石 柳，章 蔚,2，周俊鵬,2，汪 蘭，李 新，丁安子，熊光權(quán)，楊 宏*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工研究分中心，湖北 武漢 430064；2.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070）

蛋白質(zhì)是魚(yú)肉的重要組成成分和營(yíng)養(yǎng)成分，魚(yú)肉蛋白的提取及特性研究對(duì)于食品業(yè)的發(fā)展具有重要意義。等電點(diǎn)沉淀法（isoelectric solubilization precipitation，ISP）是根據(jù)肌肉蛋白在極酸極堿條件下溶解度不同的原理，通過(guò)改變?nèi)芤簆H值誘導(dǎo)原料中蛋白質(zhì)溶解或沉淀進(jìn)行分離提取的方法[1]。相較于傳統(tǒng)漂洗法，ISP法具有操作簡(jiǎn)單、蛋白質(zhì)得率高、去脂效果好等優(yōu)勢(shì)[2-3]。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于提取鯡魚(yú)、巖魚(yú)、鯰魚(yú)、鰱魚(yú)等魚(yú)類肌肉蛋白質(zhì)，被認(rèn)為是一種提取魚(yú)肉蛋白質(zhì)的高效方法[4-8]。

不同的提取方法或酸堿處理都會(huì)導(dǎo)致魚(yú)肉蛋白組成和結(jié)構(gòu)的變化，直接影響蛋白質(zhì)的功能特性，從而影響魚(yú)肉蛋白的加工過(guò)程和產(chǎn)品品質(zhì)[9-10]。魚(yú)肉蛋白具有諸多功能特性，如水合性、乳化性、成膜性、膠凝性等。其中，膠凝特性是魚(yú)肉蛋白最重要的功能特性，目前關(guān)于魚(yú)肉蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的機(jī)理研究較多，加熱溫度主要集中在100 ℃以下。馬瑤蘭等[11]研究發(fā)現(xiàn)在40～90 ℃條件下，非二硫共價(jià)鍵是形成鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠網(wǎng)絡(luò)的主要作用力之一。鄭昇陽(yáng)等[12]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)大黃魚(yú)魚(yú)糜的凝膠強(qiáng)度和質(zhì)構(gòu)特性隨著凝膠化溫度的升高而降低，在35 ℃時(shí)制得的魚(yú)糜凝膠產(chǎn)品特性較好。張夢(mèng)玲等[13]研究發(fā)現(xiàn)鰱魚(yú)糜在40 ℃保溫1 h后90 ℃加熱30 min條件下可以形成較高凝膠強(qiáng)度的魚(yú)糜凝膠，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在100 ℃以下熱誘導(dǎo)形成的凝膠需貯藏在4 ℃，且保質(zhì)期較短。而100 ℃以上熱處理形成的凝膠保質(zhì)期得到延長(zhǎng)，但蛋白質(zhì)在高溫下品質(zhì)也發(fā)生較大的變化。張莉莉[14]研究發(fā)現(xiàn)在100～120 ℃溫度范圍內(nèi)，阿拉斯加狹鱈魚(yú)糜凝膠的凝膠強(qiáng)度隨著加熱溫度的升高而顯著降低。韓靜文[15]研究不同熱加工條件的魚(yú)糜凝膠特性變化，同樣發(fā)現(xiàn)隨著加熱溫度的升高，魚(yú)糜凝膠的凝膠強(qiáng)度、彈性、持水性等相關(guān)指標(biāo)的下降速度加快。Belibagli等[16]研究發(fā)現(xiàn)，魚(yú)糜在溫度超過(guò)85 ℃的條件下，熱特性發(fā)生變化，并認(rèn)為是高溫處理破壞了其魚(yú)糜凝膠結(jié)構(gòu)所致。但目前關(guān)于ISP提取蛋白質(zhì)的高溫膠凝特性研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以白鰱為原料，采用漂洗法和ISP法提取蛋白質(zhì)，對(duì)比研究ISP提取蛋白質(zhì)與漂洗魚(yú)糜蛋白質(zhì)的高溫膠凝特性的差異，以期為常溫即食ISP提取蛋白凝膠制品的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白鰱（Hypohthalmichthyx mitrix） 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菜市場(chǎng)；冷凍白鰱魚(yú)糜（AAA級(jí)，添加6%蔗糖和0.3%三聚磷酸鹽為抗凍劑） 洪湖井立水產(chǎn)食品有限公司。冷凍魚(yú)糜切分300 g左右小塊，真空包裝，-80 ℃凍藏備用。

氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、考馬斯亮藍(lán)G-250、山梨醇、蔗糖、尿素、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、磷酸 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺、冰醋酸、丙烯酰胺、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品、過(guò)硫酸銨、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍(lán)R-250 美國(guó)Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris）、8-苯胺-1-萘磺酸 美國(guó)Sigma公司；5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 瑞士Fluka公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

812絞肉機(jī) 美國(guó)Biro公司；ZM-100反壓蒸煮消毒鍋 廣州標(biāo)際包裝設(shè)備有限公司；HH-6恒溫水浴鍋中國(guó)欣靈電氣股份有限公司；Avanti-JE高速冷凍離心機(jī)美國(guó)Beckman Coulter公司；T18高速分散均質(zhì)機(jī) 德國(guó)IKA公司；UMC5真空斬拌機(jī)（配RB 0006C真空泵）美國(guó)Stephan Machinery公司；TA-HDi質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)Texture Technologies Corp公司；CR-400色差儀 日本Minolta Camera司；722s可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；818 pH計(jì) 美國(guó)奧立龍公司；Mini電泳系統(tǒng)、XR凝膠掃描儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 ISP提取蛋白質(zhì)的制備

參考Abdollahi等[17]的方法并作適當(dāng)調(diào)整。白鰱在4 ℃解凍12 h，稱取860 g樣品，與冷卻蒸餾水以料液比1∶6（g/mL）混合，均質(zhì)10 min，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)均質(zhì)液pH值至11.5，繼續(xù)均質(zhì)10 min，4 ℃、10 000×g離心10 min。離心后均質(zhì)液出現(xiàn)分層，表層為漂浮的脂質(zhì)組分，底層為不溶性物質(zhì)組分，中間層為可溶性蛋白。8 層紗布過(guò)濾獲得中間層的可溶性蛋白溶液，用8 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值至5.5，輕微攪拌10 min，4 ℃、10 000×g離心10 min。離心后傾倒上清液，收集的沉淀即為ISP提取蛋白質(zhì)組分。

1.3.2 蛋白凝膠的制備

參考張瑞婷等[18]的方法，將冷凍白鰱魚(yú)糜（漂洗蛋白）和ISP提取蛋白在室溫下解凍30 min，切成小塊后于真空斬拌機(jī)中低速空斬1 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaCl，低速斬拌1 min；加入0.5%谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（transglutaminase，TGase），加入冰水調(diào)節(jié)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)至78%，低速斬拌1 min；最后在真空（50 kPa）條件下高速斬拌3 min。整個(gè)過(guò)程中控制斬拌機(jī)內(nèi)溫度在1～4 ℃。將斬拌好的魚(yú)糊手動(dòng)灌入塑料腸衣（直徑約20 mm）中，用卡口機(jī)兩端封口。蛋白凝膠經(jīng)低溫凝膠化（40 ℃水浴加熱60 min）后在不同高溫（100、110、120 ℃）條件下加熱不同時(shí)間（15、30、60 min）。以40 ℃水浴加熱60 min后90 ℃水浴加熱30 min的樣品為對(duì)照。加熱完成后，迅速用冰水冷卻至室溫，于4 ℃冰箱放置過(guò)夜，待次日進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.3.3 質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

參考王蒙娜等[19]的方法，將蛋白凝膠于室溫恒溫2 h后，切成2 cm長(zhǎng)的圓柱體，采用P/0.25s球形探頭進(jìn)行穿刺實(shí)驗(yàn)。測(cè)試參數(shù)：觸發(fā)力5 g，測(cè)前速率5 mm/s，測(cè)中速率1 mm/s，測(cè)后速率5 mm/s，穿刺距離15 mm。記錄破斷力（g）和凹陷深度（mm）。

1.3.4 持水性的測(cè)定

參考Yin等[20]的方法，將蛋白凝膠切成約3 mm厚的薄片，稱質(zhì)量（m1），用兩層濾紙包裹后，于3 000×g室溫離心10 min，再稱量凝膠的質(zhì)量（m2）。持水性的計(jì)算如式（1）所示：

1.3.5 色度的測(cè)定

參考周俊鵬等[21]的方法，將蛋白凝膠于室溫恒溫2 h后，切成2 cm長(zhǎng)的圓柱體，用色度儀檢測(cè)其橫截面的亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。白度（W）的計(jì)算如式（2）所示：

1.3.6 化學(xué)作用力的測(cè)定

參考Zhang Longteng等[22]的方法略作修改。稱取2 g蛋白凝膠樣品，加入10 mL 0.05 mol/L NaCl溶液（A），混合均質(zhì)后于4 ℃放置1 h，10 000×g、4 ℃離心15 min，過(guò)濾后取沉淀；向沉淀中加入10 mL 0.6 mol/L N a C l溶液（B），混合均質(zhì)后于4 ℃放置1 h，10 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即為離子鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)，過(guò)濾后取沉淀；向沉淀中加入10 mL 0.6 mol/L NaCl和1.5 mol/L尿素混合溶液，混合均質(zhì)后于4 ℃放置1 h，10 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即為氫鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)，過(guò)濾后取沉淀；向沉淀中加入10 mL 0.6 mol/L NaCl和8 mol/L尿素混合溶液，混合均質(zhì)后于4 ℃放置1 h，10 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，即為疏水鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.7 總巰基含量的測(cè)定

參考賈丹[23]的方法，稱取8 g蛋白凝膠樣品，加入22 mL 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0，含0.6 mol/L KCl和0.01 mol/L EDTA），均質(zhì)，6 000×g離心10 min，取上清液，調(diào)節(jié)上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2 mg/mL，取0.5 mL上溶液，加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH 7.0，含0.01 mol/L EDTA、8 mol/L尿素和20 mg/mL SDS和0.5 mL 1 mg/mL DTNB，混合均勻后于40 ℃水浴25 min，412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。總巰基含量的計(jì)算如式（3）所示：

式中：A412nm為412 nm波長(zhǎng)處吸光度；ε為摩爾消光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）；B為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.8 SDS-PAGE分析

參考朱萌等[24]的方法，樣品采用5% SDS溶液加熱溶解，離心后取上清液，調(diào)節(jié)上清液蛋白質(zhì)濃度至2 mg/mL，加入上樣緩沖液。采用40 mg/mL和100 mg/mL的濃縮膠和分離膠進(jìn)行電泳，用0.125% R-250考馬斯亮藍(lán)固定和染色，然后用50%甲醇和10%冰乙酸脫色。蛋白質(zhì)條帶的分子質(zhì)量通過(guò)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品確定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel進(jìn)行處理，采用SPSS 20.0進(jìn)行差異顯著性分析和相關(guān)性分析，用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠強(qiáng)度分析

如圖1所示，在相同熱處理?xiàng)l件下，ISP提取蛋白凝膠的破斷力低于漂洗蛋白凝膠，而凹陷深度高于漂洗蛋白凝膠，表明ISP蛋白凝膠硬度較小而彈性更高。魚(yú)肉蛋白的熱誘導(dǎo)聚集是魚(yú)肉肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)和功能特性變化的復(fù)雜物化過(guò)程。在加工過(guò)程中，蛋白質(zhì)展開(kāi)，暴露蛋白質(zhì)內(nèi)部的功能團(tuán)。這些功能基團(tuán)在隨后的分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)作用下形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)快速展開(kāi)和隨后慢速聚集條件下，熱變性蛋白通過(guò)有序排列形成致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，凝膠強(qiáng)度高[25]。而在ISP加工過(guò)程中，蛋白部分變性，表面疏水性增加，結(jié)構(gòu)未充分展開(kāi)的蛋白質(zhì)在加熱前部分聚集，降低凝膠強(qiáng)度。另外，ISP蛋白凝膠破斷力的降低還可能與內(nèi)源性蛋白酶在加熱過(guò)程中降解魚(yú)肉蛋白有關(guān)。內(nèi)源性蛋白酶為水溶性的肌漿蛋白，在漂洗過(guò)程中大部分被除去，而在ISP加工中部分被回收。

圖1 高溫?zé)崽幚韺?duì)漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig. 1 Effects of high temperature treatments on the texture properties of washed surimi gels and ISP protein gels

在高溫加熱過(guò)程中，漂洗蛋白凝膠的破斷力隨著溫度的升高先增加后降低，而ISP提取蛋白凝膠的破斷力逐漸降低，漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠獲得最高破斷力的熱處理溫度分別是110 ℃和100 ℃。而Zhang Lili等[26]報(bào)道漂洗法生產(chǎn)的阿拉斯加狹鱈魚(yú)糜的凝膠強(qiáng)度隨著加熱溫度的升高（100～120 ℃）而逐漸下降，與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不同，其原因可能與不同的魚(yú)種和加熱模式有關(guān)。阿拉斯加狹鱈生長(zhǎng)在低溫水域，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定較差，在高溫下易降解；而白鰱生長(zhǎng)環(huán)境溫度較高，蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性相對(duì)較高，因此適宜的最高加熱溫度相對(duì)較高。在加熱過(guò)程中，有2 種相反的現(xiàn)象（內(nèi)源性蛋白酶裂解蛋白質(zhì)和內(nèi)源性TGase催化肌球蛋白交聯(lián)）共同影響蛋白凝膠的質(zhì)地，取決于哪種作用在一定的加熱條件中處于主導(dǎo)地位，使凝膠強(qiáng)度被增強(qiáng)或者減弱。本實(shí)驗(yàn)中，在高溫加熱前，魚(yú)肉蛋白先進(jìn)行低溫凝膠化（40 ℃加熱60 min），TGase催化反應(yīng)基本完成，提高加熱溫度有利于快速通過(guò)凝膠劣化區(qū)間（55 ℃左右，蛋白酶活力高），增加凝膠強(qiáng)度。但當(dāng)最終加熱溫度過(guò)高時(shí)，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白分子被熱降解，巰基和二硫鍵發(fā)生裂解，離子鍵和疏水相互作用減弱，凝膠強(qiáng)度下降[14]。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠各熱處理組的破斷力和凹陷深度均逐漸降低，這與Zhang Lili等[26]的研究一致。張莉莉[14]報(bào)道在100 ℃加熱溫度下，直徑為30 mm的魚(yú)腸中心溫度從15 ℃加熱到90 ℃的時(shí)間約為20 min。在本實(shí)驗(yàn)中，魚(yú)腸的直徑為20 mm，其在20 min內(nèi)中心溫度可以達(dá)到設(shè)定的最高加熱溫度。因此，與提高加熱溫度會(huì)影響魚(yú)腸的升溫速率不同，延長(zhǎng)加熱時(shí)間只會(huì)增加魚(yú)肉蛋白的降解程度。

2.2 持水性分析

圖2 高溫?zé)崽幚韺?duì)漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠持水性的影響Fig. 2 Effects of high temperature treatments on the water holding capacity of washed surimi gels and ISP protein gels

如圖2所示，漂洗蛋白凝膠的持水性在110 ℃加熱30 min時(shí)取得最大值，其整體趨勢(shì)是隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)持水性降低；ISP蛋白凝膠的持水性各組之間無(wú)顯著性差異；ISP蛋白凝膠的持水性整體上低于漂洗蛋白凝膠。凝膠強(qiáng)度高的蛋白凝膠一般具有均勻致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能截留更多的水分。因此，蛋白凝膠的持水性的變化趨勢(shì)基本與質(zhì)構(gòu)特性的變化趨勢(shì)相一致。

Zhang Lili等[26]報(bào)道了在相同加熱時(shí)間下（10 min），阿拉斯加狹鱈魚(yú)糜凝膠的持水性在加熱溫度超過(guò)115 ℃時(shí)開(kāi)始顯著下降，其原因是凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在120 ℃加熱時(shí)受到一定程度的破壞。陳斌等[27]報(bào)道了羅非魚(yú)魚(yú)糜在相同加熱溫度下（121 ℃），隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)持水性顯著降低，其原因是高溫加熱導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露，原有的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞，凝膠的持水性。盧彥宇[28]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)加熱溫度到達(dá)120 ℃時(shí)，魚(yú)糜凝膠的持水性顯著下降，這與形成魚(yú)糜凝膠的肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)在高溫情況下被破壞有關(guān)。

2.3 色度分析

表1 高溫?zé)崽幚韺?duì)漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠色度的影響Table 1 Effects of high temperature treatments on the color parameters of washed surimi gels and ISP protein gels

如表1所示，漂洗蛋白凝膠的L*值和W值整體上高于ISP蛋白凝膠，a*值和b*值整體上低于ISP蛋白凝膠。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，所有熱處理組的b*值均呈上升趨勢(shì)；漂洗蛋白凝膠的L*值和W值呈下降趨勢(shì)，ISP蛋白凝膠呈相反趨勢(shì)。漂洗蛋白凝膠100 ℃和110 ℃熱處理組的L*值和W值均顯著高于對(duì)照組，120 ℃熱處理組顯著低于對(duì)照組。除120 ℃加熱15 min處理組外，ISP蛋白凝膠的

L*、b*值和W值均顯著高于對(duì)照組，且在100 ℃熱處理組L*值和W值取得最大值。在漂洗過(guò)程中色素蛋白（血紅蛋白和肌紅蛋白）隨肌漿蛋白被去除，而在ISP加工過(guò)程中，色素蛋白在堿的作用下發(fā)生變性和氧化[29]，與魚(yú)蛋白結(jié)合在一起，使ISP提取蛋白呈現(xiàn)相對(duì)較高的a*值和b*值。L*值表示為從凝膠表面反射的總能量的高低，與凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)有關(guān)，凝膠結(jié)構(gòu)越均一致密，L*值越高。ISP提取蛋白在加熱過(guò)程中可能形成了簇狀的蛋白質(zhì)聚集體，漂洗魚(yú)糜蛋白在加熱過(guò)程中形成了更均一的凝膠結(jié)構(gòu)，因此漂洗蛋白凝膠的L*值更高。凝膠的W值與L*值呈正相關(guān)，因此漂洗蛋白凝膠的W值也相對(duì)較高。高溫?zé)崽幚硗ㄟ^(guò)影響凝膠中水分子的重新排列，而影響凝膠的折光性和透明度[15]。高溫使蛋白質(zhì)氧化，因此凝膠的b*會(huì)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；同時(shí)高溫使色素蛋白發(fā)生熱降低而褪色，因此a*逐漸降低。

2.4 化學(xué)作用力分析

圖3 高溫?zé)崽幚韺?duì)漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠化學(xué)作用力的影響Fig. 3 Effects of high temperature treatments on the chemical bond content of washed surimi gels and ISP protein gels

如圖3所示，在不同熱處理?xiàng)l件下，ISP蛋白凝膠的離子鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于漂洗蛋白凝膠，但2 種蛋白凝膠離子鍵的變化趨勢(shì)相同。在100 ℃和110 ℃條件下，2 種蛋白凝膠的離子鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。而在120 ℃加熱溫度下，離子鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。漂洗蛋白凝膠的離子鍵在110 ℃加熱60 min處理組取得最大值，ISP蛋白凝膠的離子鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在120 ℃加熱15 min處理組取得最大值，與對(duì)照組相比均顯著上升。ISP蛋白氫鍵與其離子鍵的變化趨勢(shì)一致。漂洗蛋白凝膠的氫鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在110 ℃加熱15 min處理組取得最大值，ISP蛋白凝膠的氫鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在120 ℃加熱15 min處理組取得最大值，和對(duì)照組相比漂洗蛋白凝膠的氫鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降。漂洗蛋白凝膠的疏水相互作用和總巰基含量隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，ISP蛋白凝膠的疏水相互作用和總巰基含量隨加熱溫度和時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)。離子鍵、氫鍵、疏水鍵和二硫鍵是維持蛋白凝膠的主要化學(xué)作用力。在魚(yú)肉蛋白斬拌過(guò)程中，鹽的加入使肌原纖維蛋白溶解，水合作用增強(qiáng)，離子鍵和氫鍵含量升高。在加熱過(guò)程中，肌球蛋白結(jié)構(gòu)展開(kāi)，其內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，在疏水相互作用下蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。一般認(rèn)為凝膠中巰基含量降低是因?yàn)閹€基氧化形成了二硫鍵，因此用總巰基含量的變化表征二硫鍵的含量[30]。本實(shí)驗(yàn)中，漂洗蛋白凝膠的離子鍵、氫鍵和疏水鍵質(zhì)量分?jǐn)?shù)都在110 ℃熱處理組取得較大值，而在120 ℃熱處理組隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低，其趨勢(shì)與凝膠強(qiáng)度的結(jié)果一致。ISP蛋白凝膠的離子鍵和氫鍵的變化趨勢(shì)與漂洗蛋白凝膠類似，而疏水相互作用和總巰基含量在100 ℃熱處理組取得最大值，與凝膠強(qiáng)度的結(jié)果一致。張莉莉[14]認(rèn)為在加熱過(guò)程中疏水相互作用的減弱和二硫鍵含量的增高表明蛋白質(zhì)的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中分子間側(cè)鏈之間的締和減少，而分子鏈內(nèi)部的聚合增多，但其推測(cè)有待進(jìn)一步證實(shí)。

2.5 SDS-PAGE分析

圖4 高溫?zé)崽幚韺?duì)漂洗蛋白凝膠和ISP蛋白凝膠蛋白質(zhì)模式的影響Fig. 4 Effects of high temperature treatments on the protein pattern of washed surimi gels and ISP protein gels

漂洗蛋白凝膠（圖4A）和ISP提取蛋白（圖4B）的主要蛋白條帶是肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）、肌動(dòng)蛋白（actin，AC）和原肌球蛋白（tropomyosin，TM）；與漂洗蛋白凝膠相比，ISP提取蛋白在45～70 kDa和25 kDa附近出現(xiàn)蛋白條帶。在高溫的作用下，各熱處理組的MHC完全消失，AC、TM、肌鈣蛋白（troponin，TN）、肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）和溶解酵素（lysozyme，LYS）蛋白條帶強(qiáng)度逐漸降低，位于10～25 kDa和50～100 kDa的蛋白條帶強(qiáng)度逐漸增加，其結(jié)果與張莉莉[14]的報(bào)道一致。

肌球蛋白、AC、TM和TN同屬肌原纖維蛋白。TM是細(xì)肌絲中與AC的結(jié)合蛋白，TN和TM共同調(diào)節(jié)AC和肌球蛋白的相互作用。漂洗造成魚(yú)肉蛋白水溶性肌漿蛋白損失，而ISP提取蛋白質(zhì)的組成與魚(yú)肉的蛋白質(zhì)組成基本相似。高溫使MHC和AC等發(fā)生熱降解而生成小分子質(zhì)量的蛋白和寡肽，并且隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，降解現(xiàn)象逐漸明顯。MHC和AC在高溫下降解是造成凝膠強(qiáng)度下降的主要原因。

3 結(jié) 論

經(jīng)過(guò)低溫凝膠化（40 ℃水浴加熱60 min）的白鰱ISP提取蛋白質(zhì)與漂洗魚(yú)糜蛋白在不同高溫（100、110、120 ℃）下加熱不同時(shí)間（15、30、60 min），在高溫加熱過(guò)程中，漂洗蛋白凝膠的破斷力隨著溫度的升高先增加后降低，而ISP提取蛋白凝膠的破斷力逐漸降低。漂洗蛋白凝膠的持水性隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，并在110 ℃加熱30 min時(shí)取得最大值；ISP蛋白凝膠的持水性各組之間無(wú)顯著性差異。漂洗蛋白凝膠的L*和W隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，ISP蛋白凝膠則呈相反趨勢(shì)，同時(shí)所有熱處理組的b*均呈上升趨勢(shì)。漂洗蛋白凝膠的離子鍵在110 ℃加熱60 min處理組取得最大值，ISP蛋白凝膠的離子鍵在120 ℃加熱15 min處理組取得最大值，和對(duì)照組相比均顯著上升。漂洗蛋白凝膠的氫鍵在110 ℃加熱15 min處理組取得最大值，ISP蛋白凝膠的氫鍵在120 ℃加熱15 min處理組取得最大值，與對(duì)照組相比漂洗蛋白凝膠的氫鍵顯著下降。漂洗蛋白凝膠的疏水相互作用和總巰基含量隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，ISP蛋白凝膠的疏水相互作用和總巰基含量隨加熱溫度和時(shí)間的增加呈下降趨勢(shì)。漂洗蛋白凝膠和ISP提取蛋白的主要蛋白條帶是MHC、AC和TM；在高溫的作用下，各熱處理組的MHC完全消失，AC、TM、TN、MLC和LYS蛋白條帶強(qiáng)度逐漸降低，位于10～25 kDa和50～100 kDa的蛋白條帶強(qiáng)度逐漸增加。ISP提取蛋白凝膠的破斷力、持水性、L*值、W值、離子鍵含量均顯著低于漂洗蛋白凝膠，同時(shí)ISP提取蛋白在45～70 kDa和25 kDa附近出現(xiàn)蛋白條帶。ISP提取蛋白和漂洗魚(yú)糜蛋白以上特性的差異與2 種蛋白質(zhì)的組成和蛋白結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)。ISP提取蛋白在加工過(guò)程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在酸堿的作用下部分展開(kāi)，內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，使其凝膠特性降低，后期可通過(guò)添加合適的外源性添加物來(lái)加強(qiáng)其膠凝特性，從而進(jìn)一步開(kāi)發(fā)常溫即食ISP提取蛋白凝膠制品。