侯欣　王志偉　賈夢英　楊芳　宋慧琴　段永建

[摘要] 目的 探討組蛋白脫乙酰酶9（HDAC9）基因沉默對非小細胞肺癌細胞生物學特性和Wnt信號通路影響。

方法 取非小細胞肺癌細胞株A549，設計HDAC9沉默序列，使用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印跡法（Western blot）檢測HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5的mRNA及蛋白表達水平。采用CCK8法、劃痕實驗、Transwell實驗和流式細胞術檢測細胞增殖、遷移、侵襲與凋亡等。

結果 si-HDAC9轉染細胞后JNK、β-catenin、Wnt-5表達下降，細胞生長抑制，細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯降低，凋亡增加;si-HDAC9+rWnt3a轉染可逆轉上述趨勢（F=9.070～159.400，P均<0.05）。

結論 HDAC9沉默表達可抑制Wnt信號通路，抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移與侵襲并促進細胞凋亡。

[關鍵詞] 組蛋白脫乙酰基酶類;基因沉默;癌，非小細胞肺;腫瘤轉移;腫瘤侵潤;Wnt信號通路

[中圖分類號] R345.61;R730.26

[文獻標志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2020）03-0337-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.106

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200528.0841.003.html;2020-05-28 12：03

EFFECT OF HISTONE DEACETYLASE 9 GENE SILENCING ON THE BIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND THE WNT SIGNALING PATHWAY OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER CELLS

HOU Xin， WANG Zhiwei， JIA Mengying， YANG Fang， SONG Huiqin， DUAN Yongjian

（Department of Oncology， The First Affiliated Hospital of Henan University， Kaifeng 475001， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of histone deacetylase 9 （HDAC9） gene silencing on the biological cha-

racteristics and the Wnt signaling pathway of non-small cell lung cancer cells.

MethodsThe non-small cell lung cancer cell line A549 was cultured and the HDAC9 silencing sequence was designed. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） and Western blot were used to measure the mRNA and protein expression of HDAC9， JNK， β-catenin， and Wnt-5， and CCK-8 assay， wound hea-

ling assay， Transwell assay， and flow cytometry were used to observe cell proliferation， migration， invasion， and apoptosis.

Results

After the cells were transfected with si-HDAC9， there was significant inhibition of cell growth， significant reductions in cell proliferation， migration and invasion， and a significant increase in cell apoptosis， and the transfection of si-HDAC9+rWnt3a reversed the above changes （F=9.070-159.400， all P<0.05）.

ConclusionHDAC9 gene silencing can inhibit the Wnt signaling pathway and the proliferation， migration， and invasion of non-small cell lung cancer cells and promote cell apoptosis.

[KEY WORDS]histone deacetylases; gene silencing; carcinoma， non-small-cell lung; neoplasm metastasis; neoplasm invasiveness; Wnt signaling pathway

肺癌病死率極高[1]，尤以非小細胞肺癌為著，預后極差[2-3]。組蛋白脫乙酰酶9（HDAC9）是一種轉錄抑制因子，可參與機體生長發(fā)育過程[4]，在多種癌癥中表達異常[5-7]。Wnt蛋白是生物發(fā)育過程所需的分泌型蛋白生長因子[8]。癌基因可通過激活或抑制經(jīng)典的Wnt信號通路，參與腫瘤的進程[9-11]。目前，有關HDAC9基因與非小細胞肺癌關系的研

究尚不多見。本研究探討了HDAC9基因沉默對非

小細胞肺癌細胞生物學特性和 Wnt 信號通路的影響，以期為非小細胞肺癌發(fā)病的分子機制和臨床治療機制研究奠定理論基礎，從而為肺癌診療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

體積分數(shù)為0.10的胎牛血清（上海索寶生物科技有限公司）;DMEM培養(yǎng)基、BPMI 1640培養(yǎng)基和2.5 g/L胰蛋白酶（Hyclon公司，美國）;非小細胞肺癌細胞株A549（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心）;Lipofectamin 2000、RNA提取試劑盒（Invitrogen公司，美國）;實時熒光定量PCR（qRT-PCR）儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）;免疫印跡（Western blot）抗體（武漢博士德公司）;CCK8試劑（Sigma公司，美國）;酶聯(lián)免疫檢測儀（上海精密儀器儀表有限公司）;甲紫染色劑（碧云天生物技術有限公司）;鈣離子依賴性磷脂結合蛋白和碘化丙啶（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）。

1.2 非小細胞肺癌細胞培養(yǎng)

使用含體積分數(shù)0.10的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，將A549培養(yǎng)在37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中，待細胞達到80%融合時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞的分組及轉染

取A549采用含體積分數(shù)0.10胎牛血清并加入雙抗的BPMI 1640培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h。細胞隨機分組為：Blank組（a組，不轉染任何序列）、NC組（b組，轉染HDAC9陰性對照序列）、pcDNA-HDAC9組（c組，轉染HDAC9過表達載體）、si-HDAC9組（d組，轉染si-HDAC9）、si-HDAC9+rWnt3a組（e組，轉染沉默HDAC9同時加入Wnt信號通路激動劑rWnt3a刺激細胞）。將處于對數(shù)生長期的各組細胞接種于6孔板中，細胞生長至30%～50%融合時，按Lipofectamin 2000說明書轉染細胞。培養(yǎng)24～48 h后，進行后續(xù)實驗。

1.4 檢測指標及實驗方法

1.4.1 基因表達的qRT-PCR檢測 分別收集各組A549細胞培養(yǎng)48 h后，采用RNA提取試劑盒提取RNA。分別設計HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5和GAPDH引物，交由Takara公司合成。使用Prime Script RT試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，逆轉錄體系10 μL，參照說明書進行。取反應液進行熒光定量PCR，參照SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒說明書進行。在ABI PRISM 7300系統(tǒng)進行熒光定量PCR檢測。以GAPDH為內參，分別計算HDAC9、JNK、β-catenin和Wnt-5相對表達水平。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.4.2 蛋白表達的Western blot檢測 收集轉染48 h后A549，加蛋白裂解液，離心取上清液分裝備用。測定各樣品蛋白濃度，去離子水調整，確保上樣量一致。配制100 g/L SDS分離膠與濃縮膠。樣品與加樣緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min，冰浴、離心后進行電泳分離，再將蛋白轉移至硝酸纖維素膜上。50 g/L脫脂奶粉4 ℃封膜過夜。滴加一抗（兔抗鼠多克隆抗體HDAC9、JNK、β-catenin和Wnt-5）孵育過夜;PBS洗滌3次后滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，37 ℃振蕩孵育1 h。TBST 洗膜，辣根過氧化物酶ECL顯影，掃描記錄。利用Image J軟件對目的條帶進行灰度值分析。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.4.3 細胞增殖的CCK8檢測 將各組細胞分別接種于96孔板。待各組轉染24 h后，PBS液洗2次，2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。調整細胞密度（3 000～ 6 000個細胞），接種于96孔板中，重復6孔，置于培養(yǎng)箱，分別于培養(yǎng)24、48、72 和96 h時取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL的CCK8繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長處讀取各孔光密度（OD）值。以時間為橫坐標，OD值為縱坐標繪制細胞活力曲線圖。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.4.4 劃痕實驗檢測細胞遷移 取轉染24 h 各組細胞，將細胞接種于6孔板中，細胞生長完全融合后，用 10 μL槍頭在孔板中心軸處沿直線輕輕劃痕。培養(yǎng)24 h后在光學顯微鏡下觀察拍照，以細胞劃痕愈合百分比表示細胞遷移能力。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.4.5 Transwell實驗檢測細胞侵襲 轉染后48 h消化收集各組細胞，使用含體積分數(shù)0.01胎牛血清的DEME重懸細胞。取各組細胞懸液200 μL加入Transwell小室，下室加750 μL含體積分數(shù)0.10胎牛血清的DEME，置37 ℃孵箱內繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后取出小室，用甲醇固定30 min，再以1 g/L甲紫染色20 min，棉簽輕輕擦去上層未遷移細胞。在400倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野觀察細胞并計數(shù)。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.4.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞轉染后96 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化;使用4 ℃預冷PBS洗滌，棄上清液，結合緩沖液重懸細胞;移取100 μL細胞懸液于流式管內，加入鈣離子依賴性磷脂結合蛋白和1 g/L碘化丙啶各5 μL;室溫避光反應15 min;加入400 μL結合緩沖液，1 h內進行流式細胞術檢測。每組實驗重復3次，每次取3個樣本。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)用±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。處理因素個數(shù)≥2，每個因素水平數(shù)≥2，且因素間存在著交互影響時，采用析因方差分析;若方差齊使用Bonferroni方法進行多重比較;若方差不齊則使用近似F檢驗進行比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HDAC9基因沉默檢測

qRT-PCR和Western blot檢測結果顯示，與NC組細胞相比較，si-HDAC9組細胞的HDAC9 mRNA（0.99±0.05 vs. 0.43±0.04）和蛋白（1.01±0.06 vs. 0.59±0.04）表達水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（t=15.15、10.09，P<0.05）。

2.2 HDAC9基因沉默對Wnt信號通路影響

qRT-PCR和Western blot檢測HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5的mRNA和蛋白表達結果表明，各基因mRNA和蛋白表達組間差異有顯著性（FmRNA =66.590～155.800，P均<0.05;F蛋白=

83.110～159.400，P均<0.05）。Blank組和NC組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與NC組相比，pcDNA-HDAC9組各基因mRNA和蛋白表達水平均上升（tmRNA =5.125～15.990，P均<0.05;t蛋白=6.775～13.690，P均<0.05）;si-HDAC9組均明顯下降（tmRNA =3.966～13.930，P均<0.05;t蛋白=4.342～9.992，P均<0.05）;且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組各基因mRNA和蛋白表達水平水平逆轉，呈上升趨勢（tmRNA =15.390～16.800，P均<0.05;t蛋白=11.230～21.420，P均<0.05）。 見圖1。

2.3 HDAC9基因沉默對細胞增殖影響

CCK8檢測顯示，各組細胞增殖能力在0 h時無明顯差異（P>0.05）;在24～96 h細胞增殖能力組間差異有顯著性（F=9.070～66.850，P<0.05）。Blank組和NC組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與NC組相比，pcDNA-HDAC9組中細胞增殖速度在48～96 h均明顯加快（t=3.571～10.590，P均<0.05）;而si-HDAC9組在24～96 h顯著減慢（t=4.045～12.860，P均<0.05）;且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組細胞增殖速度在24～96 h逆轉，呈上升趨勢（t=2.921～3.807，P 均<0.05）。見圖2A。

2.4 HDAC9基因沉默對細胞遷移和侵襲影響

劃痕實驗和Transwell侵襲的研究結果顯示，細胞遷移和侵襲能力的組間差異有顯著意義（F=13.000、19.690，P均<0.05）。Blank組與NC組比較無明顯差異（P>0.05）;與NC組相比，pcDNA-HDAC9組中細胞遷移和侵襲能力顯著增強（t=2.933、3.728，P均<0.05）;而si-HDAC9組顯著減弱（t=3.437、5.116，P均<0.05）;且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組細胞遷移和侵襲能力逆轉，呈上升趨勢（t=3.984、4.032，P均<0.05）。見圖2B、C。

2.5 HDAC9基因沉默對細胞凋亡影響

流式細胞術檢測結果表明，Blank組、NC組、pcDNA-HDAC9組、si-HDAC9組和si-HDAC9+rWnt3a組的細胞凋亡率分別為（28.75±1.77）%、（30.24±1.68）%、（20.61±1.40）%、（41.20±2.32）%和（24.52±1.42）%，細胞凋亡組間比較差異有顯著性（F=58.990，P<0.05）。Blank組與NC組細胞凋亡率差異無顯著性（P>0.05）;與NC組相比較，pcDNA-HDAC9組中細胞凋亡顯著降低（t=7.627，P<0.05）;而si-HDAC9組細胞凋亡顯著升高（t=6.627，P<0.05）;且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組細胞凋亡逆轉，呈下降趨勢（t=10.620，P<0.05）。見圖3。

3 討論

肺癌死亡率居世界第1位[12-13]。我國肺癌死亡率亦呈逐年上升趨勢[14-15]。肺癌預后極差。究其原因在于腫瘤轉移率和復發(fā)率高，腫瘤細胞具有免疫逃逸、自我更新及再生等干細胞特性[16-17]。

HDACs是一類轉錄抑制因子[18]，可分為四大類，HDAC9隸屬于Ⅱ型中的Ⅱa型，參與分化和發(fā)育過程[19]。其在多數(shù)腫瘤中呈高表達[20-21]。此外，經(jīng)典Wnt信號通路主要通過3種途徑調節(jié)細胞行為并介導細胞間相互作用，如Wnt/β-catenin通路、Wnt/PcR通路以及Wnt/Ca2+途徑[22]，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[23-25]。非小細胞肺癌中常伴隨Wnt信號通路的激活[26]。本研究之初推測，通過小分子干擾RNA、抗Wnt信號通路相關因子表達或其他方法，可抑制Wnt信號通路激活，抑制下游相關蛋白表達，阻斷非小細胞肺癌的發(fā)展。本文基于這一推論，驗證HDAC9基因沉默介導Wnt信號通路對非小細胞肺癌細胞生物學特性的作用機制。

本文的研究結果顯示，HDAC9沉默序列能明

顯降低HDAC9基因的mRNA和蛋白表達，從而A為qRT-PCR檢測各組mRNA表達;B為Western blot檢測各組蛋白表達;C為各蛋白電泳條帶圖。a：Blank組，b：NC組，c：pcDNA-HDAC9組，d：si-HDAC9組，e：si-HDAC9+rWnt3a組。與Blank組和NC組比較，*P<0.05;與si-HDAC9組比較，#P<0.05。

圖1 各組細胞中HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5的mRNA及蛋白表達檢測沉默HDAC9基因。同時，pcDNA-HDAC9轉染細胞后HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5表達水平上升;而si-HDAC9轉染導致各因子表達水平下降。因此，相較于HDAC9表達上調對癌細胞Wnt信號通路

相關蛋白的表達的影響，HDAC9沉默表達可抑制Wnt信號通路的激活。另外，本文同時設立si-HDAC9+rWnt3a組，旨在支持沉默HDAC9表達對Wnt信號通路的激活的抑制作用。rWnt3a為Wnt信號通路的激動劑[27]，通過轉染si-HDAC9和rWnt3a，沉默HDAC9表達對JNK、β-catenin和Wnt-5表達的抑制作用逆轉，證實本文推測的合理性。同時，si-HDAC9轉染導致細胞生長受到抑制，細胞增殖、遷移和侵襲能力明顯降低，凋亡增加;且si-HDAC9+rWnt3a轉染可逆轉si-HDAC9轉染后的上述趨勢。因此，HDAC9基因沉默可以抑制Wnt信號通路的激活，從而參與對非小細胞肺癌細胞生物學特性的調節(jié)。

總之，本研究證實HDAC9沉默表達可通過抑制Wnt信號通路激活，抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移與侵襲并促進細胞凋亡，為非小細胞肺癌的靶向治療提供了潛在分子靶點。Wnt信號通路是一個復雜網(wǎng)絡體系，且與其他信號轉導途徑關聯(lián)密切[28-29]。非小細胞肺癌中是否還存在Wnt信號通路與其他途徑的相互作用尚未明確;HDAC9沉默表達是否可作為特異性靶基因，并介導非小細胞肺癌細胞耐藥，均有待于未來進一步探究。

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（本文編輯 于國藝）

[收稿日期]2019-11-19; [修訂日期]2020-05-08

[基金項目]國家自然科學基金面上項目（81572911）

[第一作者]侯欣（1982-），女，碩士，主治醫(yī)師。

[通信作者]段永建（1967-），男，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導師。E-mail：dyj9062@163.com。