劉 沖，曹 慧，楊彩彩，王 震

（榆林市第一醫(yī)院骨科二病區(qū)，陜西榆林 719000）

骨缺損可能是意外、感染和許多其他情況引起的疾病，小骨缺損會自行愈合，而大骨缺損會因為自體的修復(fù)機制難以修復(fù)超過骨再生臨界值而無法自行修復(fù)[1]。骨移植是臨界尺寸骨缺損的主要治療方法，自體骨移植是骨移植的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但由于無法獲得足夠數(shù)量的自體移植物，在需要進(jìn)行大量填充和移植的患者中并不合適；異種移植雖然可以克服這些缺點，但這些替代物的骨誘導(dǎo)和骨傳導(dǎo)能力低[2]，因此，研究骨誘導(dǎo)和傳導(dǎo)能力有利于骨缺損后的修復(fù)治療。

柚皮苷（Naringin，NAR） 是骨碎補的主要有效成分，屬于多甲氧基黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎及促進(jìn)骨形成等作用[3]。有研究表明，柚皮苷可通過調(diào)控miRNAs 表達(dá)水平發(fā)揮其作用，例如，柚皮苷可通過上調(diào)miR-20a 的表達(dá)水平促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[4]。據(jù)報道，miRNAs 在多種疾病中異常表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞周期等生物過程[5]，例如，miR-199a-5p 可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡和炎癥[6]；miR-199a-5p 可通過靶向Mafb 蛋白正向調(diào)控RANKL 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化[7]，但其在骨損傷修復(fù)中研究較少。內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶-1（ECE1）作為miR-199a-5p 的靶基因是一種強有力的血管收縮劑，其表達(dá)與更大、更強壯、更致密的骨骼的存在有關(guān)[8]。因此，本研究旨在探討柚皮苷通過調(diào)控miR-199a-5p/ECE1 分子軸對骨損傷修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MC3T3-E1 細(xì)胞（貨號：CBP60946） 購買于南京佰科生物科技有限公司，柚皮苷購買于上海吉至生化科技有限公司，CO2培養(yǎng)箱購買于上海冠森生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將凍存的MC3T3-E1 細(xì)胞從液氮罐中取出，置于37℃水浴鍋中，不停搖晃至完全溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL 含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入新鮮的含胎牛血清及青霉素和鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液重懸，輕輕吹打混勻后置于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后，向各孔加入不同濃度柚皮苷（5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL），繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后檢測不同濃度柚皮苷對細(xì)胞增殖的影響。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染取處于對數(shù)生長期的MC3T3-E1細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種于6 孔板，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將 si-ECE1、miR-199a-5p mimics/inhibitor 轉(zhuǎn)染于MC3T3-E1 細(xì)胞中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 待用。

1.2.3 Western blotting 檢測MC3T3-E1 細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平MC3T3-E1 細(xì)胞經(jīng)相應(yīng)的處理后，用預(yù)冷PBS 輕輕洗滌3 次，冰上用Western 蛋白裂解液裂解15 min，12 000 r/mim 離心20 min 收集上清；用BCA 法測蛋白含量，每組用等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分離，200 mA 恒定電流電轉(zhuǎn)90 min 將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉孵育2 h 后加入一抗（1:1 500），4℃孵育過夜，然后用過氧化物酶結(jié)合的二抗（1:1 000）。使用化學(xué)發(fā)光試劑曝光顯影，于凝膠成像儀上觀察拍照，采用Image J 灰度分析軟件分析灰度值，計算蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.4 MTT 檢測MC3T3-E1 細(xì)胞增殖活力收集處于對數(shù)生長期的待測細(xì)胞，以1×105個/ 孔的密度接種于48 孔板，每孔0.5 mL，將細(xì)胞置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別在培養(yǎng)一定時間時加入50 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，1 000 r/min 離心10 min，小心吸去上清，每孔加入300 μL二甲基亞砜，吹打均勻后，每孔取200 μL液體移入新的96 孔板，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定在490 nm 處的吸光值。

1.2.5 RT-qPCR 檢測miRNAs 表達(dá)使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，在提取過程中注意避免RNA 降解和污染。采用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將全部RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以U6 為內(nèi)參，進(jìn)行PCR 擴增，擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共50個循環(huán)。引物序列見表1，結(jié)果采用2-△△Ct表示。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測miR-199a-5p 和ECE1 靶向關(guān)系StarBase 數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-199a-5p 和ECE1 的結(jié)合位點。采用基因突變技術(shù)改變miR-199a-5p 和ECE1 的結(jié)合位點或擴增ECE1 3’-UTR 片段，分別插入熒光素酶報告基因PmirGLO 中，產(chǎn)生ECE1 基因突變型MUT-PmirGLO-ECE1-3’ -UTR 和 野 生 型WT-PmirGLO-ECE1-3’ -UTR。將 miR-199a-5p mimics 或陰性對照分別與WT-PmirGLO-ECE1-3’-UTR 和MUT-PmirGLO-ECE1-3’-UTR 共轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1 細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h，用雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測各組熒光素酶活性。

1.2.7 MC3T3-E1 細(xì)胞ALP 活性檢測取各組待測細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種于24 孔板，每孔0.5 mL。培養(yǎng)14 d用PBS 洗滌3 次，加入RIPA 蛋白裂解液，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，然后加入ALP 檢測試劑孵育30 min后再加入3 M NaOH 終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度值（OD 值）。

1.2.8 茜素紅染色檢測MC3T3-E1 細(xì)胞礦化情況取各組待測細(xì)胞，胰蛋白酶常規(guī)消化后將細(xì)胞以1×105個/孔的密度接種于24 孔板，培養(yǎng)14 d 用PBS 洗滌3 次，4%戊二醛溶液固定30 min，2%茜素紅染色30 min，PBS 洗滌3 次后光鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有試驗均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)以表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計圖采用GraphPad 7.0 軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷促進(jìn)骨損傷修復(fù)

MTT 檢測結(jié)果顯示，用不同濃度柚皮苷（5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL） 處 理MC3T3-E1 細(xì)胞后，顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖活力（P＜0.001），且在20 ng/mL 時細(xì)胞增殖活力最強（圖1A，P＜0.01）。Western blotting 檢測結(jié)果顯示，柚皮苷（20 ng/mL）能顯著促進(jìn)Runx2、OPN、BMPs、OC 表達(dá)（圖1B，P＜0.01，P＜0.001）。MC3T3-E1 細(xì)胞ALP 活性檢測結(jié)果顯示，柚皮苷能顯著促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞ALP 活性（圖1C，P＜0.01）。茜紅素染色檢測結(jié)果顯示，柚皮苷能顯著促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞的鈣礦化（圖1D，P＜0.01）。由此可知，柚皮苷能促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖和成骨分化和鈣礦化，以此促進(jìn)骨損傷修復(fù)。

圖1 柚皮苷對骨損傷修復(fù)的影響Fig.1 Effects of naringin on bone injury repair

2.2 柚皮苷上調(diào)MC3T3-E1 細(xì)胞中miR-199a-5p 表達(dá)

RT-qPCR 檢測結(jié)果顯示，柚皮苷能顯著上調(diào)與骨損傷修復(fù)相關(guān)miRNAs 的表達(dá)水平，尤其是miR-199a-5p 的表達(dá)水平（圖2，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。由此可知，柚皮苷能上調(diào)MC3T3-E1 細(xì)胞中miR-199a-5p 表達(dá)水平。

圖2 柚皮苷對MC3T3-E1 細(xì)胞中與骨損傷修復(fù)相關(guān)miRNAs 的表達(dá)的影響Fig.2 Effects of naringin on the expression of miRNAs related to bone injury repair in MC3T3-E1cells

2.3 miR-199a-5p 靶向下調(diào)ECE1 表達(dá)

通過生物學(xué)信息庫 StarBase 2.0 預(yù)測miR-199a-5p 的靶基因，結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)ECE1 是miR-199a-5p 的候選靶基因（圖3A）。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-199a-5p 能使ECE1 野生型載體的熒光素酶活性顯著降低，而對ECE1 突變型載體的熒光素酶活性無顯著影響（圖3B，P＜0.01）。Western blotting 檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-199a-5p mimic 后ECE1 的表達(dá)顯著降低；柚皮苷也可顯著降低MC3T3-E1 細(xì)胞中ECE1的表達(dá)（圖3C，P＜ 0.01）。由此可知，miR-199a-5p 可靶向下調(diào)ECE1 的表達(dá)。

2.4 柚皮苷通過調(diào)控miR-199a-5p/ECE1 分子軸促進(jìn)骨損傷修復(fù)

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，敲降ECE1后，MC3T3-E1 細(xì)胞中ECE1 表達(dá)顯著下調(diào)，而同時敲降ECE1 和miR-199a-5p 后回復(fù)單獨敲降ECE1 對ECE1 表達(dá)的抑制作用（圖4A，P＜0.001）。MTT、ALP 活性檢測、茜素紅染色檢測結(jié)果顯示，柚皮苷顯著促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖活力、ALP 活性和鈣礦化能力；敲降miR-199a-5p后回復(fù)柚皮苷對MC3T3-E1 細(xì)胞增殖活力、ALP活性和鈣礦化的促進(jìn)作用，且與NC 組無顯著差異；敲降ECE1 后顯著促進(jìn)了柚皮苷對MC3T3-E1細(xì)胞增殖活力、ALP 活性和生物礦化能力的促進(jìn)作用；同時敲降miR-199a-5p 和ECE1 后，柚皮苷對MC3T3-E1 細(xì)胞增殖活力、ALP 活性和鈣礦化能力的促進(jìn)作用比單獨敲降miR-199a-5p 顯著增加，比單獨敲降ECE1 顯著降低（圖4B）。Western blotting 檢 測MC3T3-E1 細(xì) 胞 中Runx2、OPN、BMPs、OC 表達(dá)水平，檢測結(jié)果顯示，柚皮苷顯著促進(jìn)Runx2、OPN、BMPs、OC 表達(dá)水平；敲降miR-199a-5p 后回復(fù)柚皮苷對Runx2、OPN、BMPs、OC 表達(dá)的促進(jìn)作用；敲降ECE1 后顯著上調(diào)了柚皮苷對Runx2、OPN、BMPs、OC 表達(dá)的促進(jìn)作用；同時敲降miR-199a-5p 和ECE1 后，柚皮苷對Runx2、OPN、BMPs、OC 表達(dá)的促進(jìn)作用比單獨敲降miR-199a-5p 顯著增加，比單獨敲降ECE1 顯著降低（圖4C，P＜0.01，P＜0.001）。ALP 活性檢測、茜素紅染色檢測結(jié)果顯示，柚皮苷顯著促進(jìn)ALP 活性和鈣礦化能力；敲降miR-199a-5p 后回復(fù)柚皮苷對ALP 活性和鈣礦化的促進(jìn)作用，且與NC 組無顯著差異；敲降ECE1后顯著促進(jìn)了柚皮苷對ALP 活性和生物礦化能力的促進(jìn)作用；同時敲降miR-199a-5p 和ECE1 后，柚皮苷對ALP 活性和鈣礦化能力的促進(jìn)作用比單獨敲降miR-199a-5p 顯著增加，比單獨敲降ECE1顯著降低（圖4D、4E，P＜0.01）。由此可知，柚皮苷通過調(diào)控miR-199a-5p/ECE1 分子軸促進(jìn)骨損傷修復(fù)。

圖3 miR-199a-5p 對ECE1 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of miR-199a-5p on ECE1 expression

3 討論

隨著人類生產(chǎn)、生活節(jié)奏的加快以及人口老齡化的加劇，骨和軟骨損傷的患者呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[9]。研究表明，骨損傷后的修復(fù)是一個特殊的過程，產(chǎn)生新骨的一系列有序過程受到系統(tǒng)和局部因子的調(diào)控，任何影響該過程的因素出現(xiàn)異常都會影響愈合的進(jìn)程[10]，因此，明確這些事件過程和調(diào)節(jié)因素對促進(jìn)骨愈合有重要意義。

圖4 柚皮苷通過調(diào)控miR-199a-5p/ECE1 分子軸促進(jìn)骨損傷修復(fù)Fig.4 Naringin promotes the repair of bone injury by regulating the axis of miR-199a-5p/ECE1

有研究發(fā)現(xiàn)，NAR 具有雌激素活性，可以降低血液膽固醇，減少血栓形成，改善局部微循環(huán)和營養(yǎng)供應(yīng)，因此，NAR 被廣泛應(yīng)用于臨床，預(yù)防心腦血管疾病，并作為骨折愈合的輔助治療手段[11]。另有研究發(fā)現(xiàn)，NAR 可通過上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs） 的表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，使骨密度增加，促進(jìn)骨形成[12]。此外，NAR 還可將地塞米松導(dǎo)致的MC3T3-E1 細(xì)胞骨橋蛋白和骨保護素蛋白表達(dá)減少及堿性磷酸酶的活性減退逆轉(zhuǎn)改善，并增加他們的骨礦物質(zhì)密度，表現(xiàn)出較好的成骨作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖，促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞中促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因（Runx2、OPN、Collagen-Ⅰ、OC、BMP） 的表達(dá)，增加成骨細(xì)胞ALP 活性并促成骨細(xì)胞進(jìn)生物礦化，從而促進(jìn)骨損傷修復(fù)。

眾所周知，miRNA 在多種疾病中異常表達(dá)，可通過與靶mRNA 結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞生物學(xué)過程。據(jù)報道，有許多中藥的活性提取物都可通過介導(dǎo)細(xì)胞中miRNAs 表達(dá)調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過程。例如，淫羊藿活性提取物淫羊藿苷可通過抑制股骨頭微血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-335 的表達(dá)來預(yù)防激素性股骨頭壞死的發(fā)生[14]；骨碎補提取物柚皮苷可通過增加miR-126 的表達(dá)下調(diào)VCAM-1 抑制人軟骨肉瘤的遷移和侵襲能力[15]。有研究表明，miR-199a-5p 在多種疾病中均起著重要的調(diào)控作用，例如，miR-199a-5p 通過靶向下調(diào)MAP3K11表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌的惡性生物學(xué)進(jìn)程[16]；過表達(dá)miR-199a-5p 抑制細(xì)胞存活和血管生成，而抑制miR-199a-5p 在肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管生成[17]；miR-199a-5p 可通過抑制HIF1α-Twist 途徑促進(jìn)成骨[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，柚皮苷可上調(diào)MC3T3-E1 細(xì)胞中miR-199a-5p 表達(dá)，促進(jìn)骨損傷修復(fù)。

內(nèi)皮素（endothelin，ET） 是高度有效的血管收縮肽，參與多種人體生理、病理過程，通常以極低的濃度存在于機體中，當(dāng)刺激作用于內(nèi)皮細(xì)胞時，ET 會裂解成無活性的多肽，再在ECE1 的剪切作用下轉(zhuǎn)化成活性多肽，以此發(fā)揮其作用[19]。ECE1 是一種Ⅱ型膜邊界金屬蛋白酶，在細(xì)胞表面以二聚體的形式存在，ECE1 的大胞外結(jié)構(gòu)域?qū)ζ浯呋钚云鹬匾饔谩Ｏ惹暗难芯勘砻?，增強的ECE1 活性增加了ET 的合成，促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞的增殖和有絲分裂，活性氧的產(chǎn)生和炎癥分子的形成，導(dǎo)致血壓升高和動脈粥樣硬化[20]。此外，ECE1 還參與了一系列疾病的發(fā)病機制，包括骨髓缺血/再灌注誘導(dǎo)的損傷、癌癥、腦出血和骨質(zhì)疏松、骨折[21-24]等，但其在骨損傷修復(fù)中的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a-5p 靶向下調(diào)ECE1 表達(dá)，促進(jìn)骨損傷修復(fù)。

綜上所述,柚皮苷通過調(diào)控miR-199a-5p/ECE1分子軸促進(jìn)MC3T3-E1 細(xì)胞增殖、成骨分化和礦化，從而可促進(jìn)骨損傷修復(fù)。

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