+0.004 1X2X3-0.001 7X12-0.007 7X22-0.002 3X32。

(4)

由回歸方程可知，對(duì)單性木蘭枝多酚得率影響的因素從大到小的順序?yàn)椋阂汗瘫?丙酮濃度>提取時(shí)間。將單性木蘭枝多酚得率的二次多項(xiàng)回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 回歸方程方差分析?

? * P<0.05，** P<0.01，*** P<0.000 1。

由表4可知，R2=0.972 3，失擬項(xiàng)不顯著，表明單性木蘭枝多酚得率的二次多項(xiàng)方程擬合較好，方程可靠性較強(qiáng)。在一次項(xiàng)X1、X2、X3中，僅X2的P值在0.001～0.010范圍內(nèi)，效果較為顯著，表明液固比對(duì)單性木蘭枝多酚的得率影響最強(qiáng)，丙酮濃度和提取時(shí)間影響較弱。在交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3中，丙酮濃度和提取時(shí)間、液固比和提取時(shí)間之間的交互作用對(duì)單性木蘭枝多酚的得率均有較強(qiáng)的影響。在二次項(xiàng)X12、X22、X32中，丙酮濃度和液固比的二次項(xiàng)比提取時(shí)間的二次項(xiàng)對(duì)單性木蘭枝多酚的得率影響較大。

2.2.6 響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖分析 通過(guò)Design Expert 7.0軟件對(duì)響應(yīng)面的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，研究丙酮濃度、液固比、提取時(shí)間這3個(gè)因素對(duì)單性木蘭枝多酚得率的影響相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線(xiàn)如圖6～8所示。由圖6～8可

知，對(duì)單性木蘭枝多酚得率影響較大的是丙酮濃度和提取時(shí)間、液固比和提取時(shí)間的交互作用，影響較小的是丙酮濃度和液固比的交互作用。

2.2.7 最優(yōu)條件的驗(yàn)證 通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得單性木蘭枝多酚最優(yōu)提取條件為：67.40%丙酮濃度、22.44∶1 (mL/g)液固比、19.64 min提取時(shí)間，預(yù)測(cè)單性木蘭枝多酚的得率為1.46%。綜合試驗(yàn)條件，將最優(yōu)提取條件調(diào)整為67%丙酮濃度、22∶1 (mL/g)液固比、20 min提取時(shí)間。在調(diào)整后的條件下平行提取4次，單性木蘭枝多酚的得率分別為1.46%，1.45%，1.45%，1.44%，平均得率為1.45%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為0.46%，證明該響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果可靠。有文獻(xiàn)[5]82[6]指出，單性木蘭葉中多酚的得率為2.44%，高于試驗(yàn)單性木蘭枝多酚得率，可能是因?yàn)閱涡阅咎m不同部位的多酚含量有所差別，或是因?yàn)椴煌崛l件對(duì)得率有影響。

圖6 丙酮濃度和液固比對(duì)多酚得率的3D和2D作用

圖7 丙酮濃度和提取時(shí)間對(duì)多酚得率的3D和2D作用

圖8 液固比和提取時(shí)間對(duì)多酚得率的3D和2D作用

2.3 單性木蘭枝多酚的抗氧化性

2.3.1 總抗氧化性 由圖9可知，所有樣品溶液的總抗氧化性均隨濃度的增大而增強(qiáng)。當(dāng)濃度為0.07 mg/mL時(shí)，VC的吸光度為0.56，單性木蘭多酚的粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣的吸光度分別VC的40.71%，30.18%，41.07%。說(shuō)明單性木蘭多酚具有一定的總抗氧化性，但弱于VC。

圖9 單性木蘭枝多酚的總抗氧化性能力

Figure 9 Total antioxidant activities ofM.kwangsiensisbranch polyphenols

2.3.2 DPPH·清除作用 由圖10可知，單性木蘭枝多酚樣品對(duì)DPPH·清除能力與濃度呈正相關(guān)。當(dāng)濃度為0.005 mg/mL時(shí)，單性木蘭枝多酚的粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣的清除率分別為90.22%，67.39%，82.61%。與VC的清除作用相比，單性木蘭枝多酚具有良好的DPPH·清除效果。

2.3.3 ·OH清除作用 由圖11可知，單性木蘭枝多酚樣品對(duì)·OH具有良好清除能力，清除能力與濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系。當(dāng)濃度為0.40 mg/mL時(shí)，VC對(duì)·OH的清除率為36.43%，而單性木蘭枝多酚的清除作用均強(qiáng)于VC，粗提物、乙酸乙酯層樣、水層樣的清除率分別相當(dāng)于VC的2.31，2.69，2.41倍。

圖10 單性木蘭枝多酚的DPPH·清除能力

Figure 10 Scavenging activities ofM.kwangsiensisbranch polyphenols on DPPH·

圖11 單性木蘭枝多酚的·OH清除能力

Figure 11 Scavenging effect ofM.kwangsiensisbranch polyphenols on ·OH

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化單性木蘭枝多酚超聲波輔助提取法提取工藝最優(yōu)條件：丙酮濃度67%，液固比22∶1 (mL/g)，提取時(shí)間20 min，該條件下，單性木蘭枝多酚得率達(dá)1.45%?？寡趸匝芯堪l(fā)現(xiàn)，單性木蘭枝多酚具有一定的總抗氧化性，但具有良好的DPPH·和·OH清除效果，說(shuō)明單性木蘭枝多酚可開(kāi)發(fā)作為食品、藥品、化妝品等行業(yè)的天然抗氧化物。試驗(yàn)并未對(duì)單性木蘭枝多酚類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行深入的純化分離，后續(xù)可采用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行分析純化，以及探究單性木蘭枝多酚抗氧性的量效關(guān)系。